封肖穎, 荀一萍, 薛玉玲, 楊婉秋, 袁慶彬, 王世杰,2

（1.君樂(lè)寶乳業(yè)集團(tuán)有限公司, 石家莊 050221；2.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院, 石家莊 050018）

0 引言

世界衛(wèi)生組織建議嬰兒自出生至6個(gè)月內(nèi)采用純母乳喂養(yǎng)[1]。母乳作為嬰幼兒最理想的天然食物, 含有多種營(yíng)養(yǎng)成分, 可以滿(mǎn)足嬰幼兒正常的生長(zhǎng)發(fā)育。母乳低聚糖在母乳中含量十分豐富, 僅次于乳糖和脂肪, 具有維持腸道微生態(tài)平衡、抑制腸道病原微生物感染、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育等多種重要的生理作用[2-5]。目前國(guó)外已批準(zhǔn)部分HMOs在嬰幼兒配方食品中使用, 但我國(guó)尚未允許。國(guó)內(nèi)嬰幼兒配方食品常添加具有與某些HMO相似的功能性作用的不可消化的碳水化合物如低聚半乳糖（galactooligosaccharides, GOS）、低聚果糖（fructooligosaccharides, FOS）、聚葡萄糖等。然而, 這些碳水化合物無(wú)法代替HMOs的所有功能[6]。我國(guó)的母乳喂養(yǎng)率較低, 不同喂養(yǎng)方式嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育也存在一定的差異[7-8], 與純母乳喂養(yǎng)的嬰兒相比, 配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒更容易患上傳染性疾病, 如胃腸炎和急性中耳炎, 以及免疫介導(dǎo)性疾病, 如過(guò)敏等[9]。因此, 母乳化原料在嬰幼兒配方奶粉中的使用尤為關(guān)鍵。母乳低聚糖在嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有著十分重要的作用, 本文對(duì)HMOs的組成、結(jié)構(gòu)進(jìn)行介紹, 總結(jié)了添加母乳低聚糖的配方奶粉對(duì)嬰幼兒健康影響的臨床研究, 介紹了HMOs的合成和應(yīng)用現(xiàn)狀, 為新一代嬰幼兒配方粉的設(shè)計(jì)提供思路和參考。

1 母乳低聚糖的組成和結(jié)構(gòu)

HMOs是人類(lèi)特有的一類(lèi)未結(jié)合的、多功能的、不可消化的、結(jié)構(gòu)多樣的低聚糖[10]。HMOs約占母乳總碳水化合物含量的20%, 是僅次于乳糖和脂肪的第三大固體成分。HMOs在初乳中含量可達(dá)20～25 g/L, 并隨著泌乳期的延長(zhǎng)逐漸減少, 在成熟乳中含量約5～15 g/L[11]。與其他任何哺乳動(dòng)物乳汁中的不同, 母乳中低聚糖的含量極高, 約為牛乳的1 000倍[12]。HMOs的含量以及多樣性因母體遺傳而異, 不同女性乳汁中HMOs的組成差異很大[13]。FUT2（Se）基因和FUT3（Le）基因均在母親的乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá), 在HMOs巖藻糖基化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。FUT2（Se）基因的編碼產(chǎn)物是α-1,2-L-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶[15], Se的酶主要在Ⅰ型糖鏈上合成H抗原。Ⅰ型糖鏈主要存在于分泌液中, 所以Se基因和產(chǎn)物決定了分泌與非分泌型[16]。FUT3（Le）基因的編碼產(chǎn)物是α-（1,3/4）巖藻糖轉(zhuǎn)移酶[17], 負(fù)責(zé)在Le前體（Lec）上合成Lea抗原或Leb抗原。如果是分泌型就合成Leb, 如果是非分泌型就合成Lea。根據(jù)FUT2和FUT3在乳腺組織中的表達(dá)方式, 可將母乳分為4類(lèi)：Se+Le+, Se-Le+, Se+Le-, Se-Le-[18], 見(jiàn)表1。除了遺傳因素外, 其他母體因素（如年齡、飲食或泌乳期）也會(huì)導(dǎo)致HMOs含量的不同[19-21]。

表1 Se和Le基因介導(dǎo)的不同母乳類(lèi)型[18]

目前, 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了200多種HMOs[23], 其中超過(guò)100多種的HMOs的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被闡明[24-26], HMOs基本化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。HMOs有5種基本的單糖組成, 分別是D-葡萄糖（Glucose, Glu）、D-半乳糖（Galactose, Gal）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-Acetylglucosamine, GlcNAc）、L-巖藻糖（Fucose, Fuc）和唾液酸（Sialic acid, Sia）[27]。所有的這些單糖通過(guò)不同的糖苷鍵與乳糖進(jìn)行連接, 從而形成HMOs的不同結(jié)構(gòu)。這些連接方式主要分為3種：（1）與α1-2、α1-3或α1-4連接的巖藻糖基；（2）乳糖-N-二糖和N-乙酰基乳糖胺單元（通過(guò)β1-3和β1-6鍵）進(jìn)一步延長(zhǎng)；（3）和/或通過(guò)α2-3或α2-6鍵連接在末端位置的唾液酸殘基[28]。因此, 對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)也分為3類(lèi), 巖藻糖基化低聚糖（35%～50%）、非巖藻糖基中性低聚糖（42%～55%）和唾液酸化低聚糖（12%～14%）[29]。部分HMOs按結(jié)構(gòu)分類(lèi)示例見(jiàn)表2。

圖1 HMOs的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)組成[22]

表2 HMOs按結(jié)構(gòu)分類(lèi)示例表

2 母乳低聚糖對(duì)嬰幼兒的健康影響

母乳低聚糖對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育有著多種功能, 如抗病毒感染[30]、調(diào)節(jié)腸道菌群[31]、改善認(rèn)知[32]等。但這些結(jié)果往往來(lái)自體外、動(dòng)物或者母嬰群組的關(guān)聯(lián)研究, 需要更多的臨床證據(jù)來(lái)揭示HMOs對(duì)嬰幼兒的健康影響, 因此, 本文對(duì)添加HMOs的嬰幼兒配方奶粉的臨床研究主要結(jié)果進(jìn)行匯總, 添加HMOs的嬰幼兒配方奶粉安全性、耐受性良好, 在嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育方面更貼近母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒, 且對(duì)免疫、腸道等方面有一定的積極影響。

2.1 生長(zhǎng)發(fā)育

Marriage等[33]開(kāi)展了一項(xiàng)在健康足月嬰兒中進(jìn)行的前瞻性、隨機(jī)、對(duì)照、生長(zhǎng)和耐受性研究。研究共納入420名出生5天新生兒。試驗(yàn)分為4組, 母乳組采用純母乳喂養(yǎng), 對(duì)照組服用未添加HMOs的配方奶粉, 實(shí)驗(yàn)組1服用添加0.2 g/L 2’-FL的配方奶粉, 實(shí)驗(yàn)組2服用添加1.0 g/L 2'-FL的配方奶粉, 3組配方奶粉總寡糖含量均為2.4 g/L。結(jié)果顯示, 各組之間在體重、身長(zhǎng)和頭圍方面不存在顯著性差異。通過(guò)大便次數(shù), 大便稠度以及與進(jìn)食相關(guān)的嘔吐的發(fā)生率等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià), 3組配方奶粉均顯示出良好的耐受性。進(jìn)一步對(duì)血液中2'-FL的水平進(jìn)行測(cè)定, 母乳組含量最高, 其次是實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組1, 對(duì)照組未檢測(cè)到2'-FL。且母乳組與實(shí)驗(yàn)組2'-FL相對(duì)吸收和排泄沒(méi)有顯著性差異。研究過(guò)程中的不良事件均由父母報(bào)告且經(jīng)醫(yī)生證實(shí)。對(duì)照組濕疹發(fā)生率明顯高于兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組。

Kajzer等[34]開(kāi)展了一項(xiàng)前瞻性、隨機(jī)、多中心、雙盲、對(duì)照、耐受性試驗(yàn)。試驗(yàn)納入131名健康足月嬰兒, 分為3組, 對(duì)照組服用不添加低聚糖的配方奶粉, 實(shí)驗(yàn)組服用0.2 g/L 2'-FL和2 g/L scFOS的配方奶粉, 母乳組進(jìn)行純母乳喂養(yǎng)。結(jié)果顯示, 含有2'-FL和scFOS的配方奶粉安全且耐受良好。3組嬰兒在35日齡時(shí)的糞便稠度、配方奶粉攝入量、人體測(cè)量學(xué)指標(biāo)、與進(jìn)食相關(guān)的嘔吐等方面均不存在顯著性差異。母乳組嬰兒每天的糞便量比配方奶粉組更大。

Berseth等[35]開(kāi)展了一項(xiàng)前瞻性、多中心、單臂研究。試驗(yàn)納入59名健康的非常挑剔的足月嬰兒。非常挑剔指由父母判斷寶寶存在嚴(yán)重的煩躁和脹氣的現(xiàn)象。試驗(yàn)周期28 d。結(jié)果顯示, 含有2'-FL的配方食品安全且耐受性良好。父母報(bào)告說(shuō), 在改用含2'-FL的配方奶粉1 d后, 挑剔的嬰兒的煩躁, 不安, 哭泣的小時(shí)數(shù)和嘔吐的次數(shù)降低了, 在整個(gè)28 d的研究中一直保持這種狀態(tài)。

Ramirez-Farias等[36]開(kāi)展了一項(xiàng)前瞻性、單臂、非隨機(jī)、多中心研究。試驗(yàn)納入48名年齡小于60 d、既往病史和臨床癥狀導(dǎo)致其服用低致敏性深度水解配方奶粉的嬰兒。試驗(yàn)周期60 d。結(jié)果顯示, 嬰兒年齡的體重z得分有顯著性的改善（60 d變化的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, 0.32±0.11, P=0.0078）。添加2'-FL的研究配方在受試人群中具有良好的安全性、耐受性。

2.2 免疫?

HMOs可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生, 可能介導(dǎo)Th1/Th2反應(yīng)更平衡, 此外, 還可以減少免疫系統(tǒng)中選擇素介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用, 減少白細(xì)胞在活化的內(nèi)皮細(xì)胞上滾動(dòng), 可能導(dǎo)致黏膜白細(xì)胞浸潤(rùn)和活化減少, 從而發(fā)揮免疫作用[6]。

Goehring等[37]開(kāi)展了一項(xiàng)前瞻性、隨機(jī)、對(duì)照、生長(zhǎng)和耐受性研究。試驗(yàn)納入210名健康足月嬰兒, 分組情況與Marriage等[33]研究相同。在6周齡時(shí), 采集受試者血液樣本, 進(jìn)行10種細(xì)胞因子的檢測(cè)。結(jié)果顯示, 對(duì)照組受試者血液白細(xì)胞介素IL-1ra、IL-1α、IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子TNF-α濃度顯著高于母乳組和2'-FL的配方奶粉組。2'-FL的配方奶粉組嬰兒10種炎癥因子與母乳喂養(yǎng)的嬰兒沒(méi)有顯著性差異。此外, 研究者從嬰兒血液中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMCs）進(jìn)行細(xì)胞表型分析。在體外用呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）刺激PBMCs后, 研究TNF-α和IL-6水平的變化, 這兩種細(xì)胞因子的表達(dá)可能與RSV感染的嚴(yán)重程度相關(guān)。結(jié)果顯示, 添加0.2 g/L 2'-FL配方奶粉組TNF-α和IL-6水平與母乳喂養(yǎng)組水平相近, 顯著低于對(duì)照組。添加1.0 g/L 2'-FL的配方奶粉組與其他3組均無(wú)差異。

Puccio等[38]開(kāi)展了一項(xiàng)多中心, 隨機(jī), 雙盲試驗(yàn)。試驗(yàn)納入175名≤14 d日齡的健康足月嬰兒, 分為兩組, 實(shí)驗(yàn)組服用添加1.0 g/L 2'-FL和0.5 g/L LNnT配方奶粉, 對(duì)照組服用未添加HMOs的配方奶粉直至6月齡, 后續(xù)兩組均服用未添加HMOs的2段配方奶粉至12月齡, 在嬰兒1、2、3、4、6和12月齡時(shí)進(jìn)行隨訪(fǎng)。結(jié)果顯示, 與對(duì)照組相比, 在2個(gè)月時(shí)實(shí)驗(yàn)組受試者的大便更軟（P=0.021）, 夜間醒來(lái)次數(shù)較少（P=0.036）。并且發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組嬰兒呼吸道相關(guān)疾病的發(fā)病率較低, 發(fā)病率即為本組父母報(bào)告的發(fā)病人數(shù)/本組總?cè)藬?shù), 包括以下幾個(gè)方面：支氣管炎發(fā)生率顯著較低（P=0.004-0.047）, 分別為0～4個(gè)月時(shí)實(shí)驗(yàn)組2.3%和對(duì)照組12.6%, 0～6個(gè)月時(shí)實(shí)驗(yàn)組6.8%和對(duì)照組21.8%以及0～12個(gè)月時(shí)實(shí)驗(yàn)組10.2%和對(duì)照組27.6%；0～12月下呼吸道感染發(fā)生率降低（實(shí)驗(yàn)組19.3% vs對(duì)照組34.5%）；0～4個(gè)月使用退燒藥次數(shù)下降（實(shí)驗(yàn)組15.9%vs對(duì)照組29.9%）；0～6個(gè)月（實(shí)驗(yàn)組34.1% vs對(duì)照組49.4%）和0～12個(gè)月（實(shí)驗(yàn)組42.0% vs對(duì)照組60.9%）使用抗生素次數(shù)下降。

此外, 體外研究表明, HMOs可以通過(guò)減少抗原抗體復(fù)合物誘導(dǎo)的趨化因子釋放, 調(diào)節(jié)與過(guò)敏性疾病相關(guān)的人類(lèi)上皮細(xì)胞反應(yīng)[39]。Castillo-Courtade等[40]研究了口服2'-FL和6'-SL對(duì)卵清蛋白（ovalbumin, OVA）誘導(dǎo)的致敏小鼠過(guò)敏癥狀的影響。2'-FL和6'-SL通過(guò)誘導(dǎo)IL-10+T調(diào)節(jié)細(xì)胞和間接穩(wěn)定肥大細(xì)胞來(lái)減輕食物過(guò)敏的癥狀。因此, HMOs可能對(duì)過(guò)敏性疾病有治療潛力。Nowak-Wegrzyn等[41]通過(guò)人群試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。試驗(yàn)研究了2'-FL和LNnT對(duì)牛乳蛋白過(guò)敏癥（cow's milk protein allergy, CMPA）嬰幼兒的影響。共納入82名患有CMPA的嬰幼兒, 分為兩組, 對(duì)照組服用廣泛水解乳清配方粉, 實(shí)驗(yàn)組服用添加1.0 g/L 2'-FL和0.5 g/L LNnT的廣泛水解乳清配方粉。結(jié)果顯示, 2'-FL和LNnT對(duì)患有CMPA的嬰幼兒耐受性良好, 可推薦用于治療嬰幼兒CMPA。

2.3 腸道

HMOs可以改善嬰幼兒的排便情況。Parschat等[42]進(jìn)行了一次多中心、隨機(jī)、對(duì)照、平行的臨床研究, 評(píng)估含有5種HMO的配方對(duì)健康嬰兒的安全性、耐受性以及生長(zhǎng)發(fā)育的影響。實(shí)驗(yàn)納入341名年齡≤14 d的受試者, 實(shí)驗(yàn)分為3組, 對(duì)照組喂養(yǎng)不添加HMOs的配方奶粉（n=112）, 實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)含5種HMOs的配方奶粉（HMOs總含量5.75 g/L, 其中52% 2’-FL,13%3-FL,26% LNT,4% 3’-SL,5% 6’-SL；n=113）, 母乳組進(jìn)行純母乳喂養(yǎng)（n=116）, 試驗(yàn)周期4個(gè)月。配方奶粉組在體重、身高或頭圍方面沒(méi)有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)組胃腸道耐受性較好, 且與對(duì)照組相比, 實(shí)驗(yàn)組和母乳喂養(yǎng)嬰兒的糞便更軟, 在4個(gè)月時(shí), 實(shí)驗(yàn)組和母乳喂養(yǎng)組受試者排便次數(shù)更高（P=0.0428和P=0.0136）。

HMOs可以調(diào)節(jié)生命早期腸道菌群, 使其更貼近母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒, 為嬰兒提供健康益處。Berger等[43]通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序分析了添加2'-FL和LNnT對(duì)嬰兒腸道菌群的影響。試驗(yàn)分為3組, 對(duì)照組服用未添加HMOs的配方奶粉, 實(shí)驗(yàn)組服用添加1.0 g/L 2'-FL和0.5 g/L LNnT的配方奶粉, 母乳組采用純母乳喂養(yǎng)。研究將嬰兒3個(gè)月和12個(gè)月的腸道菌群分析結(jié)果分為7種糞便群落類(lèi)型。3個(gè)月時(shí), 3組的菌群在屬水平上具有顯著差異；與對(duì)照組相比, 實(shí)驗(yàn)組的菌群組成更接近于母乳組。順產(chǎn)和剖腹產(chǎn)嬰兒中, 實(shí)驗(yàn)組與母乳組之間的菌群差異無(wú)顯著性；然而分娩方式對(duì)對(duì)照組的菌群有明顯影響, 表明HMOs補(bǔ)充對(duì)剖腹產(chǎn)嬰兒更有效應(yīng), 使其更貼近順產(chǎn)嬰兒。12個(gè)月時(shí), 兩種配方奶粉組的菌群組成無(wú)顯著差異。

3 母乳低聚糖的合成及應(yīng)用

HMOs的生產(chǎn)技術(shù)大致可以分為3類(lèi)：天然提取, 化學(xué)合成和生物合成[44]。早期HMOs是從母乳中提取出來(lái)的, 該方法可以保留HMOs的天然結(jié)構(gòu)不被破壞, 但由于缺乏足夠的捐贈(zèng)母乳, 無(wú)法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。此外, 牛羊乳中也存在低聚糖, 但成分及含量與母乳相差甚遠(yuǎn), 產(chǎn)量低且成本極高?；瘜W(xué)合成方法能夠合成我們所需要的特定結(jié)構(gòu)的HMOs, 特別是在合成結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分支多的HMOs時(shí)具有優(yōu)越性。但是, HMOs的化學(xué)合成過(guò)程存在許多問(wèn)題, 如糖苷鍵形成的立體和區(qū)域選擇性控制的不準(zhǔn)確, 多個(gè)活化、保護(hù)和脫保護(hù)步驟的復(fù)雜性使工業(yè)化生產(chǎn)具有諸多挑戰(zhàn), 同時(shí), HMOs得率低, 生產(chǎn)成本高[45]。

生物合成主要是通過(guò)酶法或微生物合成的方法產(chǎn)生, 具有生產(chǎn)成本低、環(huán)境污染小等優(yōu)勢(shì), 但同樣也面臨安全性的顧慮和法規(guī)的限制。酶法可以增加化學(xué)合成的結(jié)構(gòu)多樣性, 但獲得在體外仍然具有高效的酶是困難的, 在體外反應(yīng)中還會(huì)受到酶本身性質(zhì)的限制[46]。近年來(lái), 微生物合成法逐漸成為HMOs商業(yè)化生產(chǎn)的主要方式[47-48], 實(shí)現(xiàn)了HMOs的大規(guī)模生產(chǎn)。微生物合成法往往通過(guò)利用其自身或分子生物學(xué)技術(shù)在宿主菌株中引入必要的代謝基因, 如乳糖滲透酶和合適的糖基轉(zhuǎn)移酶, 并去除不利的代謝基因, 如影響轉(zhuǎn)基因生物合成前體的結(jié)腸酸代謝途徑, 從而代謝產(chǎn)生HMOs。利用全細(xì)胞反應(yīng)增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性且有時(shí)會(huì)存在某些副反應(yīng)消耗底物或產(chǎn)物, 從而影響HMOs的產(chǎn)率。同時(shí)從細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)以及細(xì)菌培養(yǎng)物中進(jìn)行產(chǎn)物分離要比從體外酶反應(yīng)體系中分離復(fù)雜得多[49]。目前常用的宿主菌株包括大腸桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒狀桿菌, 見(jiàn)表3。其中, 大腸桿菌因其引入DNA分子有效性強(qiáng)、表達(dá)水平高和生長(zhǎng)快速等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)HMOs[50]。

表3 微生物合成法生產(chǎn)HMOs

雖然這些合成的HMOs與天然結(jié)構(gòu)相同, 但這些成分的引入仍需得到世界上不同管理部門(mén)的評(píng)估和批準(zhǔn)[60]。2015年, Glycom A/S通過(guò)化學(xué)合成法生產(chǎn)的2'-FL和LNnT首次獲得美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration, FDA）的GRAS認(rèn)證。隨著監(jiān)管和法規(guī)進(jìn)程的推進(jìn), 目前已有來(lái)自不同制造商的7種HMOs通過(guò)了GRAS認(rèn)證, 見(jiàn)表4, 可以預(yù)計(jì)未來(lái)會(huì)有越來(lái)越多的HMOs通過(guò)監(jiān)管許可, HMOs市場(chǎng)也會(huì)越來(lái)越大。目前, 雅培、雀巢、惠氏等外資品牌也相繼推出了添加HMO的產(chǎn)品。且除了嬰幼兒產(chǎn)品外, 一些成人產(chǎn)品也開(kāi)始添加HMO。

表4 美國(guó)FDA GRAS認(rèn)證的HMOs

（續(xù)表4）

4 展望

隨著生物技術(shù)的發(fā)展, 越來(lái)越多的HMOs實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化的生產(chǎn)。目前, 我國(guó)尚未批準(zhǔn)HMOs在嬰幼兒配方食品中的使用, 但在美國(guó)、歐洲等國(guó)家, HMOs已經(jīng)被批準(zhǔn)在嬰幼兒食品中進(jìn)行添加, 并且通過(guò)一系列的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證, 這些添加HMOs的奶粉在安全性、耐受性、增強(qiáng)免疫、抗感染、緩解過(guò)敏、促進(jìn)腸道健康等諸多方面也表現(xiàn)出有益效果。因此, HMOs有著良好的應(yīng)用前景。但HMOs種類(lèi)多樣, 不同的國(guó)家人群、基因型等都對(duì)其含量存在影響, 并且僅在配方奶粉中引入一個(gè)或更多個(gè)HMOs不足以完全模擬與母乳成分的復(fù)雜性相關(guān)的所有有益效果, 因此, 仍需要大量、深度的研究, 尤其是對(duì)中國(guó)人群母乳中獨(dú)特的HMOs含量以及臨床等研究, 為嬰幼兒配方食品的母乳化提供科學(xué)、合理的證據(jù)。