周冰洋, 呂嘉櫪, 吳定燕, 張明新, 巨瑞, 王維波, 賈瑋, 魯曦

（陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 西安 710000）

0 引言

色氨酸是人體必需的氨基酸。膳食在生物體內(nèi)僅有5%左右的色氨酸會(huì)被吸收利用[1], 相當(dāng)比例未被吸收的色氨酸會(huì)被腸道微生物利用產(chǎn)生多種吲哚衍生物[2-5], 發(fā)揮調(diào)節(jié)宿主免疫、改變與宿主相互作用的功能[6]。羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri, L.reuteri）作為一種益生菌, 廣泛存在于哺乳動(dòng)物的腸道中, 能夠抑制腸道病原菌生長(zhǎng), 改善宿主腸道微環(huán)境[7]。

目前對(duì)吲哚衍生物檢測(cè)方法的研究主要集中于植物來(lái)源[8]和細(xì)胞來(lái)源[9-10], 且目前檢測(cè)吲哚衍生物的方法對(duì)樣品前處理要求嚴(yán)格。微生物培養(yǎng)基成分復(fù)雜, 干擾物質(zhì)較多且益生菌源吲哚衍生物產(chǎn)量較低。而UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS將高選擇性的四極桿與軌道離子阱高分辨準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測(cè)量技術(shù)有機(jī)結(jié)合[11-12], 具有樣品前處理凈化能力要求低、高效、方便等優(yōu)點(diǎn)[13]。

建立益生菌源吲哚衍生物定量方法, 不僅有助于益生菌菌株篩選, 也為進(jìn)一步深入研究吲哚衍生物的生理功能和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)[10,14-16]。本研究基于UPLC-Q-Orbitrap MS/MS, 建立能夠同時(shí)檢測(cè)益生菌（L.reuteri）培養(yǎng)上清液中吲哚-3-乳酸（ILA）、吲哚-3-乙酸（IAA）和吲哚-3-丁酸（IBA）的技術(shù)方法, 并對(duì)7株L.reuteri的吲哚衍生物表達(dá)量進(jìn)行定量篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS肉湯培養(yǎng)基, 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；M9培養(yǎng)基, 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；色氨酸和吲哚-3-乳酸（純度≥99%）, 上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水硫酸鈉, 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；PBS, 中暉赫彩；吲哚-3-乙酸（純度≥99%）, MYM生物技術(shù)公司；吲哚-3-丁酸（純度≥99%）, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；乙酸乙酯、甲醇、乙腈、醋酸銨（均為色譜純）, 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Q-Exactive超高效液相色譜—四極桿—靜電場(chǎng)軌道離子阱串聯(lián)質(zhì)譜, 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；配備Syringe自動(dòng)取樣器系統(tǒng)、電噴霧離子源；HC-3018R高速冷凍離心機(jī), 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；VORTEX Genius 3型渦旋振蕩器, 德國(guó)IKA公司；分析天平, 德國(guó)Sartorius BSA224S；DH-360恒溫培養(yǎng)箱, 北京科偉永興儀器有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀, 上海亞榮生化儀器廠；Milli-Q Integral型純水儀, 美國(guó)Millipore公司。

1.3 菌株

羅伊氏乳桿菌：L.reuteri GH211-4、L.reuteri GH319-13、L.reuteri GH812-16、L.reuteri GH812-17、L.reuteri GH329-22、L.reuteri DSM 17938和L.reuteri GH226-12均由陜西科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用甲醇配制吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸的1 mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品母液, 置于-20℃冰箱中保存。取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液, 用改良M9培養(yǎng)基, 即M9培養(yǎng)基+0.6μmol/L色氨酸, 稀釋成1000、500、100、20、4 ng/mL工作液。

1.4.2 色譜條件

色譜柱為Hypersil Gold C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.7μm）, 流動(dòng)相A為10 mmol/L醋酸銨水, B為10 mmol/L醋酸銨和乙腈；進(jìn)樣體積為5μL, 流速為300μL/min, 柱溫為30℃, 梯度洗脫程序如表1所示。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.4.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源, 質(zhì)量分析器為Orbitrap, 掃描模式采用正離子掃描模式, 數(shù)據(jù)依賴(lài)性掃描Full MSdd MS2, 噴霧電壓3.5 kV。電噴霧電離源(ESI)參數(shù)為：鞘氣體流量為40 arb；輔助氣體流量為-10 arb；毛細(xì)管溫度為320℃；全掃描和二級(jí)掃描分辨率分別為70 000和17 500；質(zhì)量采集范圍為m/z 100～1 500, 3種吲哚衍生物的具體質(zhì)譜信息如表2所示。

表2 3種吲哚衍生物的質(zhì)譜信息

1.4.4 L.reuteri發(fā)酵上清中吲哚衍生物的檢測(cè)

1.4.4.1 L.reuteri發(fā)酵上清液的培養(yǎng)

用一次性無(wú)菌接種環(huán)分別從MRS瓊脂平板上挑取單個(gè)L.reuteri菌落接種到5 mL新鮮MRS肉湯培養(yǎng)基中, 37℃過(guò)夜厭氧培養(yǎng), 將活化的L.reuteri菌液搖勻, 按1 %的接種量接種到5 mL MRS肉湯培養(yǎng)基37℃, 厭氧培養(yǎng)12 h后, 12 000 rpm離心5 min收集菌體, 用PBS洗滌菌體沉淀, 12 000 rpm離心5 min棄上清。將收集到的7株L.reuteri菌體沉淀2份分別添加到7管5 mL新鮮M9培養(yǎng)基和改良M9培養(yǎng)基（+0.6μmol/L色氨酸）中培養(yǎng)48 h, 12 000 rpm離心5 min取上清液待用。

1.4.4.2樣品前處理

取L.reuteri發(fā)酵上清液5 mL, 加200μL的甲醇, 搖勻, 用PBS緩沖液調(diào)節(jié)pH至6-7。加入2.5 mL乙酸乙酯萃取, 劇烈震蕩30 s, 靜置3 min, 重復(fù)3次。收集乙酸乙酯層液體于15 mL離心管中, 加入少量無(wú)水硫酸鈉干燥5 min, 氮?dú)獬卮蹈? 用150μL甲醇復(fù)溶后上機(jī)檢測(cè)。

1.4.4.3基于3種吲哚衍生物產(chǎn)量篩選L.reuteri

將所選7株L.reuteri分別在M9和改良M9培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng), 經(jīng)1.4.4.2前處理后上機(jī)檢測(cè), 利用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定樣品與標(biāo)準(zhǔn)品相同質(zhì)荷比和保留時(shí)間的峰面積, 根據(jù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中3種吲哚衍生物的含量。基于3種吲哚衍生物的含量篩選出產(chǎn)量最高的L.reuteri。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

將吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品1 000、500、100、20、4 ng/mL 5個(gè)工作液經(jīng)1.4.4.2樣品前處理后, 按照1.4中的色譜和質(zhì)譜條件上機(jī)檢測(cè), 待測(cè)混合標(biāo)準(zhǔn)品中3個(gè)吲哚衍生物都可以有效分離。以縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積、橫坐標(biāo)為濃度（ng/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得到吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸的擬合線性方程。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 3種吲哚衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好, 相關(guān)系數(shù)R2＞0.99（圖1～3、表3）。

圖1 吲哚-3-乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 吲哚-3-乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 吲哚-3-丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.2 方法檢出限及定量限

本研究方法以信噪比（S/N）≥3的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為檢出限（Limits of detection,, LOD）, 以信噪比（S/N）≥10的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為定量限（Limits of quantitation, LOQ）。吲哚-3-丁酸的檢出限和定量限最低分別為1.0和3.2 ng/mL, 其次是吲哚-3-乙酸分別是2.2和7.2 ng/mL, 吲哚-3-乳酸的檢出限和定量限分別是2.4和8.0 ng/mL, 如表4所示。

表4 3種吲哚衍生物的檢出限和定量限

2.3 方法準(zhǔn)確度及精密度

在改良M9培養(yǎng)基中分別添加終濃度為500、100、20 ng/mL的吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液, 每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。將改良M9培養(yǎng)基及加標(biāo)培養(yǎng)基, 按1.4.4.2前處理方法處理之后上機(jī)檢測(cè)。如表5所示, 該方法測(cè)量回收率在90%～110%之間, 且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜5%, 數(shù)據(jù)表明測(cè)量方法精確度良好。

表5 改良M9培養(yǎng)基加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 樣品測(cè)定

將L.reuteri GH211-4、L.reuteri GH319-13、L.reuteri GH812-16、L.reuteri GH812-17、L.reuteri GH329-22、L.reuteri DSM 17938、L.reuteri GH224-12等7株羅伊氏乳桿菌, 按照1.4.4方法制備L.reuteri發(fā)酵上清液, 對(duì)L.reuteri發(fā)酵上清液中吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸3種吲哚衍生物的含量進(jìn)行測(cè)定。色譜圖如圖4～6所示：其中吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸的特征性碎片離子分別為m/z 206.0811［M+H］+、m/z 176.0706［M+H］+和m/z 204.1019［M+H］+。由特征性碎片離子峰面積定量得出的吲哚衍生物分析結(jié)果如表6所示。由表6可以看出, L.reuteri對(duì)色氨酸的代謝能力存在菌株差異, 而且外源色氨酸的添加可以顯著增加L.reuteri發(fā)酵上清液中3種吲哚衍生物的含量。L.reuteri能夠代謝色氨酸產(chǎn)生吲哚-3-乳酸, 這與Cervantes-Barragan等人[17]的研究結(jié)果一致, 而在培養(yǎng)基中外源添加色氨酸可以增加吲哚-3-乙酸等吲哚衍生物的產(chǎn)量, 與劉悅[10]等人的研究結(jié)果相一致。

表6 不同L.reuteri菌株經(jīng)過(guò)M9培養(yǎng)基是否外源添加色氨酸培養(yǎng)48 h后, 發(fā)酵上清液中吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸的含量

圖5 UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS分析L.reuteri GH226-12發(fā)酵上清液和吲哚-3-乙酸標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果

圖6 UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS分析L.reuteri GH226-12發(fā)酵上清液和吲哚-3-丁酸標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果

2.5 基于3種吲哚衍生物的產(chǎn)量L.reuteri菌株的篩選

根據(jù)表6結(jié)果顯示, 在外源添加0.6μmol/L色氨酸后, 各株菌株吲哚衍生物產(chǎn)量都發(fā)生顯著提高, 其中GH226-12號(hào)樣品中3種吲哚衍生物濃度均顯著高于其它組, 其中吲哚-3-乳酸濃度為241.12±2.19 ng/mL、吲哚-3-乙酸為109.66±1.14 ng/mL、吲哚-3-丁酸為14.91±1.32 ng/mL。以上數(shù)據(jù)提示, GH226-12號(hào)菌株為此次備選的7株L.reuteri中3種吲哚衍生物產(chǎn)量最高的一株。L.reuteri作為人體腸道中廣泛存在的一種益生菌, 產(chǎn)生的吲哚衍生物具有抗炎作用[18]、調(diào)節(jié)宿主免疫、改善腸上皮屏障等多種益生功能。因此, 篩選出得到的吲哚衍生物產(chǎn)量高的L.reuteri可作為一種潛在的食物干預(yù)手段為炎癥性腸病的治療提供新思路。

3 結(jié)論

由于微生物培養(yǎng)基成分復(fù)雜, 干擾物質(zhì)較多且吲哚衍生物產(chǎn)量較低, 如Cervantes-Barragan等人的研究采用1 L的益生菌發(fā)酵上清液來(lái)濃縮檢測(cè)[16], 而本研究建立的樣品前處理方法只需要5 mL上清液。上清液經(jīng)簡(jiǎn)單的離心處理, 然后用乙酸乙酯萃取、濃縮, 即可用于UHPLC-Q-Orbitrap MS/MS檢測(cè)。因此, 所建立的方法具有樣品用量少, 操作流程方便、快捷的優(yōu)點(diǎn)。其次, 該方法回收率高, 精確度高、重現(xiàn)性好。而基于超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù), 成功建立了益生菌發(fā)酵上清液中吲哚-3-乳酸、吲哚-3-乙酸和吲哚-3-丁酸3種吲哚衍生物的檢測(cè)方法。該方法R2＞0.99、線性范圍4～1 000 ng/mL、回收率在90%～110%之間, 且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%以內(nèi)；利用該方法, 成功篩選出1株高產(chǎn)吲哚衍生物的羅伊氏乳桿菌, 為吲哚衍生物益生功能的研究和益生菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。