劉杰, 魏祥飛, 曲波, 王春梅, 姜毓君, 張莉

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室, 哈爾濱 150030）

0 引言

MicroRNA是一類能夠參與基因表達、細胞周期、疾病發(fā)生等生物過程的短鏈非編碼RNA分子, 廣泛存在于動植物體內(nèi)[1]。MicroRNA在不同的生理條件下通過與靶基因mRNA的3’UTR互補配對, 從而抑制基因的表達, 調(diào)控細胞生理過程[2]。在奶牛乳腺中, microRNA被發(fā)現(xiàn)具有重要的調(diào)節(jié)作用, 其已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)參與乳腺發(fā)育、泌乳周期發(fā)展、乳成分合成等過程[3-5]。此外, 研究發(fā)現(xiàn)在不同健康狀態(tài)的奶牛乳腺中microRNA的表達不同, 這被認為可能是奶牛健康狀態(tài)的潛在標志[6-7]。MiR-214定位于奶牛的第16條染色體, 其對骨骼發(fā)育、細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等蛋白表達的作用已經(jīng)有相關(guān)報道[8-10]。Sang等[11-13]發(fā)現(xiàn)miR-214可以激活AKT/mTOR信號通路, 而該通路的激活是乳成分合成過程中的關(guān)鍵, 表明miR-214有可能會影響泌乳過程。但是, miR-214是否可以影響奶牛泌乳還沒有研究報道。在前期的實驗中我們發(fā)現(xiàn)miR-214在高產(chǎn)和低產(chǎn)奶牛的乳腺組織中的表達存在顯著差異, 高產(chǎn)奶牛乳腺組織中miR-214的表達較低, 而低產(chǎn)奶牛乳腺組織中miR-214處于高表達狀態(tài)。為了探究miR-214對奶牛泌乳的影響, 本實驗通過構(gòu)建奶牛乳腺上皮細胞模型, 在奶牛乳腺上皮細胞中超表達miR-214, 研究miR-214對奶牛泌乳功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

膠原酶IV, sigma；胎牛血清, BI；DF12培養(yǎng)液干粉、胰 酶, Giboc；Lipofectamine 3000, Thermo Fisher Scientific；HiPure Total RNA Micro Kit, Magen；Prime－Script試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒, TaKaRa；細胞裂解液, Beyotime Biotechnology；酪蛋白一抗、CCK18一 抗, Abcam；Bovine Lactose ELISA KIT, Ruifan biological；組織細胞甘油三脂酶法測定試劑盒, PPLYGEN。

1.2 奶牛乳腺上皮細胞的獲取與鑒定

本實驗所用的奶牛乳腺上皮細胞（BMECs）是通過酶消化法從奶牛乳腺組織中分離得到, 細胞沉淀使用含10%血清, 100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DF12培養(yǎng)液懸浮, 并處于5% CO2、37℃無菌環(huán)境中培養(yǎng), 培養(yǎng)2～5 d。當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后, 使用0.25%胰酶純化, 并采用免疫熒光法對細胞進行CCK18鑒定, 使用FITC標記的熒光二抗標記角蛋白18, 用DAPI標記細胞核。

1.3 奶牛乳腺上皮細胞中miR-214的過表達

細胞懸液以1×107/孔的比例均勻的接種至6孔板中培養(yǎng), 細胞密度達到80%左右時使用5μL Lipofectamine 3 000將5μL miRNA瞬時轉(zhuǎn)染至乳腺上皮細胞內(nèi), 培養(yǎng)48 h檢測。實驗分組：空白組、NC組（100 nmol/L miR-9-5p NC）、miR-214過表達組（100 nmol/L miR-9-5p mimics）。

1.4 熒光定量PCR檢測miR-214的表達

使用HiPure Total RNA Micro Kit提取總RNA, 并根據(jù)RNA的紫外光譜特性(Thermo Fisher Scientific)評價其質(zhì)量。每一個RNA樣品通過PrimeScript試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, 用SYBR Premix Ex Taq試劑盒和7300 Real-time PCR體系擴增miR-214, 重復3次。引物如表1所示。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.5 細胞酪蛋白表達量的檢測

使用100μL細胞裂解液收集處理的細胞, 總蛋白濃度通過BCA方法檢測。等量蛋白質(zhì)被10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離后在0.22μm NC膜上印跡。在含有5%脫脂乳的TBS/T緩沖液中37℃孵育2 h, 將膜放入稀釋的酪蛋白一抗中4℃孵育過夜, 經(jīng)TBS/T緩沖液洗滌后, 與含HRP標記的抗兔IgG（Abcam）37℃孵育1 h。經(jīng)洗滌后的膜采用增強化學發(fā)光檢測系統(tǒng)(Cell Signaling Technology)檢測蛋白帶, 結(jié)果使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析。

1.6 細胞乳糖分泌量的檢測

使用Bovine Lactose ELISA KIT檢測乳糖含量。處理后的細胞收集上清培養(yǎng)液3 000 rpm離心10 min去除顆粒和聚合物, 取上清液, 根據(jù)制造商說明書在450 nm波長下測量吸光度值, 按照標準品曲線方程計算濃度。

1.7 細胞乳脂分泌量的檢測

使用組織細胞甘油三脂酶法測定試劑盒檢測乳脂含量。處理后的細胞使用100μL裂解液收集, 裂解液70℃處理10 min后室溫2 000 rpm離心5 min。取上清液按照制造商說明書操作, 最后在550 nm波長下測量吸光度值, 按照標準品曲線方程計算乳脂濃度。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

GraphPad Prim 8被用來對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析, 每組數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示, 組間比較采用單因素方差分析, 組內(nèi)比較采用t檢驗。P＜0.05表示具有統(tǒng)計學差異, P＜0.01表示具有統(tǒng)計學極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

圖1中為奶牛乳腺上皮細胞在純化前后的形態(tài), 在倒置顯微鏡下奶牛乳腺上皮細胞呈現(xiàn)橢圓形緊密排列。結(jié)果如圖1, 純化前, 細胞從乳腺組織塊中慢慢爬出, 其中含有大量呈長梭形、放射狀的成纖維細胞。純化后, 絕大多數(shù)是均勻排列的奶牛乳腺上皮細胞。將純化后的細胞經(jīng)CCK18鑒定, 如圖2所示, 細胞核（藍色）周圍有大量的CCK18（綠色）, 這表明純化得到的細胞主要為奶牛乳腺上皮細胞。

圖1 奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)與純化

圖2 奶牛乳腺上皮細胞角蛋白18的鑒定

2.2 奶牛乳腺上皮細胞中miR-214的過表達檢測

在奶牛乳腺上皮細胞中過表達miR-214, 熒光定量檢測miR-214的表達量。結(jié)果如圖3所示, 與空白組和NC組相比, 過表達miR-214的奶牛乳腺上皮細胞中miR-214的表達量顯著性升高（P＜0.01）。

圖3 奶牛乳腺上皮細胞中miR-214的過表達檢測

2.3 miR-214對奶牛乳腺上皮細胞中酪蛋白合成的影響

酪蛋白是主要的乳蛋白成分。為檢測miR-214對乳蛋白合成的影響, 過表達miR-214后, 使用western blotting檢測細胞中酪蛋白的含量。結(jié)果如圖4所示, 與空白組和NC組相比, 過表達miR-214的奶牛乳腺上皮細胞中酪蛋白的表達量顯著下降（P＜0.01）, 表明miR-214可以抑制乳腺上皮細胞中乳蛋白的合成。

圖4 MiR-214對奶牛乳腺上皮細胞中酪蛋白合成的影響

2.4 miR-214對奶牛乳腺上皮細胞中乳糖合成的影響

在BMECs中過表達miR-214后, 收集48 h細胞上清培養(yǎng)液, 檢測乳糖含量。根據(jù)Bovine Lactose ELISA KIT繪制乳糖標準曲線, 并對照標準曲線方程計算樣品中乳糖的含量。結(jié)果如圖5所示, 與空白組和NC組相比, 過表達miR-214引起乳腺上皮細胞內(nèi)的乳糖含量顯著降低（P＜0.05）, 降至34.09μg/mL。實驗結(jié)果表明miR-214可以抑制奶牛乳腺上皮細胞中乳糖的合成。

圖5 MiR-214對奶牛乳腺上皮細胞中乳糖合成的影響

2.5 miR-214對奶牛乳腺上皮細胞中乳脂合成的影響

在BMECs中過表達miR-214后, 使用裂解液收集細胞檢測乳脂的含量。根據(jù)組織細胞甘油三脂酶法測定試劑盒繪制標準曲線, 并根據(jù)標準曲線計算樣品中乳脂的含量。結(jié)果如圖6所示, 與空白組和NC組相比, 過表達miR-214引起奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)乳脂含量顯著降低（P＜0.01）, 降至113.62μmol/L。實驗結(jié)果表明miR-214可以抑制奶牛乳腺上皮細胞中乳脂的合成。

圖6 MiR-214對奶牛乳腺上皮細胞中乳脂合成的影響

3 討 論

乳腺上皮細胞是乳腺組織在泌乳過程中主要的分泌細胞, 其分泌的乳成分主要有乳糖、乳脂和乳蛋白[14-15]。乳糖是由轉(zhuǎn)運入細胞內(nèi)的葡萄糖合成而來, 一方面是乳汁中主要成分, 同時還是維持細胞內(nèi)滲透壓的主要物質(zhì), 與奶牛泌乳量密切相關(guān)[16-17]。乳蛋白中有80%是酪蛋白, 其是乳汁中特有的一種磷蛋白, 可以通過檢測酪蛋白的表達量來判斷奶牛乳腺上皮細胞的乳蛋白合成能力[18]。在乳成分的合成中主要包括細胞內(nèi)合成和血液中吸收營養(yǎng)物質(zhì)兩個過程, 需要多種因素的共同調(diào)節(jié), 包括激素、細胞因子以及相關(guān)信號通路的激活等[19-21]。近年來, microRNA作為基因表達調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子被相繼報道。已有研究表明, microRNA參與了奶牛乳腺的凋亡、發(fā)育、乳汁合成以及疾病的發(fā)生等過程[22-23]。Li等[24]研究發(fā)現(xiàn)miR-486可以靶向調(diào)控PTEN基因的表達從而調(diào)節(jié)下游基因的表達進而影響泌乳的過程。有研究也發(fā)現(xiàn)在奶牛泌乳期時miR-486通過LATS2參與乳脂的合成[3]。此外, microRNA還參與奶牛乳腺組織中的表觀遺傳修飾過程。Bian等[25]發(fā)現(xiàn)miR-29s可以通過調(diào)節(jié)DNMT3a的表達, 改變奶牛乳腺中基因的DNA甲基化狀態(tài)從而引起基因差異表達, 其中包括CSN2、GLUT1、SREBP1等。

MiR-214以高度保守的狀態(tài)存在于多個物種。有研究表明, miR-214通過靶向調(diào)節(jié)Pten, 作用于PI3K/AKT信號通路增加骨質(zhì)活性, 促進牛的骨質(zhì)疏松[8]。本實驗室在前期的工作中發(fā)現(xiàn)miR-214在高、低產(chǎn)奶牛乳腺中表達差異顯著。本研究進一步探索了miR-214在奶牛乳腺中的作用, 發(fā)現(xiàn)過表達miR-214后奶牛乳腺上皮細胞的乳糖、乳脂和乳蛋白的合成能力顯著降低, 這些結(jié)果表明了miR-214參與了奶牛的泌乳調(diào)節(jié), 相關(guān)的具體作用機制還有待進一步研究。總之, 我們的研究初步探討了miR-214對奶牛泌乳的影響, 為進一步了解泌乳機制、提高乳品質(zhì)進行泌乳調(diào)控研究提供了新的思路和作用靶點。

4 結(jié)論

本研究表明, miR-214在奶牛乳腺上皮細胞中負調(diào)控泌乳過程, miR-214過表達降低了酪蛋白的表達, 同時抑制甘油三脂和乳糖的合成, 表明miR-214對奶牛乳腺上皮細胞的乳糖、乳脂和乳蛋白合成具有抑制作用, 并且可能通過調(diào)節(jié)miR-214的表達影響奶牛泌乳。