朱麗萍,趙金龍，付 亮，勵(lì) 峰

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200011；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院心血管外科，上海 200233)

近年來(lái)，隨著診斷水平的提高，越來(lái)越多的感染性心內(nèi)膜炎患者能夠得到及時(shí)診治，大部分患者能夠通過(guò)正規(guī)有效的抗感染治療獲得痊愈[1-3]。但仍有部分患者因致病微生物種類(lèi)及其致病性、機(jī)體免疫功能低下等原因?qū)е掳昴すδ苁軗p，出現(xiàn)心衰或瓣膜贅生物脫落，從而引起栓塞等并發(fā)癥，需要外科手術(shù)干預(yù)[4]，且術(shù)后需要長(zhǎng)期規(guī)律抗感染治療[5]。由于術(shù)前應(yīng)用抗生素等原因?qū)е聜鹘y(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)手段不能準(zhǔn)確檢出病原體，故術(shù)后準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷結(jié)果是除手術(shù)外影響感染性心內(nèi)膜炎患者預(yù)后的重要因素[6]。目前感染性心內(nèi)膜炎病原學(xué)診斷有賴(lài)于血培養(yǎng)及贅生物培養(yǎng)，而宏基因組二代測(cè)序(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)較多應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織感染及呼吸道感染的病原學(xué)診斷，其在感染性心內(nèi)膜炎病原學(xué)診斷中的作用正受到越來(lái)越多的關(guān)注。本研究通過(guò)回顧性分析感染性心內(nèi)膜炎患者行手術(shù)治療后的贅生物培養(yǎng)、贅生物mNGS及術(shù)前血培養(yǎng)的病原微生物檢出情況，旨在評(píng)價(jià)三種病原學(xué)檢測(cè)方法的診斷價(jià)值，以期提高感染性心內(nèi)膜炎的診斷準(zhǔn)確度。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2017年11月21日至2020年5月19日上海市第六人民醫(yī)院67例行手術(shù)治療的感染性心內(nèi)膜炎患者的臨床資料。本組病例中男49例，女18例，年齡18～78歲，平均(47.2±16.0)歲。所有患者入院前均有發(fā)熱癥狀，體溫高于38.5 ℃，病程9 d至6個(gè)月。其中11例患者伴有胸悶、咳嗽等癥狀，6例患者合并腦梗死，1例患者合并脾梗死。13例(19.4%)既往有心臟病史或心臟手術(shù)史。術(shù)前實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果提示尿素(5.74±3.72)mmol/L、白蛋白(31.26±5.58)g/L、中性粒細(xì)胞(73.63±9.75)%、降鈣素原(0.75±3.06)ng/mL、白細(xì)胞(8.24±4.04)×109/L。所有患者術(shù)前超聲心動(dòng)圖提示有瓣膜贅生物，其中二尖瓣28例，主動(dòng)脈瓣25例，三尖瓣7例，二尖瓣合并主動(dòng)脈瓣5例，右房1例，動(dòng)脈導(dǎo)管未閉1例；贅生物長(zhǎng)度最長(zhǎng)為30 mm，位于主動(dòng)脈瓣；最短為4 mm，為多發(fā)，位于二尖瓣并伴二尖瓣前葉穿孔。62例患者血培養(yǎng)檢查前有抗生素使用史，5例檢查前未使用抗生素。

所有患者均符合改良Duke診斷標(biāo)準(zhǔn)。主要標(biāo)準(zhǔn)：①血培養(yǎng)陽(yáng)性，即2次不同的血培養(yǎng)結(jié)果均為感染性心內(nèi)膜炎的典型致病菌，或非上述致病菌但與感染性心內(nèi)膜炎一致的微生物持續(xù)性血培養(yǎng)陽(yáng)性；②貝氏柯克斯體單次血培養(yǎng)陽(yáng)性或第1階段IgG滴度>1∶800；③超聲心動(dòng)圖示感染性心內(nèi)膜炎的陽(yáng)性表現(xiàn)，如贅生物、膿腫、新發(fā)瓣膜穿孔或反流。次要標(biāo)準(zhǔn):①易患因素，如基礎(chǔ)心臟病或靜脈吸毒成癮；②體溫高于38 ℃；③血管損害征象；④免疫異常征象；⑤血培養(yǎng)陽(yáng)性但未能達(dá)到主要標(biāo)準(zhǔn)要求，或與感染性心內(nèi)膜炎一致的活動(dòng)性細(xì)菌感染。確定診斷:符合2條主要標(biāo)準(zhǔn)，或1條主要標(biāo)準(zhǔn)+3條次要標(biāo)準(zhǔn)，或5條次要標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：雖診斷為感染性心內(nèi)膜炎但單個(gè)贅生物長(zhǎng)度不超過(guò)10 mm且無(wú)膿腫及新發(fā)瓣膜功能異常，經(jīng)規(guī)律抗感染治療后復(fù)查贅生物消失，血培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰性；疑似感染性心內(nèi)膜炎，如術(shù)前有發(fā)熱病史但不滿(mǎn)足感染性心內(nèi)膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，由于瓣膜原發(fā)病變而行手術(shù)治療；普通心臟瓣膜病需手術(shù)治療。

患者在入院前或入院后均行至少1次血培養(yǎng)檢查，術(shù)前完善相關(guān)檢查，明確診斷，排除手術(shù)禁忌者，于體外循環(huán)輔助下行贅生物清除術(shù)，術(shù)中根據(jù)患者瓣膜毀損情況行瓣膜成形或瓣膜置換術(shù)，術(shù)中將切除的贅生物平均分為3份，1份放置于無(wú)菌培養(yǎng)瓶送贅生物培養(yǎng)，1份送病理，1份放置于無(wú)菌培養(yǎng)管加95%酒精或生理鹽水，4～8 ℃儲(chǔ)存送mNGS檢測(cè)。

由于大部分感染性心內(nèi)膜炎患者在血培養(yǎng)前應(yīng)用抗生素可能對(duì)細(xì)菌活性產(chǎn)生影響，從而降低血培養(yǎng)和贅生物培養(yǎng)的檢出率，故將本組病例分為血培養(yǎng)前抗感染組與非抗感染組，分析血培養(yǎng)前應(yīng)用抗生素與否對(duì)三種檢測(cè)方法對(duì)病原微生物檢出率的影響。

1.2 方法

1.2.1 血培養(yǎng) 所有患者入院后均至少行1次血培養(yǎng)，皮膚消毒處理后，從兩個(gè)不同部位(主要為雙側(cè)上肢)采集8～10 mL靜脈血，然后置于需氧菌、厭氧菌、真菌血培養(yǎng)瓶(法國(guó)生物梅里埃公司)，采用全自動(dòng)BACTEC血培養(yǎng)儀(美國(guó)BD公司)按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。血培養(yǎng)菌株主要采用VITEK MS細(xì)菌自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)進(jìn)行菌種鑒定及藥敏分析。

1.2.2 贅生物培養(yǎng) 心臟瓣膜組織及贅生物在手術(shù)切除后立即使用無(wú)菌研磨器研磨成勻漿，轉(zhuǎn)種于血平板、巧克力平板及科瑪嘉真菌顯色平板，培養(yǎng)2周以上，培養(yǎng)出的微生物采用VITEK MS細(xì)菌自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)鑒定菌種。

1.2.3 贅生物mNGS 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序采集患者瓣膜及贅生物樣本，利用天根磁珠法大體積核酸提取試劑盒提取樣本中DNA(不同樣本核酸提取前處理有所不同)。然后用Qubit dsDNA HS Assay Kit檢測(cè)DNA濃度，NanoDrop2000檢測(cè)DNA純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。通過(guò)Covaris超聲波破碎儀打斷為300 bp左右的片段，使用KAPA Biosystems試劑盒制備DNA文庫(kù)。利用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量，通過(guò)Qubit 2.0檢測(cè)文庫(kù)濃度，q-PCR定量下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)量。按照Illumina NexSeq儀的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行75 bp單端測(cè)序，由儀器自帶的NextSeq Control Software讀取序列信息。將獲得的高質(zhì)量去除宿主基因的序列與微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，完成菌種鑒定過(guò)程。對(duì)于結(jié)核分枝桿菌、布魯氏菌，mNGS檢測(cè)到的物種特異性序列為1條及以上不重疊區(qū)域序列，則為陽(yáng)性；對(duì)于其他細(xì)菌(不包括以上細(xì)菌)、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)，mNGS檢測(cè)到的物種特異性序列為3條及以上不重疊區(qū)域序列，則為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)或構(gòu)成比表示，組間采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種方法病原體檢出情況

本研究血培養(yǎng)、贅生物培養(yǎng)、贅生物mNGS檢出病原微生物的患者分別為58例、46例、62例。三種方法檢出的病原微生物類(lèi)型中以革蘭氏陽(yáng)性菌為主，其中以鏈球菌屬最多，血培養(yǎng)檢出28例，贅生物培養(yǎng)檢出3例，mNGS檢出39例。血培養(yǎng)共檢出4例革蘭氏陰性菌(干燥奈瑟菌1例、流感嗜血桿菌1例、大腸埃希菌2例)，其中2例患者術(shù)前2次血培養(yǎng)檢出的細(xì)菌不同，第1次為糞腸球菌，第2次為大腸埃希菌。mNGS檢出6例革蘭氏陰性菌，分別為奈瑟菌2例、流感嗜血桿菌3例及羊布魯氏桿菌1例。血培養(yǎng)檢出2例真菌，分別為白色念珠菌和光滑念珠菌，其中光滑念珠菌同樣為贅生物培養(yǎng)檢出；mNGS除檢出2例真菌外，另檢出1例結(jié)核分枝桿菌、2例貝納柯克斯體(Q熱立克次體)。其中，mNGS檢出的病原微生物中，無(wú)乳鏈球菌(1例)、停乳鏈球菌(1例)、解沒(méi)食子酸鏈球菌(1例)、貝納柯克斯體(2例)、豬紅斑丹毒絲菌(1例)等都是臨床引起感染性心內(nèi)膜炎不常見(jiàn)的病原微生物。

血培養(yǎng)、贅生物培養(yǎng)及mNGS三種方法均一致檢出相同病原微生物，但贅生物培養(yǎng)僅7例患者檢出病原微生物，檢出率為15.22%；血培養(yǎng)42例患者(其中2例患者2次血培養(yǎng)結(jié)果回報(bào)不同細(xì)菌)檢出病原微生物，檢出率為72.41%；相比前兩種方法，mNGS 60例患者檢出病原微生物，檢出率高達(dá)96.77%。三種方法的病原微生物檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 三種方法病原微生物檢出情況(例)

2.2 血培養(yǎng)前抗感染組與非抗感染組中三種檢測(cè)方法檢出情況

血培養(yǎng)前抗感染組中血培養(yǎng)、贅生物培養(yǎng)和贅生物mNGS三種方法的檢出率分別為71.70%(38/53)、16.28%(7/43)、96.49%(55/57)，三種方法病原微生物檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。血培養(yǎng)前非抗感染組中血培養(yǎng)、贅生物培養(yǎng)、贅生物mNGS三種檢測(cè)方法的病原微生物檢出率分別為80.00%(4/5)、0(0/3)、100%(5/5)，三種方法病原微生物檢出率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，無(wú)論血培養(yǎng)前是否應(yīng)用抗生素治療，mNGS對(duì)于感染性心內(nèi)膜炎病原微生物檢出率都高于血培養(yǎng)和贅生物培養(yǎng)。

3 討論

感染性心內(nèi)膜炎為心臟內(nèi)的感染，臨床較為罕見(jiàn)，但對(duì)患者影響較大[7]。通常認(rèn)為有心臟基礎(chǔ)疾病或既往有瓣膜置換史的患者易患感染性心內(nèi)膜炎，但有研究顯示至少50%的感染性心內(nèi)膜炎患者無(wú)心臟基礎(chǔ)疾病[8]。本組患者中13例(19.4%)既往有心臟病史或心臟手術(shù)史，除了既往有心臟病史或心臟手術(shù)史，有創(chuàng)操作、靜脈注射毒品、免疫力低下等也是感染性心內(nèi)膜炎的易患因素[9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，感染性心內(nèi)膜炎發(fā)病率為0.03%～0.10%，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[10]。隨著臨床治療水平的提高，感染性心內(nèi)膜炎患者的病死率有下降趨勢(shì)，但患者術(shù)后1年病死率仍高達(dá)30%[10]。發(fā)達(dá)國(guó)家感染性心內(nèi)膜炎的病原微生物以金黃色葡萄球菌為主，而我國(guó)以鏈球菌屬為主[11]，故病原微生物的異質(zhì)性、地域性也是感染性心內(nèi)膜炎診斷及治療中的一大挑戰(zhàn)。

感染性心內(nèi)膜炎的快速、準(zhǔn)確診斷是臨床追求的目標(biāo)，一旦診斷延誤，將錯(cuò)過(guò)最佳的治療時(shí)間，導(dǎo)致各種并發(fā)癥的發(fā)生，造成患者預(yù)后不良[12]。2000年修訂的Duke標(biāo)準(zhǔn)[13]認(rèn)為血培養(yǎng)陽(yáng)性和超聲心動(dòng)圖提示心臟內(nèi)贅生物，并結(jié)合臨床癥狀是目前診斷感染性心內(nèi)膜炎的主要方法。但隨著臨床預(yù)防性使用抗生素的增加，30%的感染性心內(nèi)膜炎患者因血培養(yǎng)病原微生物檢出率低且超聲心動(dòng)圖不明確，被診斷為疑似，導(dǎo)致病情延誤，進(jìn)而影響預(yù)后[14]。新的檢查手段(如四維CT、FDG-PET、白細(xì)胞成像)可提高感染性心內(nèi)膜炎的診斷率[15]，但目前未普遍應(yīng)用于臨床。

目前血培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于臨床，其結(jié)果及藥敏結(jié)果對(duì)臨床疾病的診斷、治療及指導(dǎo)臨床抗生素使用具有重要的意義。但由于臨床采血時(shí)機(jī)是否最佳(即使用抗菌藥物前，在寒顫或發(fā)熱初30 min至1 h)、樣本采集、處理不規(guī)范及預(yù)防性使用抗生素等原因，導(dǎo)致10%～20%的感染性心內(nèi)膜炎患者的血培養(yǎng)為陰性[16]。而本研究中血培養(yǎng)陰性率為27.59%，說(shuō)明血培養(yǎng)用于感染性心內(nèi)膜炎的診斷存在準(zhǔn)確性欠佳的問(wèn)題。這可能是感染性心內(nèi)膜炎患者血培養(yǎng)前使用抗生素、胞內(nèi)細(xì)菌或真菌感染等原因引起。但質(zhì)譜微生物鑒定系統(tǒng)的產(chǎn)生能夠通過(guò)質(zhì)譜直接鑒定細(xì)菌種類(lèi)，較常規(guī)血培養(yǎng)更加快速準(zhǔn)確[17]。準(zhǔn)確地判斷病原微生物種類(lèi)有助于臨床診斷感染性心內(nèi)膜炎及排除其他需鑒別診斷的疾病，同時(shí)可根據(jù)病原微生物結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的治療。

感染性心內(nèi)膜炎贅生物是由于心內(nèi)膜感染微生物(包括細(xì)菌、病毒、真菌等)在瓣葉上形成贅生物，并延伸至腱索、心房、心室、室間隔的內(nèi)膜上，從而導(dǎo)致瓣膜和心血管內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生炎癥性病變。理論上直接進(jìn)行贅生物培養(yǎng)或者mNGS的病原微生物檢出率較血培養(yǎng)高，但本研究中贅生物培養(yǎng)陽(yáng)性率較血培養(yǎng)低，僅為15.22%，可能原因是患者血培養(yǎng)前使用抗生素導(dǎo)致贅生物中病原微生物活性降低或送檢樣本體積過(guò)小，難以達(dá)到足夠的濃度。除此之外，贅生物培養(yǎng)的臨床應(yīng)用要求較高，感染性心內(nèi)膜炎患者需要進(jìn)行外科手術(shù)干預(yù)后才可取得樣本，這也限制了其臨床應(yīng)用。但是，對(duì)于術(shù)前血培養(yǎng)陰性的感染性心內(nèi)膜炎患者，若贅生物培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性，其贅生物培養(yǎng)結(jié)果及藥敏結(jié)果對(duì)患者術(shù)后抗感染治療具有重要的指導(dǎo)意義。

微生物群中的病毒、細(xì)菌和部分真菌成員的基因組相對(duì)較小，因而能夠測(cè)定其中某些高豐度成員甚至全部成員的完整基因構(gòu)成[18]。通過(guò)數(shù)百萬(wàn)到數(shù)千萬(wàn)讀數(shù)級(jí)別的深度測(cè)序，可直接對(duì)臨床樣本進(jìn)行微生物基因組分析。這種對(duì)宿主、微生物和環(huán)境中全部DNA進(jìn)行測(cè)序的方法，通常稱(chēng)為宏基因組測(cè)序。由于此種測(cè)序基于隨機(jī)抽樣，因此對(duì)于低豐度微生物類(lèi)群的敏感度及所測(cè)基因組序列的完整性完全取決于測(cè)序的深度，得到的測(cè)序讀數(shù)越多，對(duì)低豐度微生物類(lèi)群的靈敏度就越高[19]。本研究中mNGS陽(yáng)性病原微生物檢出率高達(dá)96.77%即證明了這一點(diǎn)。近年來(lái)，mNGS作為一種不依賴(lài)培養(yǎng)的方法，已被應(yīng)用于感染性疾病的病因?qū)W診斷[20-22]，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織感染及呼吸道感染中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，mNGS應(yīng)用于感染性心內(nèi)膜炎的病原學(xué)診斷也受到了越來(lái)越多的關(guān)注[23]。應(yīng)用mNGS直接對(duì)贅生物進(jìn)行分析可準(zhǔn)確、快速地判斷病原微生物，以指導(dǎo)臨床疾病的診治。由于宏基因組學(xué)并不需先檢驗(yàn)可疑的病原微生物，因此在識(shí)別不常見(jiàn)或未知病原微生物方面非常有效，基于其豐富的基因庫(kù)，mNGS可檢出一些罕見(jiàn)的病原微生物[24]。如本組病例中無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、解沒(méi)食子酸鏈球菌、貝納柯克斯體、豬紅斑丹毒絲菌、真菌都是臨床引起感染性心內(nèi)膜炎不常見(jiàn)的病原微生物。

與基于培養(yǎng)的診斷方法不同，mNGS不依賴(lài)于目標(biāo)微生物的分離或繁殖，檢測(cè)微生物的范圍更廣泛。mNGS相比一代測(cè)序大幅降低了成本，保持了較高的準(zhǔn)確性，并且大幅縮短了測(cè)序時(shí)間(只需48～72 h)[18,25]，與血培養(yǎng)及贅生物培養(yǎng)的檢測(cè)時(shí)間相比也明顯縮短(尤其對(duì)于苛養(yǎng)以及慢生長(zhǎng)病原體的檢測(cè))，對(duì)于術(shù)前血培養(yǎng)陰性患者可根據(jù)贅生物mNGS結(jié)果早期進(jìn)行抗感染治療。且mNGS結(jié)果不受患者是否使用抗生素治療的影響。本研究結(jié)果顯示，無(wú)論血培養(yǎng)前是否應(yīng)用抗生素治療，mNGS對(duì)于感染性心內(nèi)膜炎病原微生物的檢出率均高于血培養(yǎng)和贅生物培養(yǎng)。但mNGS的臨床應(yīng)用也存在一定的限制性，首先，其不能判斷病原微生物的藥敏情況，只能為診斷提供依據(jù)；其次，由于目前真菌的參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)尚未完善，分類(lèi)方法也不統(tǒng)一，真菌DNA在環(huán)境中的廣泛存在，以及所用試劑的多樣性，使得mNGS鑒定真菌變得更加復(fù)雜。值得注意的是，當(dāng)mNGS應(yīng)用于臨床診斷時(shí)，為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和可比性，對(duì)樣本采集、核酸提取和數(shù)據(jù)分析等過(guò)程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作非常關(guān)鍵[26]。以往研究證實(shí)了mNGS應(yīng)用于臨床診斷的價(jià)值，未來(lái)的科技進(jìn)展有望促進(jìn)其在臨床診斷中的廣泛應(yīng)用[27]。

綜上，贅生物mNGS憑借其高檢出率、準(zhǔn)確和快速的特點(diǎn)可作為感染性心內(nèi)膜炎病原學(xué)診斷的重要輔助手段，但由于其臨床應(yīng)用存在一定的限制性，需與血培養(yǎng)及贅生物培養(yǎng)等傳統(tǒng)檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)感染性心內(nèi)膜炎患者術(shù)后個(gè)體化、精準(zhǔn)化抗感染治療。