薛靜文, 周謹文, 黃潔彥, 金千禧, 丁建英

（常熟理工學院 生物與食品工程學院, 江蘇 常熟 215500）

菜用大豆, 俗稱毛豆, 一般是指處于鼓粒期至初熟期之間, 其籽粒填充程度達到莢長80%～90%時采摘并專門鮮食嫩莢的蔬菜用大豆[1-2]。菜用大豆在我國有著5000多年的栽培歷史, 因其有一定藥用價值, 在早期作為藥用植物, 而其食用習慣在我國也有著悠久的歷史。菜用大豆中膳食纖維的含量遠高于其他蔬菜, 比大家所熟知的芹菜桿的纖維含量還要高, 有著“蔬菜纖維冠軍”的美譽[2]。其中, 還富含蛋白質、脂肪、礦物質和各種維生素, 以及皂甙、植酸、低聚糖等保健成分, 具有降血壓、降血脂和強身健體、益氣補虛的功效。我國已逐漸成為菜用大豆最大的生產國和出口國, 對于豆粒已經存在許多深加工, 而在莢殼方面, 除了作飼料之外, 其他方面的研究還比較少。

黃酮類化合物是一類廣泛存在于自然界植物中的天然產物, 其中絕大多數黃酮類化合物會與葡萄糖結合成苷類, 而小部分黃酮類化合物則會以游離苷元的形式存在[3]。根據研究表明, 此類化合物具有多種活性功能, 包括抗癌、抗炎癥、抗抑菌活性、抗氧化、降血脂、降血壓等功效[4]。除此之外, 黃酮類化合物還可以調節(jié)人體的腸道菌群[5], 在食品加工中還對丙烯酰胺有一定的抑制作用[6]。

異黃酮是黃酮類化合物的一種, 主要存在于豆科植物中, 其結構與人體雌激素結構非常相似, 又被稱為植物雌激素。大豆中存在的主要有染料木黃酮、黃豆苷元和大豆黃素3種異黃酮。其功效除一般黃酮擁有的功效外, 還在改善更年期綜合征、延緩衰老、美容養(yǎng)顏, 以及畜牧生產和藥物開發(fā)等方面均有很好的作用[7], 具有廣闊的開發(fā)前景。

對于植物黃酮類化合物的提取, 主要有傳統(tǒng)提取法和現代提取法[8], 這幾種方法相輔相成, 各有優(yōu)缺點, 且在實際工作中經常一起使用, 以此提高提取率。包括醇提法和水提法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法等, 其中超聲輔助提取法是應用最為廣泛的提取方法[9]。試驗在此基礎上, 將菜用大豆莢殼作為原料, 進行異黃酮提取研究, 并進行抑菌作用和抗氧化活性的研究, 為菜用大豆莢殼的廢物利用提供研究基礎, 也為利用果蔬廢棄資源研制天然食品防腐劑提供依據[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮菜用大豆（毛豆）、染料木素（分析標準品, HPLC≥98%）, 上海源葉生物科技有限公司提供；無水氯化鋁、無水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、氯化鈉、1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、硫酸亞鐵、過氧化氫溶液、水楊酸、抗壞血酸（維C）、活性炭（顆粒）, 以上試劑均為分析純。

高速中藥粉碎機, 廣州市旭朗機械設備有限公司產品；電熱恒溫鼓風干燥箱, 上海新苗醫(yī)療器械有限公司產品；RE-52型旋轉蒸發(fā)儀, 上海亞榮生化儀器廠產品；HH-4型數顯恒溫水浴鍋, 國華電器有限公司產品；高速臺式離心機, 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產品；超聲波清洗器, 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司產品；生化培養(yǎng)箱, 上海一恒科學儀器有限公司產品；立式高壓蒸汽滅菌鍋, 上海申安醫(yī)療器械廠產品；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計, 北京普析通用儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菜用大豆莢殼中異黃酮的提取工藝流程

（1）原材料處理。將新鮮的菜用大豆剝去豆粒, 收集豆莢, 清洗干凈后先自然風干24 h, 再放入恒溫干燥箱中烘干24 h, 烘干的過程溫度不宜過高, 控制在60℃。干燥至恒質量后, 取出粉碎成粉末并過60目篩, 將粉末放入干凈的密封袋中, 置于冰箱4℃下冷藏備用。

（2）異黃酮的提取。參考王桃云等人[11]的研究方法, 并進行了改進。準確稱取5 g的菜用大豆莢殼粉末, 按照一定量的乙醇溶液, 在一定溫度下超聲提取一段時間, 然后以轉速5000 r/min離心10 min, 取上清液, 再旋轉蒸發(fā)進行濃縮, 溫度控制在60℃, 最后加入活性炭并通過濾紙過濾, 得到最終提取液。異黃酮得率按公式（1）計算：

式中：P——樣品中異黃酮得率, mg/g；

C——從標準曲線中計算得到的提取液質量濃度, mg/mL；

N——樣品提取液總體積, mL；

k——稀釋倍數；

m——稱取粉末的質量, g。

1.2.2 最大吸收波長的確定

參考王桃云等人[12]的方法, 并進行了適當修改。首先分別準確量取染料木素標準液和提取液各1.0 mL放置于10 mL容量瓶中, 加入體積分數95%的乙醇定容至刻度線, 搖勻, 用紫外可見分光光度計在波長200～800 nm進行全波長掃描, 從而確定提取液的最大吸收波長為263 nm。

1.2.3 染料木素標準曲線的繪制

準確稱取染料木素標準品3.4 mg, 先用體積分數95%的乙醇溶解后, 置于100 mL的容量瓶中, 再用體積分數95%的乙醇沖洗幾次燒杯, 將液體倒入容量瓶中, 最后用體積分數95%的乙醇定容至刻度線, 搖勻。從中取出10 mL置于50 mL的容量瓶中, 用體積分數95%乙醇定容至刻度線, 即得到染料木素標準液, 質量濃度為6.8μg/mL。

準確量取已制備好的標準液0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 mL分別置于10 mL的容量瓶中, 用95%的乙醇定容至刻度線, 搖勻。用體積分數95%乙醇調零, 在波長263 nm處測定吸光度, 記錄數據, 以溶液質量濃度為橫坐標, 以吸光度為縱坐標繪制染料木素標準曲線[12]。

1.2.4 單因素試驗

選定對菜用大豆莢殼中異黃酮提取產生影響的4個因素進行單因素試驗, 分別為料液比、乙醇體積分數、超聲時間和超聲溫度。

單因素試驗設計水平見表1。

表1 單因素試驗設計水平

1.2.5正交試驗設計

為了進一步優(yōu)化菜用大豆莢殼中異黃酮的提取工藝, 在單因素試驗的基礎上進行正交試驗設計[13]。分別選擇料液比、乙醇體積分數、超聲時間及超聲溫度這4個因素的3個水平, 再通過L9（34）的正交表進行正交試驗[14]。

正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設計

1.3 抑菌與抗氧化性研究

1.3.1 抑菌試驗

采用紙片法進行抑菌試驗[15-16]。首先用打孔器打成直徑為8mm的圓紙片, 包扎好后連同培養(yǎng)皿及試驗所用到的器材一同滅菌。無菌操作臺事先紫外滅菌30 min。點燃酒精燈并消完毒后, 在酒精燈旁打開滅好菌的培養(yǎng)基, 將培養(yǎng)皿中倒入15～20 mL的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基, 蓋上蓋, 待其冷卻凝固之后, 再將培養(yǎng)基上加入制備好的菌懸液200μL, 用酒精燈灼燒過的涂布棒將菌液涂布均勻, 待其完全吸收。用灼燒過的鑷子取出事先在提取液中浸泡過一夜的紙片（共3片）以及在蒸餾水中浸泡過的紙片（1片）, 在火焰旁微微干燥過后, 整齊地放在一個培養(yǎng)皿上, 蓋上蓋, 待紙片上的液體被完全吸收, 放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24 h后, 觀察并測量抑菌圈直徑。

1.3.2 對DPPH自由基的清除作用

由于DPPH自由基存在單個電子, 而其醇溶液又呈現紫色, 并且在波長517 nm處有強吸收, 加入抗氧化劑之后, 因為電子進行了配對而導致溶液顏色變淺, 吸光度變小, 因此可以利用這個原理來測定對DPPH自由基的清除能力。

參考王蔚新等人[17]的研究, 并進行了適當修改：配置不同質量濃度的提取液（0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL）, 分別量取2.0 mL于試管當中, 加入0.2 mmol/L的DPPH溶液2.0 mL, 充分搖勻, 避光靜置30 min。用無水乙醇調零, 在波長517 nm處測得吸光度A2；用無水乙醇代替DPPH溶液, 作為對照測其吸光度A3；取相同體積DPPH溶液和無水乙醇混合, 測其吸光度A1。按照上述相同步驟, 將抗壞血酸作為參照物, 測定其吸光度。進行平行試驗, 減少誤差。對DPPH自由基清除率按公式（2）計算：

式中：A2——提取液和DPPH溶液的吸光度；

A3——提取液和無水乙醇的吸光度；

A1——無水乙醇和DPPH溶液的吸光度。

1.3.3 對羥基自由基的清除作用

在Fenton反應中, Fe2+催化分解H2O2, 產生羥基自由基, 其具有高活性。在該反應體系中加入水楊酸, 水楊酸有效捕捉羥基自由基并反應生成2,3-二羥基苯甲酸羥基化合物, 該化合物在波長510 nm處有強吸收。如果往該體系中加入可以清除羥基自由基的物質, 使得化合物含量減少, 其吸光度也隨之降低。利用吸光度值的變化測得對羥基自由基的清除能力。

參考王蔚新等人[17]的研究, 并進行了適當修改：配置不同質量濃度的提取液（0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL）, 分別量取2.0 mL于試管當中, 先加入9 mmol/L FeSO4溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液各2.0 mL, 充分搖勻, 靜置5 min。然后再加入9 mmol/L水楊酸溶液2.0 mL, 充分搖勻, 放置于水浴鍋中于37℃下恒溫水浴30 min。用蒸餾水調零, 于波長510 nm處測得吸光度A2；用蒸餾水代替提取液為空白對照測其吸光度A1；用蒸餾水代替H2O2測其吸光度A3。按照上述相同步驟, 將抗壞血酸作為參照物, 測定其吸光度。進行平行試驗, 減少誤差。對羥基自由基清除率按公式（3）計算：

式中：A2——加入提取液和H2O2溶液的吸光度；

A3——加入提取液和蒸餾水的吸光度；

A1——加入蒸餾水和H2O2溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長

根據1.2.2的方法對染料木素和菜用大豆莢殼中異黃酮進行紫外吸收光譜掃描。

染料木素紫外吸收光譜掃描圖見圖1, 菜用大豆莢殼中異黃酮紫外吸收光譜掃描圖見圖2。

圖1 染料木素紫外吸收光譜掃描圖

由圖1和圖2可知, 染料木素在波長263 nm處有最大吸收波長, 而菜用大豆莢殼中異黃酮在波長267 nm處有最大吸收波長, 兩者十分接近, 因此選擇263 nm作為測定菜用大豆莢殼中異黃酮含量的波長。

圖2 菜用大豆莢殼中異黃酮紫外吸收光譜掃描圖

2.2 染料木素標準曲線

按照1.2.3的方法進行試驗, 得到染料木素標準曲線。

染料木素標準曲線見圖3。

圖3 染料木素標準曲線

由圖3可知, 線性回歸方程為Y=0.1533X-0.0008, R2=0.9991, 線性關系良好。

2.3 單因素試驗結果與分析

2.3.1 料液比對菜用大豆莢殼中異黃酮得率的影響

選擇料液比1∶5, 1∶10, 1∶15, 1∶20, 1∶25, 1∶30（g∶mL）進行研究, 按照乙醇體積分數為85%, 溫度為40℃下超聲提取30 min。

料液比對菜用大豆莢殼中異黃酮得率的影響見圖4。

圖4 料液比對菜用大豆莢殼中異黃酮得率的影響

由圖4可知, 當料液比為1∶15時, 菜用大豆莢殼中異黃酮得率最高。料液比低于1∶15時, 無法完全溶解粉末, 使異黃酮完全溶出；料液比高于1∶15時, 粉末已被完全溶解, 異黃酮完全溶出, 隨著料液比的增加會使其他雜質也溶解于乙醇中, 導致異黃酮得率降低[18]。因此, 選擇1∶10, 1∶15, 1∶20（g∶mL）作為正交試驗的料液比范圍。

2.3.2 乙醇體積分數對菜用大豆莢殼中異黃酮得率的影響

選擇乙醇體積分數65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%進行研究, 按照料液比為1∶20, 溫度為40℃下超聲提取30 min。

乙醇體積分數對菜用大豆莢殼中異黃酮得率的影響見圖5。

圖5 乙醇體積分數對菜用大豆莢殼中異黃酮得率的影響

由圖5可知, 當乙醇體積分數為75%時, 菜用大豆莢殼中異黃酮得率最高。乙醇體積分數低于75%時, 隨著體積分數的上升異黃酮得率也逐漸提高；當乙醇體積分數高于75%時, 異黃酮得率隨著體積分數上升而逐漸降低, 原因可能是菜用大豆莢殼中異黃酮的極性與75%乙醇的極性相近[11], 且過高的濃度可能破壞了溶解出的異黃酮, 使得率降低。因此, 選擇70%, 75%, 80%作為正交試驗的乙醇體積分數范圍。

2.3.3 超聲時間對菜用大豆莢殼中異黃酮得率的影響

選擇超聲時間25, 30, 35, 40, 45, 50 min進行研究, 按照料液比為1∶20, 乙醇體積分數為85%, 超聲溫度為40℃下進行提取。

超聲時間對菜用大豆莢殼中異黃酮得率的影響見圖6。

圖6 超聲時間對菜用大豆莢殼中異黃酮得率的影響

由圖6可知, 超聲時間為25～40min時, 菜用大豆莢殼中異黃酮得率快速提高, 且在40 min時到達最高, 之后隨著時間的增加, 異黃酮得率反而下降。原因可能是超聲波具有較強的機械剪切作用, 使得異黃酮裂解, 結構被破壞, 含量減少[11]；而且過長的時間可能會使溶解的雜質增多, 降低了異黃酮的純度, 得率降低。因此, 選擇35, 40, 45 min作為正交試驗的超聲時間范圍。

2.3.4 超聲溫度對菜用大豆莢殼中異黃酮得率的影響

選擇超聲溫度30, 40, 50, 60, 70, 80℃進行研究, 按照料液比為1∶20, 乙醇體積分數為85%, 超聲提取30 min。

超聲溫度對菜用大豆莢殼中異黃酮得率的影響見圖7。

圖7 超聲溫度對菜用大豆莢殼中異黃酮得率的影響

由圖7可知, 超聲溫度為30～60℃時, 菜用大豆莢殼中異黃酮得率隨著溫度上升而逐漸提高, 并在60℃時達到最高, 之后隨著溫度的上升, 異黃酮得率逐漸下降。原因可能是溫度的上升使得溶劑滲透作用加強, 分子擴散運動加快, 異黃酮的溶出量也隨之增多；但是, 過高的溫度反而會影響穩(wěn)定性, 使異黃酮的結構被破壞, 進而導致異黃酮得率降低。因此, 選擇50, 60, 70℃作為正交試驗的超聲溫度范圍。

2.4 正交試驗結果與分析

L9（34）正交試驗分析見表3。

表3 L9（34）正交試驗分析

由表3可知, 這4個因素均對菜用大豆莢殼中異黃酮得率有影響, 其中料液比對異黃酮得率影響最大, 而超聲時間對異黃酮得率影響最小, 影響的順序為A＞B＞D＞C, 即料液比＞乙醇體積分數＞超聲溫度＞超聲時間。最佳工藝條件組合為料液比1∶10（g∶mL）, 乙醇體積分數80%, 超聲時間45 min, 超聲溫度70℃。在此條件下進行驗證試驗, 得到菜用大豆莢殼中異黃酮得率為2.39 mg/g, 低于大豆莢殼中異黃酮的含量, 為3.5 mg/g[11]。

2.5 抑菌作用結果與分析

菜用大豆莢殼中異黃酮提取液對2種菌的抑菌圈直徑見表4。

表4 菜用大豆莢殼中異黃酮提取液對2種菌的抑菌圈直徑/mm

表4中數據為平行3次, 共6組數據的平均值且均已減去8 mm紙片的直徑。由表4可知, 菜用大豆莢殼中異黃酮提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用。其中, 大腸桿菌的抑菌圈直徑大小為3.83±1.77 mm, 金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小為11.50±2.75 mm, 抑菌效果良好。對照組浸泡蒸餾水的紙片未出現抑菌圈。

根據革蘭氏染色法可將細菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌, 大腸桿菌為革蘭氏陰性菌, 金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌。經過上述分析可以推斷出, 菜用大豆莢殼中異黃酮提取液對革蘭氏陽性菌的抑制作用高于革蘭氏陰性菌。

2.6 抗氧化性結果與分析

2.6.1 對DPPH自由基的清除效果

菜用大豆莢殼中異黃酮提取液和維C對DPPH自由基的清除效果見圖8。

圖8 菜用大豆莢殼中異黃酮提取液和維C對DPPH自由基的清除效果

由圖8可知, 維C和菜用大豆莢殼中異黃酮提取液在對DPPH自由基的清除上都有較好的效果, 且清除率與濃度呈正相關趨勢。此外, 在不同質量濃度下, 異黃酮提取液對DPPH自由基的清除率均小于維C, 但仍有良好的效果, 在質量濃度為1 mg/mL時, 菜用大豆莢殼中異黃酮提取液對DPPH自由基的清除率為86.97%, 與黃福氣等人[18]報道的醬油渣異黃酮純化物對DPPH自由基的89.18%清除率相近。

2.6.2 對羥基自由基的清除效果

菜用大豆莢殼中異黃酮提取液和維C對羥基自由基的清除效果見圖9。

圖9 菜用大豆莢殼中異黃酮提取液和維C對羥基自由基的清除效果

由圖9可知, 維C和菜用大豆莢殼中異黃酮提取液在清除羥基自由基上都有著較好的效果, 且清除率與濃度呈正相關趨勢。當質量濃度為0.2～0.6 mg/mL時, 異黃酮提取液的清除率略低于維C；當質量濃度達到0.8 mg/mL時, 異黃酮提取液對羥基自由基清除率超過了維C；在質量濃度為1 mg/mL, 菜用大豆莢殼中異黃酮提取液對羥基自由基的清除率為68.96%, 高于李超峰等人[19]報道的銀杏果外種皮總黃酮57.85%的羥基自由基的清除率, 清除效果良好。

3 結論

以菜用大豆莢殼為原材料, 利用超聲波輔助提取其中的異黃酮, 通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了提取工藝, 并對得到的異黃酮提取液進行了抑菌和抗氧化性研究, 得到菜用大豆莢殼中異黃酮的最大吸收波長為263 nm, 最佳提取工藝條件組合為料液比1∶10（g∶mL）, 乙醇體積分數80%, 超聲時間45 min, 超聲溫度70℃。該條件下提取得到菜用大豆莢殼中異黃酮的得率為2.39 mg/g。在抑菌試驗中, 菜用大豆莢殼中異黃酮提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑分別為3.83±1.77 mm和11.5±2.75 mm, 有一定的抑菌作用。在抗氧化性研究中, 當質量濃度為1 mg/mL時, 菜用大豆莢殼中異黃酮提取液對DPPH自由基和羥基自由基的清除率分別為86.97%和68.96%, 說明其具有良好的抗氧化性。

研究結果表明, 在菜用大豆莢殼中含有一定量的異黃酮, 并且在抑菌和抗氧化方面均有不錯的效果。這為利用果蔬廢棄資源研制天然食品防腐劑提供了理論依據。