崔淼，李鈺杰，楊永春，張佳穎，許鮮姬，林李泉，林國(guó)榮，張其中，許德麟

( 1. 暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632；2. 陽西縣恒生水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，廣東 陽江 529825；3. 陽江市國(guó)榮水產(chǎn)科技有限公司，廣東 陽江 529825)

1 引言

類胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-like Growth Factors，IGFs）是一類參與脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)、生殖和免疫等過程的調(diào)控因子，相較于胰島素，IGFs多一個(gè)功能域D。IGFs主要由肝臟細(xì)胞表達(dá)生成，然后通過內(nèi)分泌及旁分泌的方式運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體各個(gè)部位，介導(dǎo)生長(zhǎng)激素（Growth Hormone, GH）發(fā)揮生理功能，從而促進(jìn)肌肉組織的生長(zhǎng)和肌纖維細(xì)胞的增殖，對(duì)于魚類的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用[1]。硬骨魚IGFs基因序列相繼在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[2]、斑馬魚（Danio rerio）[3]、鯉魚（Cyprinus carpio）[4]等成魚中被克隆報(bào)道，但一直未見其在胚胎發(fā)育中的作用研究。直到Fukenstein等[5]首次在大西洋鯛（Sparus aurata）卵子和受精卵發(fā)育不同時(shí)期檢測(cè)到了IGF-1基因，才明確IGF-1基因參與了調(diào)控胚胎的發(fā)育過程；此后，White等[6]發(fā)現(xiàn)敲除斑馬魚的IGF-2基因會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡。由此可見，IGFs基因在硬骨魚類胚胎發(fā)育的調(diào)控過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

黃鰭棘鯛（Acanthopagrus latus）屬鱸形目、鯛科、棘鯛屬，為淺海暖水性底層魚類，生活在近岸海域及河口灣，常見于我國(guó)東南沿海[7-8]。其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，是沿海地區(qū)最有推廣潛力的海水魚類養(yǎng)殖品種之一。黃鰭棘鯛繁殖期為每年的9-12月，雌魚繁殖期多次產(chǎn)卵[9-10]。鄭運(yùn)通等[11-12]、Leu和Chou[13]完成了黃鰭棘鯛的人工繁殖以及種苗培育，Li等[14]和Zhou等[15]對(duì)黃鰭棘鯛性腺發(fā)育進(jìn)行了研究，為黃鰭棘鯛規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖提供了理論基礎(chǔ)。目前，關(guān)于黃鰭棘鯛的生長(zhǎng)相關(guān)基因研究絕大多數(shù)限于成魚之中[16-20]，在胚胎發(fā)育中的作用和機(jī)制研究相對(duì)較少。本文擬通過對(duì)黃鰭棘鯛早期胚胎發(fā)育全過程的跟蹤觀察，掌握其胚胎發(fā)育階段不同組織器官的特征變化規(guī)律，在克隆獲得黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因的基礎(chǔ)上，了解IGF-1和IGF-2基因在黃鰭棘鯛胚胎中的表達(dá)特征，為研究IGF-1和IGF-2基因在黃鰭棘鯛早期發(fā)育中的生理功能提供基礎(chǔ)資料。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇體長(zhǎng)為（14±3）cm，體重為（135±30）g的成魚，每5條作為一個(gè)混樣，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行，采樣前先進(jìn)行MS-222（40 mg/L）麻醉，然后取新鮮肝臟組織，放入經(jīng)過DEPC水處理過的凍存管中，置于液氮中，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。黃鰭棘鯛海捕親魚來源于南海不同海域，選擇體質(zhì)健壯、體表光滑無傷痕、顏色鮮艷、活力大的個(gè)體，雄性個(gè)體體重大于250 g，雌性個(gè)體體重大于400 g，共286條，在廣東省陽江市恒生水產(chǎn)養(yǎng)殖合作社海上網(wǎng)箱中進(jìn)行強(qiáng)化培育。

采用絨毛膜促性腺激素（HCG）和促黃體素釋放激素（LRH-A）混合注射入背部肌肉，雌魚HCG注射量為600 IU/kg，LRH-A注射量為10 μg/kg；雄魚注射量為雌魚的一半，分兩次注射，間隔24 h。將5條雌性親魚與10條雄性親魚一同放入產(chǎn)卵池中，在水溫為（27±1）℃，鹽度為28，pH為8.0的情況下，采用避光、流水刺激的方法使親魚正常產(chǎn)卵受精。在孵化池的出水口收集受精卵，隨機(jī)取樣放入顯微鏡下觀察，確保受精卵發(fā)育同步性，然后將受精卵轉(zhuǎn)移至500 L的孵化桶中，在水溫為（26.5±0.5）℃，鹽度為28，pH為8.0的情況下，微充氣孵化。用燒杯于孵化桶中撈取適量受精卵，用吸管吸取胚胎（不少于30粒），在Nikon E100生物顯微鏡下連續(xù)觀察并拍照記錄。參考劉鑒毅等[21]的方法，當(dāng)視野中50%以上個(gè)體發(fā)育至某階段時(shí)，所用時(shí)間即為發(fā)育到該階段的時(shí)間。當(dāng)胚胎到達(dá)一個(gè)發(fā)育階段后，對(duì)該階段胚胎進(jìn)行取樣，每次取樣分為3個(gè)平行，每個(gè)平行不少于50粒，用DEPC水沖洗干凈，放入液氮中冷凍保存。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取到斜帶石斑魚（Epinephelus coioides，AY552787.1）、金錢魚（Scatophagus argus，XM_046394064.1）、羅非魚（Oreochromis niloticus，XM_025908435.1）、大 西 洋 鯛（S. aurata，EF563836.1）的IGF-2基因mRNA序列，利用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì)，獲得IGF-2基因的保守區(qū)域，運(yùn)用Primer Premier 5 設(shè)計(jì)保守區(qū)域引物，對(duì)黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 μL：

10×KOD Buffer 2.5 μL，dNTPs Mixture（2 mmol/L）2.5 μL，MgSO4（25 mmol/L）1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 16.75 μL，KOD-Plus Neo 0.25 μL。PCR反應(yīng)條件為94°C 4 min；98°C 10 s，52～64°C 30 s，68℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)； 68°C 延伸7 min，4℃保存。以IGF-2基因保守區(qū)域序列作為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)并合成用于5′RACE與3′RACE擴(kuò) 增所需的 特 異性引物，引物合成均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。引物序列詳見表1。

2.2.2 總RNA提取與第一鏈cDNA的合成

參照Trizol試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）說明書，提取黃鰭棘鯛肝與各胚胎發(fā)育階段的總RNA，按照MMLV Reverse Transcriptase試劑盒（Promega，美國(guó)）說明書，以O(shè)ligo(dT)作為引物，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。同時(shí)根據(jù)SMARTer?RACE 5′/3′Kit試 劑 盒（TaKaRa，日本）說明書，以黃鰭棘鯛肝的RNA作為模板合成5′和3′ RACE-ready cDNA。

2.2.3 黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因克隆

以反轉(zhuǎn)錄獲得的第一鏈cDNA作為模板，用引物IGF-2-F與IGF-2-R進(jìn)行梯度PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，按照DNA凝膠回收試劑盒（Omega，美國(guó)）說明書，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，連接到pMD?18-T（TaKaRa，日本）質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α中，挑取單克隆菌落，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)后，篩選出陽性菌，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 μL：10×Buffer（含2.5 mmol/L MgCl2）2.5 μL，dNTPs Mixture（2.5 mmol/L）2 μL，M13F-47（10 μmol/L）0.5 μL，M13R-48（10 μmol/L）0.5 μL，菌液1 μL，ddH2O 18.375 μL，rTaq 0.125μL。PCR 反應(yīng)條件為94°C 3 min；94°C 30 s，55°C 30 s，72℃ 90 s，32個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10 min，4℃保存。以5′RACE-ready cDNA和3′RACE-ready cDNA作為模板，采用特異性引物與通用引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 μL：10×KOD Buffer 2.5μL，dNTPs Mixture（2 mmol/L）2.5 μL，MgSO4（25 mmol/L）1.5 μL，上、下 游 引 物（10 μmol/L）各0.5 μL，5′/3′RACE-ready cDNA 0.5 μL，ddH2O 16.75 μL，KOD-Plus Neo 0.25 μL。PCR 反應(yīng)條件為94°C 4 min；98°C 10 s，50～64°C 30 s，68℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；68°C延伸7 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物操作同上。運(yùn)用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果拼接，得到黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因cDNA序列。

2.2.4 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫在線分析黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），并將其翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列，利用NCBI的Blast功能對(duì)IGF-2基因核苷酸與氨基酸進(jìn)行序列相似性比對(duì)和分析，利用Expasy（http://web.expasy.org/）在線分析IGF-2基因的分子量、分子式、等電點(diǎn)等生物信息，利用MEGA X軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，并基于鄰接（Neighbour-joining，NJ）法構(gòu)建IGF-2進(jìn)化樹。用于IGF-2氨基酸序列分析、同源性比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的基因序列均從NCBI數(shù)據(jù)庫下載。

2.2.5 黃鰭棘鯛胚胎發(fā)育階段IGF-1和IGF-2基因表達(dá)

根據(jù)已克隆得到的IGF-2基因以及前期報(bào)道的IGF-1基因序列[18]，設(shè)計(jì)用于qPCR的特異性引物。使用Bio-Rad CFX96TMReal Time System 平臺(tái)，參照SYBR?Green Real Time PCR MIX試劑盒（TOYOBO，日本）說明書，采用20 μL體系（SYBR?Green Real Time PCR MIX 10 μL，cDNA 1 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，DEPC水8.2 μL），以實(shí)時(shí)qPCR法對(duì)IGF-1和IGF-2基因在黃鰭棘鯛胚胎發(fā)育各階段的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性94℃ 3 min；94℃15 s, 60℃ 15 s，72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因[20]，校正各基因的反轉(zhuǎn)錄效率，采用2-ΔΔct方法計(jì)算IGF-1和IGF-2在各胚胎發(fā)育時(shí)期中的相對(duì)表達(dá)量。

2.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0通過單因素方差分析和Duncan多重比較進(jìn)行均值計(jì)算和顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果分析

3.1 黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因克隆及序列分析

利用保守區(qū)域特異性引物擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物經(jīng)純化、連接、轉(zhuǎn)化等處理后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，確定為黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因保守區(qū)片段。根據(jù)此序列，進(jìn)行3′RACE和5′RACE PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到IGF-2基因部分cDNA片段，經(jīng)過拼接，得到黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因cDNA全長(zhǎng)序列（圖1）。黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基 因cDNA包括148 bp的5′端 非 編 碼 區(qū)（5′UTR），940 bp的3′端非編碼區(qū)（3′UTR），以及648 bp的ORF，共編碼215個(gè)氨基酸殘基。對(duì)IGF-2基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)中精氨酸（Arg）含量最高，為10.7%，其次為亮氨酸（Leu），含量為10.2%，色氨酸（Trp）含量最少，僅為0.5%。預(yù)測(cè)蛋白分子量為24.67 kDa, 理論等電點(diǎn)為10，不穩(wěn)定指數(shù)為68.58，脂肪指數(shù)為79.81，蛋白質(zhì)前52個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，IGF-2功能區(qū)具有58個(gè)氨基酸，后105個(gè)氨基酸為結(jié)構(gòu)域E。

圖1 黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因全長(zhǎng)序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 1 Complete sequence of IGF-2gene cDNA and deduced amino acid sequence from Acanthopagrus latus

3.2 黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因氨基酸序列的同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因氨基酸序列經(jīng)過Blast檢索發(fā)現(xiàn)，IGF-2基因在魚類中高度保守（圖2），與同為鱸形目的大西洋鯛、三長(zhǎng)棘赤鯛（Pagrus auriga）高度相似，一致性高達(dá)95%以上，與牙鲆（Paralichthys olivaceus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）一 致 性 在80%以上，與斑馬魚的一致性為78.2%，但與其他脊椎動(dòng)物一致性較低，與野豬（Sus scrofa）的一致性為42.2%，與人（Homo sapiens）和獼猴（Macaca mulatta）的一致性僅為36.7%和35.8%。將黃鰭棘鯛與Gene-Bank中已發(fā)表的其他物種的IGF-2基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），基于系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，黃鰭棘鯛與其他硬骨魚類聚為一簇，兩棲類則和哺乳類聚為一簇。其中，黃鰭棘鯛先與大西洋鯛、沙重牙鯛（Diplodus sargus）聚為一支，三者在遺傳距離上最近，其次與三長(zhǎng)棘赤鯛、牙鲆和大菱鲆等聚為一簇，與哺乳類動(dòng)物和兩棲動(dòng)物遺傳遺傳距離較遠(yuǎn)，這與氨基酸序列同源性比較結(jié)果一致。

3.3 黃鰭棘鯛胚胎發(fā)育觀察

黃鰭棘鯛受精卵在水溫為（26.5±0.5）℃，鹽度為28，pH為8.0的條件下，完成整個(gè)胚胎發(fā)育過程共用時(shí)25.5 h。在水體不充氣的狀態(tài)下，黃鰭棘鯛受精卵在不同鹽度的海水中分布不同，當(dāng)鹽度大于32時(shí)，受精卵漂浮于水面；當(dāng)鹽度小于24時(shí)，受精卵沉在水底；當(dāng)鹽度為26～30時(shí)，受精卵懸浮于水中。黃鰭棘鯛受精卵卵裂方式為盤狀卵裂，卵裂僅在胚盤上進(jìn)行，卵黃不參與分裂。黃鰭棘鯛卵受精后，卵周隙變小，受精卵卵徑為（0.900±0.050）mm，內(nèi)有一個(gè)直徑為（0.250±0.020）mm的油球。受精后，在動(dòng)物極可觀察到一扁平帽狀結(jié)構(gòu)，稱為胚盤，卵黃向植物極集中，原生質(zhì)逐漸向動(dòng)物極轉(zhuǎn)移，胚盤開始隆起，大約40 min后在胚盤頂部中央產(chǎn)生一分裂溝，即第一次細(xì)胞分裂，最終形成兩個(gè)均等的細(xì)胞（圖4a）。55 min后開始第二次細(xì)胞分裂，在細(xì)胞頂部中央出現(xiàn)與第一次細(xì)胞分裂相垂直的分裂溝，形成4個(gè)大小相似的細(xì)胞（圖4b），1 h 10 min后，在第一次分裂溝兩邊，各出現(xiàn)一條與之相平行的分裂溝，形成8個(gè)細(xì)胞（圖4c）。然后繼續(xù)分裂，依次進(jìn)入16細(xì)胞期（圖4d）、32細(xì)胞期（圖4e）、64細(xì)胞期（圖4f）和多細(xì)胞期（圖4g）。隨著細(xì)胞分裂次數(shù)不斷增多，細(xì)胞多而呈不規(guī)則排列，3 h 20 min后進(jìn)入桑葚胚期（圖4h）。細(xì)胞繼續(xù)分裂，細(xì)胞間更細(xì)密，細(xì)胞界限模糊不清，4 h后在胚盤處細(xì)胞堆積，在突出于卵黃之上形成囊胚層，進(jìn)入高囊胚期（圖4i）。細(xì)胞向四周擴(kuò)散，5 h 25 min后，囊胚層變低，稱之為低囊胚期（圖4j）。囊胚層繼續(xù)向下包，7 h 10 min 進(jìn)入原腸前期（圖4k）；胚盤下包至卵黃1/2處，形成胚盾，8 h 45 min 后進(jìn)入原腸中期（圖4l）；10 h 5 min 后囊胚層下包至卵黃3/4處，胚層包裹植物極形成胚孔，胚盾繼續(xù)延伸，胚體逐步形成，進(jìn)入原腸晚期（圖4m）。11 h 10 min后，胚層繼續(xù)下包，最終完全將胚孔封閉（圖4n）；11 h 40 min后，胚體頭部開始形成視囊（圖4o）；受精12 h 20 min后，腦開始出現(xiàn)分化，身體中部出現(xiàn)肌節(jié)（圖4p）；受精后13 h 40 min后，在眼囊中間處出現(xiàn)一對(duì)凹陷，開始形成視杯，肌節(jié)數(shù)目增多（圖4q）；受精后15 h，肌節(jié)進(jìn)一步增多，胚體末端黑色素開始累積，在腹面開始突出形成尾芽，并開始從卵黃囊上分離（圖4r）；16 h 50 min 后，尾從卵黃囊上分離出來，胚體頭部變大，視囊中出現(xiàn)圓形晶體，心臟原基開始出現(xiàn)（圖4s）；受精19 h 40 min后，心臟原基進(jìn)一步發(fā)育，頭部結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜，胚體開始間歇性顫動(dòng)，進(jìn)入肌肉效應(yīng)期（圖4t）；受精21 h后，胚體顫動(dòng)頻率增加，心臟開始搏動(dòng)，起初頻率微弱，以后逐漸加快（圖4u）；23 h 10 min后，胚體長(zhǎng)度幾乎可以包裹卵黃囊一周，胚體扭動(dòng)有力，在顯微鏡下可見連續(xù)扭動(dòng)（圖4v）；胚體發(fā)育25 h 30 min后，胚體頭部破膜而出，尾部擺動(dòng)頻繁，仔魚開始褪去卵膜孵出（圖4w）。

圖2 黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因氨基酸序列多重序列比對(duì)Fig. 2 Amino acid sequence multiple alignment of IGF-2gene fromAcanthopagrus latus

3.4 IGF-1和IGF-2基因在黃鰭棘鯛胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)情況

通過熒光定量PCR檢測(cè)黃鰭棘鯛I(yíng)GF-1和IGF-2基因在胚胎發(fā)育不同階段（卵裂期、囊胚期、原腸期、胚孔封閉期、晶體期、肌肉效應(yīng)期、心跳期、出膜前、出膜后3 d）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，黃鰭棘鯛I(yíng)GF-1和IGF-2基因mRNA在各發(fā)育時(shí)期中均有表達(dá)（圖5），黃鰭棘鯛I(yíng)GF-1基因呈現(xiàn)先上升后下降的表達(dá)趨勢(shì)，在肌肉效應(yīng)期表達(dá)量最高，在囊胚期、原腸期、胚孔封閉期、晶體期以及出膜后3 d表達(dá)量次之，卵裂期、心跳期、出膜前表達(dá)量較低；IGF-2基因呈現(xiàn)先上升后下降再上升的表達(dá)趨勢(shì)，在原腸期、肌肉效應(yīng)期以及出膜后3 d的表達(dá)量較高，在胚孔封閉期和晶體期表達(dá)量次之，而在卵裂期、囊胚期、心跳期以及出膜前表達(dá)量較低。

4 討論

類胰島素樣生長(zhǎng)因子是位于生物GH-IGFs生長(zhǎng)軸下游的關(guān)鍵因子，介導(dǎo)生長(zhǎng)激素發(fā)揮生物學(xué)功能[22]，類胰島素樣生長(zhǎng)因子主要由IGF-1和IGF-2組成。IGF-2也被稱為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素A，是胰島素家族的成員之一，具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和分化的作用，同時(shí)也與個(gè)體脂肪沉淀、生長(zhǎng)速度等生產(chǎn)性能關(guān)系密切[23]。本研究采用RACE技術(shù)，首次克隆獲得黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因的全長(zhǎng)序列，其全長(zhǎng)為1 736 bp，共編碼215個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的氨基酸序列與其他硬骨魚類相似性較高，而與兩棲類、哺乳類相似性較低，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與物種傳統(tǒng)分類學(xué)相一致，這說明IGF-2在硬骨魚類中進(jìn)化保守。IGF-2蛋白與IGF-1蛋白[18]一級(jí)結(jié)構(gòu)基本相同，均由信號(hào)肽、功能域和結(jié)構(gòu)域E組成。IGF-2功能域具有53個(gè)氨基酸，由B、C、A、D 4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成[24]，B、A結(jié)構(gòu)域分別與胰島素B鏈和A鏈同源[25]，C區(qū)與胰島素連接肽類似，這說明IGF-1、IGF-2和胰島素是由同一個(gè)祖蛋白進(jìn)化來的[26]。IGF-2含有3個(gè)由半胱氨酸形成的二硫鍵，使得IGF-2蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)得以維持。但是，目前相比于人、鼠等哺乳動(dòng)物，國(guó)內(nèi)外對(duì)硬骨魚類IGF-2基因的研究較少，后續(xù)仍需對(duì)魚類IGF-2基因功能及調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖3 黃鰭棘鯛和其他物種IGF-2基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of IGF-2gene amino acid sequence from Acanthopagrus latusand other species

本研究中觀察并記錄了黃鰭棘鯛胚胎發(fā)育23個(gè)時(shí)期的形態(tài)特征變化。黃鰭棘鯛受精卵具有典型硬骨魚類端黃卵的特性，呈圓球形，具有一個(gè)油球，其內(nèi)含中性脂肪，使受精卵不僅能儲(chǔ)藏養(yǎng)料，也能使卵子漂浮于水中。受精卵在鹽度28的海水中為懸浮性卵，卵裂方式為盤狀卵裂。胚胎發(fā)育主要經(jīng)歷5個(gè)時(shí)期，分別為卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期和器官形成期[27]。魚卵的直徑因物種不同而存在差異，魚卵直徑顯著影響其發(fā)育速度，一般魚卵直徑越大，發(fā)育速度越慢。將黃鰭棘鯛與幾種鱸形目暖水性海水魚類胚胎發(fā)育特征進(jìn)行比較[21,28-33]（表2），發(fā)現(xiàn)黃鰭棘鯛受精卵卵徑比軍曹魚（Rachycentron canadum）卵徑小，與3種鯛科魚類差距不大，比其余3種魚卵徑大，這與物種的種間差異具有一定的關(guān)系。相較于3種鯛科魚類，黃鰭棘鯛孵化時(shí)間短，我們猜想這與孵化溫度有一定關(guān)系[34]。本研究中黃鰭棘鯛在水溫（26.5±0.5）℃的情況下，經(jīng)25.5 h孵化為仔魚，這與鄭運(yùn)通等[12]觀察到黃鰭棘鯛受精卵在（21.6±0.5）℃下，30 h 35 min后孵化為仔魚情況有所差異，該結(jié)果也驗(yàn)證了我們所猜想的胚胎孵化與溫度具有一定的關(guān)系。

圖4 黃鰭棘鯛的胚胎發(fā)育Fig. 4 Embryonic development ofAcanthopagrus latus

胚胎發(fā)育涉及到各種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，是個(gè)體發(fā)育中的重要環(huán)節(jié)，本研究利用RT-PCR檢測(cè)了IGF-1和IGF-2基因在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的表達(dá)。結(jié)果顯示：IGF-1和IGF-2基因在黃鰭棘鯛的胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，IGF-1基因在肌肉效應(yīng)期高表達(dá)；相較于IGF-1基因，IGF-2基因在原腸期、肌肉效應(yīng)期以及出膜后3 d均有高表達(dá)。金錢魚IGF-1基因在卵裂期到出膜期的各個(gè)時(shí)期中均有表達(dá)[35]，大西洋鯛[5,36]也有著類似現(xiàn)象。通過向斑馬魚胚胎顯微注射IGF-1基因mRNA，相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚軀干生長(zhǎng)發(fā)育速度加快[1]。我們推測(cè)IGF-1基因可能在魚類胚胎發(fā)育過程中廣泛表達(dá)，促進(jìn)肌纖維細(xì)胞的增殖。黃鰭棘鯛I(yíng)GF-2基因直到原腸期才開始高表達(dá)，虹鱒卵裂期不表達(dá)[37]，斜帶石斑魚在桑葚期開始表達(dá)，隨后表達(dá)量持續(xù)升高[22]，這說明IGF-2基因在不同魚類早期胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)方式不同。White等[6]利用嗎啉反義寡核苷酸抑制斑馬魚胚胎發(fā)育期間IGF-2b基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IGF-2b基因缺失導(dǎo)致斑馬魚背側(cè)中線發(fā)育缺陷，同時(shí)也導(dǎo)致了腹側(cè)前腦發(fā)育缺陷，最終胚胎死亡，這說明IGF-2基因可能參與了腦部發(fā)育與肌細(xì)胞的增殖。IGF-2基因在原腸期高表達(dá)，這與金錢魚IGF-2基因表達(dá)相似[35]，我們認(rèn)為IGF-2基因可能在中胚層的形成中發(fā)揮作用。IGF-1和IGF-2基因在肌肉效應(yīng)期都出現(xiàn)高表達(dá)的現(xiàn)象，表示二者在胚胎發(fā)育過程中對(duì)肌細(xì)胞的增殖均發(fā)揮作用。IGF-1和IGF-2基因在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，但其在胚胎發(fā)育過程中是否具有協(xié)同作用及其調(diào)控的下游信號(hào)通路還需進(jìn)一步研究。

圖5 黃鰭棘鯛胚胎發(fā)育過程中IGF-1/IGF-2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 The relative expression of IGF-1/IGF-2genes mRNA in different embryo development stages ofAcanthopagrus latus

表2 海水魚類胚胎發(fā)育特征的比較Table 2 Comparison of embryonic developmental characteristics of marine fish