李茂森，王麗淵，楊波，劉福童，張勇江，任天寶*，張福建*

（1.河南農業(yè)大學∕河南省生物炭研究工程技術中心，鄭州 450002；2.生物炭技術河南省工程實驗室，鄭州 450002；3.江西省煙草公司宜春市公司，江西 宜春 336000；4.安徽中煙工業(yè)有限責任公司，合肥 230000）

生物炭是生物質在低氧條件下經高溫裂解而產生的一種性質穩(wěn)定的黑色富碳物質[1]。生物炭表面孔隙豐富，有較大的電荷密度和比表面積[2]。這些特殊的理化性質使生物炭可以作為優(yōu)秀的土壤改良劑[3]，生物炭可以改善土壤的理化性質及微生態(tài)環(huán)境，提高土壤礦化效率，進而提高土壤肥力[4]。此外，生物炭可以吸附土壤中的重金屬，改變土壤中重金屬的形態(tài)，減輕其對作物的毒害[5]。研究發(fā)現，施用生物炭可以有效提高土壤中速效鉀、有效磷等養(yǎng)分含量，提高土壤pH，改善土壤酸化現象[6-7]。另有研究表明，在土壤中持續(xù)添加生物炭數年，可以有效改善土壤結構，提高土壤孔隙度，降低土壤容重[8]。

微生物驅動土壤的物質循環(huán)，微生物種類不同，其生理、生化和生態(tài)特性也有顯著的差異，微生物群落的組成和結構對土壤中的物質循環(huán)有較大的影響[9]。反之，土壤的形態(tài)以及土壤中的養(yǎng)分等因素也會對微生物的群落組成產生一定的影響。生物炭表面具有發(fā)達的孔隙結構和較大的比表面積，對水肥有較好的吸收和保持能力，為微生物提供了絕佳的生存環(huán)境[10]。大量試驗表明，施加生物炭可以在不同程度上增加土壤中細菌、真菌和放線菌的數量。殷全玉等[11]連續(xù)4 年在煙地中施加生物炭，發(fā)現連續(xù)施用生物炭顯著改變了土壤真菌的群落結構，但對真菌OTU數量和α多樣性指數沒有顯著影響。閻海濤等[12]研究發(fā)現，施加生物炭提高了子囊菌門和擔子菌門的相對豐度，降低了接合菌門的相對豐度。真菌是土壤微生物的重要組成部分，在土壤物質循環(huán)、能量傳遞、抑菌殺蟲、防治土傳病害等方面具有不同的作用和特性。研究發(fā)現，真菌是土壤中最主要的一類病原物，70%左右的植物侵染性病害都是由真菌引起[13]，如鐮刀菌可通過侵染煙草根系，破壞煙草根系的維管束組織，從而引發(fā)煙草根黑腐病[14]，黑腐病在煙草種植中的危害日益嚴重，已經成為重要土傳病害[15]。另外，真菌在土壤物質循環(huán)和抑菌殺蟲等方面也發(fā)揮著重要作用：枯草芽孢桿菌是一種常見的益生菌，廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，多用于作物的病害防治[16]；漆斑菌廣泛存在于植物和土壤中，具有極強的纖維素分解能力，同時還能夠產生抗生素。這些真菌的存在對土壤微生態(tài)的自我修復或化學營養(yǎng)環(huán)境的改善具有重要作用[17]。因此，加強對土壤微生物，尤其是真菌群落結構調控技術研究有利于我國農業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。

近些年來，關于生物炭對植煙土壤微生物多樣性的影響已有較多的研究，但大多數研究圍繞生物炭對細菌或真菌多樣性和群落結構的影響，而對于土壤微生物菌群尤其是真菌類群的功能分析相對較少，本試驗采用高通量測序技術結合FUNGuid分析方法，在研究生物炭對烤煙根際真菌群落結構影響的基礎上，進一步探究生物炭對植煙土壤真菌功能類群的影響，以期為植煙土壤微生態(tài)調控提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2020 年在江西宜春上高煙區(qū)進行，該煙區(qū)實行煙稻輪作制，植煙土壤均為砂壤土。土壤基本理化性質：土壤pH 為5.52，有機質含量為13.40 g·kg-1，堿解氮為97.25 mg·kg-1，有效磷為25.54 mg·kg-1，速效鉀為105.40 mg·kg-1。生物炭原料為花生殼，在低氧環(huán)境下經380～400 ℃持續(xù)炭化20 min 制得，其基本理化性質如表1所示。

表1 供試生物炭理化性質Table 1 Physicochemical properties of the biochar

1.2 試驗設計

試驗采用隨機區(qū)組設計，共設置2 個處理（CK 和T），每個處理設置3個重復，每小區(qū)長20 m、寬5 m，試驗總面積0.06 hm2。CK 處理：常規(guī)施肥（煙草專用肥270 kg·hm-2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶1∶3，硫酸鉀225 kg·hm-2，鈣鎂磷肥112.5 kg·hm-2），T 處理：750 kg·hm-2生物炭+常規(guī)施肥。2020 年4 月23 日之前將生物炭施入煙田，生物炭和常規(guī)肥料作為基肥一次性施入植煙土壤，施肥方式為條施。各處理的移栽方法、水肥管理、農事操作與當地大田一致。

1.3 測定方法

1.3.1 供試土壤與樣品采集

烤煙生長到成熟期第75 天時，采用5 點取樣法，每個處理確定5 個取樣點，用鏟子將煙株根際周圍的土壤挖至30 cm 的深度，切割土壤中煙株的任何側根，挖出煙株整個根部。將根球放入盆中，搖動根部并用鏟子收集土壤，收集完成后混勻并分為3 部分：一部分保存在10 mL 無菌離心管中，用干冰保存送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行微生物多樣性檢測；一部分于4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物量的檢測；最后一部分在陰涼處自然風干后研磨，分別過0.85、0.25 mm 和0.15 mm 篩后于陰涼處保存，用于土壤理化性質分析。

1.3.2 土壤理化指標及養(yǎng)分測定

參考《土壤農業(yè)化學分析方法》[18]對土壤理化性質進行測定，每個樣點做3 個平行組。pH 的測定用超純水作浸提劑，按照土水比為1∶2.5的比例浸提，用精密pH 計（型號：IS128C）直接測定；堿解氮（AN）采用堿解擴散法測定；土壤速效鉀（AK）采用火焰光度計法測定；土壤有效磷（AP）采用碳酸氫鈉浸提法測定；微生物量碳（MBC）、微生物量氮（MBN）采用氯仿熏蒸-硫酸鉀浸提法測定。

1.3.3 土壤真菌檢測

土壤DNA 提取和PCR 擴增：使用E.Z.N.A.?soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，美國）對土壤DNA進行提取，利用NanoDrop2000 超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）對DNA 的純度進行檢測；檢測合格后，以稀釋后的基因組DNA 為模板，引物采 用18S SSU0817F（5′ -TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和1196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）進行PCR 擴增。為了確保擴增效率和準確性，PCR 產物使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后作為二輪PCR 模板，并進行二輪PCR擴增，再次使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后對PCR 產物進行Qubit 定量。根據PCR 產物濃度進行等量混樣，之后上機測序。

1.3.4 農藝性狀及烤后煙葉化學成分測定

在煙葉移栽后65、85 d 和105 d 的兩個處理中各選取10 株烤煙，分別測量煙株的株高、莖圍、中部葉葉長和葉寬，煙株莖圍選取煙株自上而下第5、10、15片葉處測定，取平均值。中部葉葉長、葉寬選煙株自上而下第10 片葉進行測量。烘烤結束后，選取兩個處理的B2F等級煙葉各0.5 kg，總糖、還原糖、總氮、煙堿、鉀元素、氯元素和蛋白質分別參照煙草行業(yè)標準YC∕T 159—2002、YC∕T 160—2002、YC∕T 161—2002、YC∕T 166—2002、YC∕T 166—2002、YC∕T 160—2002和YC∕T 166—2003 進行測定，每個處理重復3 次。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2016 對數據進行整理，方差分析采用最小顯著性差異法，用SPSS 22.0 軟件處理數據，樣本間群落組成差異采用非度量多維尺度法（NMDS）進行分析，用R 語言軟件的Vegan 包進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 生物炭對烤煙農藝性狀的影響

由表2 可知，添加生物炭后煙株株高和中部葉葉寬在移栽后65、105 d均大于對照處理，且差異均達到顯著性水平（P＜0.05），株高在三個時期各提高了3.32%、0.35%和2.34%，生物炭處理煙株中部葉葉寬較對照分別提高了4.28%、4.79%和5.48%。添加生物炭處理莖圍與對照組無顯著差異（P＞0.05）。生物炭處理在移栽后65 d和105 d中部葉葉長較對照顯著提高2.33%和1.71%。以上結果表明施用生物炭有利于煙株生長。

表2 煙株不同生育時期農藝性狀指標Table 2 Agronomic traits of tobacco at different growth stages

2.2 生物炭對土壤養(yǎng)分的影響

由表3可知，與CK相比，施加生物炭的土壤pH升高了0.52個單位，與CK 存在顯著差異（P＜0.05）；土壤堿解氮含量與CK 無顯著差異（P＞0.05）；生物炭處理速效鉀、有效磷和有機碳含量較CK 處理分別提高了11.14%、7.90%和11.76%，且均與CK存在顯著差異（P＜0.05）。這說明添加生物炭可以顯著提高土壤速效養(yǎng)分含量，并有效改善土壤的酸化現象。

表3 生物炭對土壤養(yǎng)分的影響Table 3 Effects of biochar on soil nutrients

2.3 生物炭對真菌α多樣性的影響

對6個樣本的真菌進行檢測，共得到真菌24個門類，99個科類，114個屬類，測得有效序列（Sequences）259 848 條。對所有序列進行聚類后得知，CK 和T 處理的樣本平均OTU 數分別為170 和166，對照和施加生物炭處理的OTU 數差異不大（圖1）。如表4 所示，施加生物炭后ACE 指數和超指數降低，香農指數升高，說明生物炭對土壤真菌多樣性具有一定的影響。樣品測序覆蓋度分別達到99.92%和99.95%，表明樣品測序深度足夠，滿足后續(xù)分析要求。

表4 真菌群落測序順序和α多樣性Table 4 Sequencing result of fungal communities α diversity

圖1 土壤真菌群落OTU數Figure 1 OTU number of soil fungal community

2.4 生物炭對真菌群落結構的影響

2.4.1 生物炭對門水平上真菌相對豐度的影響

由圖2 可以看出，在所有樣本門水平上優(yōu)勢真菌為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）、一種未分類SAR超類群（SAR-k-NORANK）和一種未分類的真菌類群（Unclassified-k-Fungi），其相對豐度之和占所有可注釋真菌的90%以上，相對豐度分別為81.21%～87.37%、2.69%～8.60%、0.83%～5.19% 和1.44%～3.70%。

圖2 門水平上真菌相對豐度Figure 2 Relative abundance of fungi at phylum level

對施加生物炭處理和對照土壤樣品中真菌群落的相對豐度進行T檢驗，結果如圖3 所示。與對照相比，施加生物炭降低了子囊菌門和一種未分類的SAR超類群的相對豐度，分別降低了1.20%和63.88%；同時提高了毛霉菌門、擔子菌門和一種未分類的真菌類群，升幅分別達到54.02%、31.49%和38.63%。

圖3 門水平上真菌相對豐度差異Figure 3 Relative abundance differences of fungi at phylum level

2.4.2 生物炭對土壤真菌β多樣性的影響

如圖4所示，基于OTU 水平的非度量多維尺度分析結果表明，在NMDS1軸上，生物炭添加后土壤樣本與對照組真菌群落明顯分離，說明添加生物炭可以影響土壤的真菌群落。

圖4 基于非度量多維尺度（NMDS）土壤真菌群落分析Figure 4 Analysis of soil fungal community based on NMDS

2.4.3 生物炭對真菌功能類群的影響

從圖5 中可以看出，土壤中可鑒定真菌共分6 種營養(yǎng)類型。其中病理-腐生-共生過渡型真菌豐度在CK 和T 處理中占比均為最高，分別為34.21%和33.50%。添加生物炭使土壤病理營養(yǎng)型真菌豐度較對照下降了62.07%，腐生營養(yǎng)型真菌豐度提高了69.80%，說明生物炭對土壤的物質循環(huán)和病害防治具有一定的促進作用。

圖5 真菌營養(yǎng)類型組成的相對豐度Figure 5 Relative abundance of nutrient types of fungi

由圖6 可知，已鑒定出的土壤功能真菌優(yōu)勢類群為動物病原菌-內生菌-地衣寄生菌-植物病原菌-土壤腐生菌-木質腐生真菌、動物病原菌-糞腐生物-內生菌-表生菌-植物腐生菌-木質腐生真菌、一種未分類的腐生菌和動物病原菌-內生菌-地衣寄生菌-植物病原菌-木質腐生真菌，其平均豐度分別占優(yōu)勢OTU 的28.31%、17.26%、12.22%和6.65%。添加生物炭后動物病原菌-內生菌-地衣寄生菌-植物病原菌-土壤腐生菌-木質腐生真菌和一種未分類的腐生菌類群豐度較CK 處理分別升高了37.15%和64.38%，動物病原菌-糞腐生物-內生菌-表生菌-植物腐生菌-木質腐生真菌和動物病原菌-內生菌-地衣寄生菌-植物病原菌-木質腐生真菌類群豐度分別下降了32.70%和58.89%。

圖6 基于OTUs的真菌功能類群Figure 6 Functional groups of fungi based on OTUs

2.5 生物炭施用對煙葉常規(guī)化學成分的影響

試驗比較分析了兩個處理中B2F 等級烤后煙葉樣品的常規(guī)化學成分，由表5 可知，生物炭處理的煙葉總糖、還原糖、鉀含量較對照處理均有顯著增加，分別增加16.47%、10.82%和11.78%（P＜0.05）；生物炭對煙堿、氯、總氮和蛋白質的影響均未達到顯著水平（P＞0.05）。煙葉中的氯離子含量較對照組略微下降，鉀氯比明顯提高了13.31%。施加生物炭后，總糖和還原糖含量均有所增加，但總糖增幅較大，兩糖比下降了4.44%。

表5 生物炭施用對烤后煙常規(guī)化學成分的影響Table 5 Effects of biochar on conventional chemical components of flue-cured tobacco

3 討論

3.1 生物炭對植煙土壤養(yǎng)分的影響

生物炭能夠改良土壤，使土壤更有利于植物生長[19]。本試驗結果表明，施加生物炭顯著提高了土壤pH 值，這是由于生物炭在自然條件下呈堿性，pH 值一般為7.0～10.5[20]，施加到土壤后可以提升土壤的pH值，使煙株在適宜的pH 條件下生長發(fā)育，朱盼等[21]研究發(fā)現，施加生物炭和石灰均能提高土壤的pH 值。氮素是影響植株生長發(fā)育的關鍵元素，直接決定作物的產量，生物炭能夠保持土壤水分并且提升土壤的固氮能力，降低氮素流失。

本研究發(fā)現，施加生物炭可以顯著提高土壤有效磷含量，與劉卉等[22]的研究結果一致，這是由于生物炭能通過影響土壤中的陽離子活性或者改變微生物活性間接影響磷素的有效性和可吸附性[23]，并且生物炭還能有效促進土壤微生物對土壤磷素的溶解、礦化及固持作用，從而提高土壤中有效磷含量[24]。施用生物炭能提高土壤有機碳水平，而有機碳能夠降低土壤固鉀能力，使土壤中鉀元素的有效性提升，同時施用生物炭能夠提高土壤溫度，使土壤中緩效鉀的釋放量增多，并能提高速效鉀含量[25]。

3.2 生物炭對土壤真菌群落結構及功能類群的影響

施加生物炭可以改變土壤環(huán)境，進而促進微生物群落組成和結構的改變[26]。本試驗結果表明，施加生物炭后，土壤真菌OTU數和α多樣性指數較對照沒有顯著變化，這與殷全玉等[11]和閻海濤等[12]的研究結果一致，可能是由于真菌在土壤中大多為分解者，而生物炭是一種極難分解的惰性碳，真菌在短時間內無法有效地分解利用生物炭[27]。本研究發(fā)現土壤中門水平上優(yōu)勢真菌為子囊菌門、毛霉菌門及一種未分類的SAR 超類群，這與前人的研究結果相似[28-29]。施加生物炭后，毛霉菌門、擔子菌門和一種未分類的真菌類群的群落相對豐度有所提高。毛霉菌是一種廣泛存在于自然界的腐生真菌，分解蛋白質的能力較強，毛霉菌門豐度的增加有利于土壤蛋白質的循環(huán)[30]。子囊菌門是土壤中存在的豐度最高的真菌，子囊菌在土壤中以腐生、寄生和共生的營養(yǎng)方式生存，可以分解動植物殘體，部分子囊菌也會導致植物發(fā)生根腐、莖腐、枝枯和葉斑等[31]。本試驗中，施加生物炭后，子囊菌門豐度有略微下降，這可能是由于其他真菌類群與之產生競爭。

與細菌相比，真菌擁有更為復雜的生活史，在土壤中以多種方式吸收營養(yǎng)，土壤環(huán)境發(fā)生變化時，部分真菌會迅速改變自身的營養(yǎng)方式，以對抗因環(huán)境變化帶來的不利影響，這是一種較為高級的生存策略[32]。腐生真菌可以分解植物殘體、動物糞便等有機質，使其能夠被植物吸收利用[33]。本研究發(fā)現，施加生物炭后，土壤中病理營養(yǎng)型真菌豐度降低，而腐生營養(yǎng)型真菌豐度增加，說明施用生物炭增強了土壤真菌的分解能力，更有利于作物吸收土壤中營養(yǎng)物質，促進煙株的生長發(fā)育。同時病理營養(yǎng)型真菌豐度下降，降低了煙草的病害風險，減少了經濟損失。

非度量多維尺度分析結果表明，施加生物炭后，土壤真菌群落結構會產生一系列的變化，與對照表現出明顯的分離，這與陳坤等[34]的研究結果一致。生物炭對土壤微生物既有直接作用又有間接作用：一方面，生物炭豐富的孔隙結構為微生物的生長提供了極佳的條件，直接影響了微生物群落結構；另一方面，生物炭的施加影響了土壤的養(yǎng)分狀況，進而對微生物的群落結構產生一定的影響。

4 結論

（1）生物炭的施加顯著提高了煙株的株高、葉長、葉寬，使烤后煙葉總糖、還原糖和鉀離子含量顯著增加（P＜0.05）?？傮w而言，施加生物炭對煙葉的品質具有一定的提高作用。

（2）施加生物炭后，植煙土壤的速效養(yǎng)分含量提高，烤煙根際土壤酸化現象得到改善。

（3）生物炭改變了植煙土壤真菌的群落結構，提高了毛霉菌門、擔子菌門的相對豐度，降低了子囊菌門相對豐度。

（4）施加生物炭降低了植煙土壤病理營養(yǎng)型真菌豐度，提高了腐生營養(yǎng)型真菌豐度。

本試驗探究了生物炭對植煙土壤真菌群落結構以及功能類群的影響，為烤煙根際微生態(tài)調控及煙草栽培提供一定的理論依據。