胡潤鋒，李浚哲，李鵬飛，周 軍，李湘洲

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.廣西民族大學(xué)a.廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點實驗室；b.廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530006）

桑Morus alba是桑科、桑屬落葉喬木或灌木，廣泛分布在溫帶、亞熱帶、熱帶等氣候地區(qū)。我國是世界上最大的種桑國，已有4000 多年的桑栽培史。桑葉為植物桑的干燥葉，又名鐵扇子，神仙葉?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑葉因含黃酮、生物堿、甾醇、γ-氨基丁酸、多糖等多種天然活性成分[1-2]，使其具有降血糖[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]等多種生物活性，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及保健行業(yè)[7-8]。2002年，我國就將桑葉列為藥食同源。

硒是維持人體正常生理活動所必需的18 種微量元素之一，它在維持機(jī)體正常功能和健康方面有著不可或缺的地位[9]。研究表明，硒元素可增強體內(nèi)抗氧化能力、降低癌癥風(fēng)險、提高機(jī)體免疫力，而硒元素的缺乏也與肝損傷，心血管疾病，癌癥和衰老等有關(guān)[10-11]。因此，對于缺硒人群來說，硒元素的補充尤為重要。硒化合物按照硒元素的形態(tài)可分為有機(jī)硒化合物（硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白）和無機(jī)硒化合物（硒酸鹽、亞硒酸鹽），相比于無機(jī)硒化合物，有機(jī)硒化合物具有生物利用度高和生物毒性低等特點，更適合用于補充人體的硒元素，其中富硒多糖便是一種理想的補硒制劑[12]。硒多糖可分為天然硒多糖和人工合成硒多糖。天然硒多糖主要存在于富硒土壤中生長的植物內(nèi)以及用富硒培養(yǎng)基培養(yǎng)的微生物內(nèi)[13-15]，但由于富硒土壤分布不均勻以及植物和微生物的富硒能力有限，導(dǎo)致天然富硒產(chǎn)品產(chǎn)量少且硒多糖含量較低[16]。人工合成硒多糖是由天然多糖和無機(jī)硒化合物合成得到的，相比于天然硒多糖，具有原料來源豐富且硒含量高的特點，兼具多糖和硒元素兩者的生物活性[17-18]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者利用天然多糖和無機(jī)硒化物反應(yīng)成功制備出各種富硒多糖，不僅保留甚至提高了天然多糖原有的生物活性，同時也增加了硒元素獨特的的生物活性，且毒副作用大大降低。Yuan 等[19]利用微波輔助技術(shù)合成的硒化甘薯多糖可以顯著提高甘薯多糖的體外抗氧化、體內(nèi)抗腫瘤、降血糖活性。Huang 等[20]合成的硒化黃芪多糖提高了黃芪多糖的清除自由基和抑制腎結(jié)石的活性。Liu 等[21]合成的硒化梭柄乳頭菌多糖的降血糖、降血脂活性明顯提高。目前，將硒元素引入桑葉多糖以提高桑葉多糖的生物活性還未見過報道。

桑葉多糖作為桑葉的主要活性成分之一，具有降血糖、抗氧化、抗凝血等生物活性[22-23]，而硒元素同樣具有顯著的抗氧化活性，將兩者結(jié)合能否提高桑葉多糖的抗氧化活性有待探究。值得注意的是，在硒化多糖改性過程中，反應(yīng)條件能對多糖的硒含量造成較大的影響，而硒含量能直接影響到硒化多糖的生物活性，因此對天然多糖的硒化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化具有重要意義?；诖?，本研究以桑葉多糖為原料，硒含量為考察指標(biāo)，利用HNO3-Na2SeO3法制備硒化桑葉多糖，在單因素實驗的基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法優(yōu)化硒化桑葉多糖的制備工藝，并對比研究硒化前后桑葉多糖的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和體外抗氧化活性的差異，為桑葉中多糖類化合物在功能性食品和藥物等領(lǐng)域的開發(fā)與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干桑葉，產(chǎn)自湖南永州；亞硒酸鈉，西隴科學(xué)股份有限公司；氯化鋇、無水硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、無水乙醇、丙酮、乙醚、高氯酸、硝酸、鹽酸、鄰苯二胺、氨水、甲苯，溴化鉀均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；S-8 大孔樹脂、聚酰胺樹脂，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料公司。

DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；WB-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TG16-WS 離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司；DK-98-Ⅱ電爐，天津市天泰有限公司；Zeiss Sigma 300 掃描電子顯微鏡，卡爾·蔡司股份公司；Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Zetasizernano 納米粒度及zeta 電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；ALPHA 傅里葉變換紅外光譜儀，布魯克公司；UV2300-Ⅱ系列雙光束紫外可見分光光度計，上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MLP-Se 的合成

利用水提醇沉法提取桑葉多糖[24]。稱取一定量粉碎烘干后的桑葉粉，按照固液比1∶20（g·mL-1）加入無水乙醇，80℃回流2 h 后過濾，濾渣60℃烘干得到脫脂桑葉粉。稱取一定量脫脂桑葉粉，按照固液比1∶20（g·mL-1）加入去離子水，80℃回流提取2 h，離心，取上清液。依次用聚酰胺樹脂和S-8 大孔樹脂動態(tài)吸附法除去提取液中蛋白和色素，濃縮后加入4 倍體積的無水乙醇，5℃下靜置24 h，過濾，沉淀依次分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3 次，冷凍干燥得到桑葉多糖，命名為MLP。

利用HNO3-Na2SeO3法對MLP進(jìn)行硒化改性。稱取300 mg 的MLP 置于錐形瓶內(nèi)，加入50 mL一定質(zhì)量濃度的HNO3，加熱使其充分溶解，加入一定量的Na2SeO3與700 mg 的BaCl2，水浴加熱攪拌反應(yīng)一定時間。反應(yīng)結(jié)束后使其冷卻，調(diào)節(jié)pH 值至7 左右，加入一定量的Na2SO4以除去BaCl2，離心取上清液置于透析袋中透析72 h，濃縮、凍干后得到硒化桑葉多糖，命名為MLP-Se。桑葉多糖硒化的反應(yīng)方程式見圖1。

圖1 桑葉多糖硒化的反應(yīng)方程式Fig.1 Reaction equation of selenization of mulberry leaves polysaccharides

1.2.2 硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及測定

采用鄰苯二胺法測定MLP-Se 中的硒含量[25]。用Na2SeO3配置一系列質(zhì)量濃度梯度的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容至25 mL，加入2 mL 質(zhì)量濃度2%的鄰苯二胺溶液，暗處反應(yīng)1 h，加入10 mL 甲苯，振蕩萃取5 min，收集上層甲苯層溶液，以甲苯作為參比溶液，在波長334 nm 的紫外分光光度計中測定并得到吸光度值。以硒的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.307 3X+0.009 3(R2=0.998 0)。

MLP-Se 消化過程如下：稱取10 mg MLP-Se置于燒杯內(nèi)，加入5 mL 混合酸（HClO4∶H2SO4∶HNO3=1∶1∶4，v/v/v），浸泡3 h，待MLP-Se 完全溶解，加熱消化使溶液體積蒸發(fā)至約1 mL。待消化液冷卻后加入5 mL 的6 mol·L-1鹽酸繼續(xù)加熱30 min 以上并不再沸騰時，停止加熱使Se(VI)還原為Se(IV)，加熱過程中防止暴沸。溶液冷卻后轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，加入2 mL 2%的鄰苯二胺溶液和5%的EDTA-2Na 溶液，用氨水調(diào)節(jié)pH值至2.0，置于暗處反應(yīng)1 h，后續(xù)操作按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，得到吸光度值并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算硒含量。

1.2.3 單因素實驗

按照MLP-Se 的合成方法，分別考察反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比和HNO3的體積分?jǐn)?shù)對制備的MLP-Se 中Se 含量的影響。其中，在Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比1.2、HNO3體積分?jǐn)?shù)0.5%和反應(yīng)溫度70℃的條件下，考察反應(yīng)時間分別為5、6、7、8、9 h 對MLP-Se 中Se 含量的影響；在HNO3體積分?jǐn)?shù)0.5%、反應(yīng)溫度80℃和反應(yīng)時間7 h 的條件下，考察Na2SeO3與MLP的質(zhì)量比分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 對MLPSe 中Se 含量的影響；在Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比1.2、反應(yīng)溫度80℃和反應(yīng)時間7 h 的條件下，考察HNO3體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9% 對MLP-Se 中Se 含量的影響；在Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比1.2、HNO3體積分?jǐn)?shù)0.5%和反應(yīng)時間7 h 的條件下，考察反應(yīng)溫度分別為50、60、70、80、90 ℃對MLP-Se 中Se 含量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，固定反應(yīng)時間7 h，進(jìn)一步優(yōu)化Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比、HNO3的體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度對MLP-Se 合成的影響，采用三因素三水平的Box-Behnken 方法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計（表1）。

表1 Box-Behnken 設(shè)計因素水平及編碼值Table 1 Design factor level and code value of Box-Benhnken

1.2.5 掃描電鏡-能譜分析

分別取干燥的MLP 和MLP-Se，粘附到碳導(dǎo)電介質(zhì)板上鍍金。噴金后將樣品置于掃描電鏡下室溫掃描，觀察硒化前后多糖的表面形貌，并利用EDS 分析儀進(jìn)行元素分析。

1.2.6 凝膠色譜分析

采用凝膠色譜法測定MLP 和MLP-Se 的分子量[26]。色譜條件：Agilent 1260 Infinity 高效液相色譜儀，PL aquagel-OH（8.0×300 mm，8 μm）柱，示差折光器（RID），柱溫35℃，流動相為0.1 M的NaCl 溶液，流速0.6 mL·min-1，進(jìn)樣20 μL。

以分子量3 000～200×105Da 的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時間為橫坐標(biāo)，分子量的對數(shù)值（lgMw）為縱坐標(biāo)作圖，得到多糖分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-0.430 4X+9.910 7(R2=0.999 6)。將樣品的色譜分析結(jié)果中的保留時間帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的分子量。

1.2.7 粒徑和zeta 電位分析

取適量MLP 和MLP-Se 溶于水中，配置成濃度為0.1 mg·mL-1的多糖溶液，在25℃的條件下，測量多糖樣品的電勢和粒徑分布。

1.2.8 紅外光譜分析

利用KBr 壓片法對MLP 和MLP-Se 進(jìn)行壓片制樣，樣品在紅外光譜下掃描，掃描頻率64 Hz，掃描32 次，掃描范圍400～4 000 cm-1。

1.2.9 清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力的測定

取2 mL 不同濃度的樣品溶液分別加入2 mL 0.2 mmol·L-1DPPH-乙醇溶液，混合均勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，離心，取上清液于517 nm 處檢測其吸光度值，以相應(yīng)的乙醇溶液為對照。DPPH自由基清除率的計算公式為：

式（1）中：D為DPPH 自由基清除率，Ai是樣品與DPPH 反應(yīng)后的吸光度，Aj是無水乙醇代替DPPH 的吸光度，A0是蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.10 清除2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基能力的測定

將7.0 mmol·L-1的ABTS 溶液 與5.0 mmol·L-1的過硫酸鉀溶液等體積混合，避光室溫放置12 h后，加蒸餾水稀釋50 倍，使其在波長734 nm 處吸光度為0.70±0.02。取0.5 mL 不同濃度的樣品溶液，加4.0 mL 稀釋后的ABTS 溶液，室溫避光反應(yīng)6 min，在734 nm 處測其吸光度，以相應(yīng)蒸餾水為對照。ABTS 自由基清除率的計算公式為：

式（2）中：Abt為ABTS 自由基清除率，Ai是樣品與ABTS 反應(yīng)后的吸光度，Aj是蒸餾水代替ABTS的吸光度，A0是蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)用3 次獨立重復(fù)實驗結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著，采用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

按照1.2.3 中所述方法分別考察了反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比和HNO3體積分?jǐn)?shù)對MLP-Se 中硒含量的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2a 可知，隨著反應(yīng)時間的延長，MLP-Se的硒含量先增大后減小，反應(yīng)時間為7 h 時的硒含量達(dá)到最大值為2.08±0.06 mg·g-1。因此選擇反應(yīng)時間為7 h。由圖2b 可知，隨著反應(yīng)溫度的增大，MLP-Se 的硒含量先增大后減小，當(dāng)反應(yīng)溫度為80℃時，硒含量達(dá)到最大值為2.83±0.07 mg·g-1，繼續(xù)增大反應(yīng)溫度，硒含量開始減小，原因在于高溫能激活反應(yīng)位點，有利于硒化反應(yīng)的進(jìn)行，但過高的溫度可能會導(dǎo)致部分多糖鏈斷裂以及有機(jī)硒穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)被破壞造成的[27]。由圖2c 可知，隨著HNO3體積分?jǐn)?shù)的增大，MLP-Se 的硒含量先增大后減小，當(dāng)HNO3體積分?jǐn)?shù)為0.5%時，硒含量達(dá)到最大值為2.85±0.05 mg·g-1，繼續(xù)增大HNO3體積分?jǐn)?shù)，硒含量開始減小，原因可能是因為在合適的酸性條件下，糖苷鍵的部分?jǐn)嗔驯┞冻龈嗟奈磻?yīng)位點，但反應(yīng)體系酸性環(huán)境過大將導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞[28]。由圖2d 可知，隨著Na2SeO3與MLP 質(zhì)量比的增大，MLP-Se 的硒含量先增大后減小，在質(zhì)量比值為1.2 時，硒含量達(dá)到最大值為2.84±0.08 mg·g-1，質(zhì)量比繼續(xù)增大，硒含量開始減小，原因可能是飽和結(jié)合位點導(dǎo)致的非特異性吸收有關(guān)[27]。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

按照表1的響應(yīng)面試驗設(shè)計進(jìn)行實驗，得到實驗結(jié)果見表2。

以硒含量為響應(yīng)值，利用Design-Expert 10.0.7軟件，將表2中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到二次多項式回歸方程：Y=-41.91+4.51A+0.38B+3 0.25C+0.18AB+4.92AC+0.03BC-8.75A2-0.003B2-6.04C2，并對此設(shè)計的模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，模型中A、B、C、A2、B2、C2項均為極顯著（P＜0.01）。根據(jù)F值可知，各因素對桑葉多糖的硒含量影響大小順序為：C（HNO3體積分?jǐn)?shù)）＞B（反應(yīng)溫度）＞A（Na2SeO3與MLP 質(zhì)量比）。試驗所建立的模型（P＜0.01）為極顯著，失擬項（P＞0.05）為不顯著，說明所建立的響應(yīng)面模型用來優(yōu)化MLP-Se 制備的最佳工藝條件是可行的。信噪比36.695＞4，說明該模型可預(yù)測試驗結(jié)果，而修正判定系數(shù)RAdj=0.989 0，表示可以用此模型來預(yù)測98.9%的響應(yīng)值。判定系數(shù)R2Pred=0.956 8，說明此模型擬合程度良好，可以利用模型來分析和預(yù)測制備的MLP-Se 的硒含量值，R2Pred=0.956 8 與R2=0.995 2 的值接近，說明該響應(yīng)面設(shè)計合理。

經(jīng)過Design-Expert 軟件計算獲得制備MLPSe 的響應(yīng)面優(yōu)化工藝為：Na2SeO3與MLP 的質(zhì)量比1.268，HNO3的體積分?jǐn)?shù)0.54%，反應(yīng)溫度84.98 ℃，此條件下的硒含量的預(yù)測值為3.158 mg·g-1。驗證實驗中，在質(zhì)量比MLP 與Na2SeO3的1.27、反應(yīng)溫度85℃、HNO3體積分?jǐn)?shù)0.54%的條件下，5 次平行實驗制備的MLP-Se 中硒含量的實際平均值為3.147 mg·g-1。實驗值與預(yù)測值接近，表明響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計合理、可靠。

2.3 掃描電鏡-能譜分析

圖3a—c 分別為MLP 和MLP-Se 的掃描電鏡及MLP-Se 的能譜分析結(jié)果。由圖3a 可知，MLP表面整體比較光滑，且存在不規(guī)則的、致密的溝壑，這可能是由于樣品經(jīng)冷凍干燥后水分的升華而導(dǎo)致開裂，而圖3b 中MLP-Se 的表面凹凸不平，主要以無定形的結(jié)構(gòu)聚集存在，表明硒化修飾改變了桑葉多糖的表觀形貌。MLP-Se 的能譜分析表明C、O、Se 原子比分別為45.34%、54.07%、0.59%，Se 元素的存在表明硒化修飾的成功。

圖3 MLP（a）、MLP-Se（b）的掃描電鏡和MLP-Se 的能譜分析（c）Fig.3 Analysis of SEM of MLP(a),MLP-Se(b) and EDS of MLP-Se (c)

2.4 凝膠色譜分析

MLP 和MLP-Se 樣品的凝膠色譜分析結(jié)果見圖4。MLP 和MLP-Se 的保留時間分別為8.338和8.209 min，相對分子質(zhì)量分別為2.099×103和2.385×103kDa，表明MLP 經(jīng)硒化修飾后，其分子量有所增大，這是由于硒化反應(yīng)過程中含硒官能團(tuán)取代了原多糖分子中的羥基所致。

圖4 MLP（a）和MLP-Se（b）的GPC 分析Fig.4 GPC analysis of MLP(a) and MLP-Se(b)

2.5 粒徑和zeta 電位分析

多糖的流體力學(xué)性質(zhì)如電勢電位和粒徑分布可以在一定程度上反映其穩(wěn)定性，一般來說，多糖分子的粒徑越小、zeta 電位的絕對值越大，說明多糖分子在體系中越容易分散或溶解，反之則多糖分子越容易聚集。圖5為0.1 mg·mL-1的MLP和MLP-Se 溶液的粒徑分布和zeta 電位分析結(jié)果，圖5a 中MLP-Se 分子的平均直徑（33.68 nm）小于MLP 分子的平均直徑（168.0 nm），圖5b 中MLP 和MLP-Se 均帶負(fù)電荷，而MLP-Se 的zeta電位的絕對值（20.4 mV）大于MLP 的zeta 電位的絕對值（14.5 mV），說明硒化修飾后提高了桑葉多糖在溶液體系中的穩(wěn)定性。

圖5 MLP 和MLP-Se 的粒徑分析（a）和zeta 電位（b）Fig.5 The particle size(a) and zeta potential distribution(b) of MLP and MLP-Se

2.6 紅外光譜分析

MLP 和MLP-Se 的紅外光譜分析結(jié)果見圖6。由圖6可知，MLP 和MLP-Se 的譜圖整體相似，說明硒化修飾并不會破壞桑葉多糖的主要結(jié)構(gòu)。在3 400和2 920 cm-1處的特征吸收峰分別是由O-H的彎曲振動和C-H 的伸縮振動引起的。1 625 和1 425 cm-1處為羧基的特征吸收峰，說明了糖醛酸的存在。在1 000～1 200 cm-1處的重疊峰是吡喃環(huán)中C-O-C 和C-O-H 的伸縮振動峰，說明MLP主要以吡喃糖的形式存在。而MLP-Se 分別在609、822、920 和1 384 cm-1處產(chǎn)生了新的特征吸收峰，其中，609 cm-1歸因于Se-O-C 的不對稱伸縮振動，822 cm-1歸因于Se=O 伸縮振動，920 cm-1歸因于C-O-Se 的伸縮振動，1 384 cm-1為糖環(huán)上與Se=O 相鄰的C-H 特征吸收峰，說明MLP 經(jīng)HNO3-Na2SeO3法可以有效制備MLP-Se，且硒與多糖是通過C-O-Se 和Se=O 結(jié)合的。這與Wu 等[29]和Zhu 等[30]在硒化修飾多糖的研究結(jié)果一致。

圖6 MLP 和MLP-Se 紅外光譜分析Fig.6 FT-IR spectroscopy analysis of MLP and MLP-Se

2.7 DPPH 自由基清除能力測定

由圖7可知，MLP 和MLP-Se 對DPPH 自由基的清除率均表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，隨著樣品濃度的增加，DPPH 自由基清除率越高。在相同濃度下，MLP-Se 對DPPH 自由基清除率均明顯高于MLP（P＜0.05）。在濃度達(dá)到5 mg·mL-1時，MLP和MLP-Se 對DPPH 的清除率分別達(dá)到70.61%和86.71%，IC50值分別為2.15 和0.88 mg·mL-1，說明硒化修飾可以增加桑葉多糖對DPPH 自由基的清除效果。

圖7 MLP 和MLP-Se 對DPPH 自由基的清除能力Fig.7 Scavenging effects of MLP and MLP-Se on DPPH free radical

2.8 ABTS 自由基清除能力測定

由圖8可知，MLP 和MLP-Se 對ABTS 自由基的清除率均表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，隨著樣品濃度的增大，對ABTS 自由基的清除率越高。在相同濃度下，MLP-Se 對ABTS 自由基清除率的作用均高于MLP。在濃度達(dá)到5 mg·mL-1時，MLP和MLP-Se 對DPPH 的清除率分別達(dá)到80.50%和100%，IC50值分別為1.79 和0.68 mg·mL-1，說明硒化修飾可以增加桑葉多糖對ABTS 自由基清除率的作用。

圖8 MLP 和MLP-Se 對ABTS 自由基的清除效果Fig.8 Scavenging effects of MLP and MLP-Se on ABTS free radical

綜上所述，利用HNO3-Na2SeO3法對桑葉多糖進(jìn)行硒化改性，可以提高桑葉多糖的抗氧化活性。研究表明多糖的中羥基解離能較弱[31]，其易向自由基提供氫原子，因此多糖具有抗氧化活性，且活性的強弱直接和供氫能力相關(guān)，而硒多糖中硒基團(tuán)的存在可以激活正構(gòu)碳中的氫原子，從而增強其清除自由基的能力[32]。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

以水提醇沉、吸附法制備的桑葉多糖（MLP）為原料，利用HNO3-Na2SeO3法對其進(jìn)行硒化修飾制備硒化桑葉多糖（MLP-Se）。通過單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化并獲得了MLP-Se 的制備工藝為MLP與Na2SeO3的質(zhì)量比1.27，反應(yīng)溫度85℃，HNO3體積分?jǐn)?shù)0.54%，反應(yīng)時間7 h，此條件下制備的MLP-Se 中硒含量高達(dá)3.147 mg·g-1，建立的響應(yīng)面模型可靠。理化性質(zhì)與表觀結(jié)構(gòu)分析表明，桑葉多糖已被成功硒化，且硒與多糖是通過C-OSe 和Se=O 結(jié)合，此外，硒化修飾改變了桑葉多糖的表面形貌，增大了桑葉多糖分子量，提高桑葉多糖在溶液體系中的穩(wěn)定性。MLP-Se 對DPPH自由基和ABTS 自由基的IC50值分別為0.88 和0.68 mg·g-1，且明顯低于MLP，表明硒化改性制備的MLP-Se 的抗氧化能力更強。

3.2 討 論

將硒元素引入到桑葉多糖的分子結(jié)構(gòu)中，形成富硒的桑葉多糖，不僅提高了桑葉多糖復(fù)溶后的穩(wěn)定性，還有效提高了桑葉多糖原有的生物活性，為桑葉多糖的深加工開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)，也為類似天然多糖的研究與利用提供有益借鑒。通過能譜和紅外光譜分析可以初步表明硒元素已成功引入到多糖分子中，且硒與多糖是通過C-O-Se 和Se=O 的方式結(jié)合的，但由于尚未對MLP 和MLP-Se 進(jìn)行進(jìn)一步的分離富集，因而無法對多糖修飾前后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入解析。下一步可以在分離獲得純度較高的化合物的基礎(chǔ)上通過圓二色譜、核磁共振波譜等分析技術(shù)對MLP 和MLP-Se 的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入系統(tǒng)的分析，以便于更好地闡述其構(gòu)效關(guān)系。