黃 虎，楊志波，萬江波，陶 侃，郭莉莉，秦紫嫣，何彰華，毛必瑤

（1.上海上美化妝品股份有限公司，上海 200065；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，湖南 長沙 410005；3.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650106；4.湖南謳睿生物科技有限公司，湖南 長沙 410205）

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis）是最常見的慢性炎癥性皮膚病，病因復(fù)雜多樣，以皮膚敏感干燥、局部或播散性濕疹病變，且伴有嚴(yán)重的瘙癢感覺為其發(fā)病表型[1-3]。特應(yīng)性皮炎多數(shù)病例開始于嬰兒期和兒童期，成年期亦有發(fā)生，且越來越多的證據(jù)表明特應(yīng)性皮炎在成人中更為常見[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)[5，6]，青蒿素及其衍生物具有抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)的作用，對治療皮膚病具有良好效果。青蒿油（artemisia naphta oil，AN）作為青蒿素的副產(chǎn)物，也表現(xiàn)出了對痤瘡等皮膚病的抑制作用，在皮膚病外治方向具有廣闊的應(yīng)用前景[7]。因此，本研究擬探究AN對卡泊三醇誘導(dǎo)構(gòu)建的特應(yīng)性皮炎小鼠的干預(yù)作用及具體機(jī)制，旨在為延緩特應(yīng)性皮炎病情進(jìn)展提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 96只6周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠[湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證編號：430727210103183337，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，并通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵循國家動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 試劑 無菌無酶水、4%多聚甲醛、HE染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司），吐溫20、無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），卡泊三醇（上海源葉生物科技有限公司），酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司），AN（上海上美化妝品股份有限公司）。

1.2.2 AN的提取 將青蒿葉與石油醚加熱，過濾得到AN溶液，加熱溶液，蒸發(fā)去除溶液內(nèi)的石油醚。在100℃～110 ℃下蒸餾，獲得AN的粗產(chǎn)物。將AN的粗產(chǎn)物放入精煉罐中110 ℃加熱30 min后冷卻。在AN中加入硅膠，攪拌30 min后過濾脫色。

1.2.3 分組及模型構(gòu)建 96只C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為Control組、Model組、NC組、0.5% AN組、1.0% AN組、1.5% AN組、3.0% AN組、5.0% AN組，各12只。Control組不做任何處理，其余7組均用20 μl的50 nmol/ml卡泊三醇涂抹小鼠左耳，1次/2 d，持續(xù)使用2周，進(jìn)行特應(yīng)性皮炎模型構(gòu)建。此外NC組在造模期間噴涂吐溫水溶液1 ml，1次/d；而不同濃度的AN組則每天分別噴涂1 ml 0.5%、1.0%、1.5%、3.0%、5.0%的AN（換算成人體使用濃度依次為0.055%、0.11%、0.16%、0.3%和0.55%）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集小鼠耳部皮膚組織以及血清樣本，用于后續(xù)檢測。

1.3 觀察指標(biāo) 于干預(yù)2周后觀察小鼠耳部皮膚損傷、組織病理變化、相關(guān)炎癥因子水平。

1.3.1 小鼠耳部皮膚損傷 觀察各組小鼠左耳皮膚損傷變化，并用游標(biāo)卡尺對各組小鼠的左耳耳尖厚度進(jìn)行測量，觀察AN對特應(yīng)性皮炎小鼠的耳部皮膚組織的作用。

1.3.2 組織病理變化 采用HE染色觀察皮膚組織病理變化，收集各組小鼠的左耳皮膚組織，以4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)脫水和透明處理，石蠟包埋后切片，再用蘇木素-伊紅染色，封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠的皮膚組織病理變化。

1.3.3 相關(guān)炎癥因子 采用ELISA法檢測相關(guān)炎癥因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、IgE）水平，收集小鼠血清、耳朵勻漿，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠相關(guān)炎癥因子的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Graphpad 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較行t檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組耳部厚度及皮膚變化比較 Control組耳部皮膚組織完好；與Control組相比，Model組左耳存在肉眼可見的紅腫現(xiàn)象，并伴有毛細(xì)血管擴(kuò)張；與Model組和NC組相比，不同濃度AN處理組左耳的紅腫及毛細(xì)血管擴(kuò)張現(xiàn)象得到不同程度的改善，且隨著AN干預(yù)濃度的增加，修復(fù)效果也不斷提升，見圖1。利用游標(biāo)卡尺測量小鼠左耳耳尖的厚度發(fā)現(xiàn)，Model組左耳厚度大于Control組（P＜0.05）；NC組和不同濃度AN處理組左耳厚度小于Model組（P＜0.05）；1.0%、1.5%、3.0%、5.0% AN組左耳厚度均小于NC組（P＜0.05），見表1。

表1 各組左耳厚度比較（，cm）

表1 各組左耳厚度比較（，cm）

注：與Control組比較，*P＜0.05；與Model組比較，#P＜0.05；與NC組比較，&P＜0.05

組別Control組Model組NC組0.5% AN組1.0% AN組1.5% AN組3.0% AN組5.0% AN組n 12 12 12 12 12 12 12 12左耳厚度0.21±0.01 0.46±0.03*0.36±0.04#0.30±0.05#0.31±0.06#&0.28±0.04#&0.28±0.04#&0.26±0.04#&

圖1 各組左耳皮膚組織變化情況

2.2 各組左耳皮膚組織HE染色結(jié)果比較 Model組左耳表皮層及角質(zhì)層厚度大于Control組；1.0%、1.5%、3.0%、5.0% AN組左耳表皮層及角質(zhì)層厚度小于Model組和NC組，見圖2。

圖2 各組左耳皮膚組織HE染色結(jié)果（×200）

2.3 各組血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IgE水平比較 各組間血清TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Model組血清IL-1β、IL-6、IgE水平均高于Control組（P＜0.05）；0.5%及以上濃度AN組血清IL-1β水平均低于Model組（P＜0.05）；1.0%、1.5%、3.0%、5.0%AN組血清IL-6水平均低于Model組（P＜0.05）；各AN組血清IgE水平均低于Model組（P＜0.05）；1.0%、1.5%、3.0%、5.0% AN組血清IL-1β、IL-6、IgE水平均低于NC組（P＜0.05），見表2。

表2 各組血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IgE水平比較（，pg/ml）

表2 各組血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IgE水平比較（，pg/ml）

注：與Control組比較，**P＜0.05；與Model組比較，#P＜0.05，##P＜0.05；與NC組比較，&P＜0.05，&&P＜0.05

組別Control組Model組NC組0.5% AN組1.0% AN組1.5% AN組3.0% AN組5.0% AN組n IL-1β 12 12 12 12 12 12 12 12 71.51±18.69 116.94±10.10**111.51±14.98 104.94±12.49#IL-6 57.93±5.77 100.73±9.63**97.73±13.04 93.25±12.22 IgE 6.29±1.74 11.64±1.88**9.54±1.94#8.34±1.11#87.36±8.72##&&84.51±11.50##&7.15±1.48##&74.82±8.23##&&70.00±9.42##&&6.31±1.01##&&96.24±14.91##&76.02±10.17##&7.32±1.41##&&88.98±5.97##&TNF-α 37.92±5.22 39.53±4.69 36.25±6.36 36.46±3.91 35.88±3.91 34.90±6.47 37.68±3.72 35.11±5.86 80.89±9.72##&&6.77±1.37##&&

2.4 三組耳朵勻漿中IL-4、IL-5、TSLP、IFN-γ水平比較 Model組耳朵勻漿IL-4、IL-5、TSLP水平均高于Control組，IFN-γ水平低于Control組（P＜0.05）；1.5% AN組耳朵勻漿IL-4、IL-5、TSLP水平均低于Model組，IFN-γ水平均高于Model組（P＜0.05），見表3。

表3 三組耳朵勻漿中IL-4、IL-5、TSLP、IFN-γ水平比較（，pg/ml）

表3 三組耳朵勻漿中IL-4、IL-5、TSLP、IFN-γ水平比較（，pg/ml）

注：與Control組比較，**P＜0.05；與Model組比較，##P＜0.05

組別Control組Model組1.5% AN組n 12 12 12 IL-4 8.75±2.15 37.72±5.57**13.71±2.38##IL-5 9.51±2.68 40.20±5.05**14.70±2.36##TSLP 9.46±2.53 30.49±6.79**14.72±2.6##IFN-γ 61.79±7.71 15.16±2.43**35.59±2.85##

3 討論

特應(yīng)性皮炎是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，發(fā)病原因與遺傳、免疫和環(huán)境之間的復(fù)雜相互作用有關(guān)，其特征外在表現(xiàn)為皮膚屏障受損，內(nèi)在表現(xiàn)則為促進(jìn)炎癥反應(yīng)活化，使患者血清中炎癥因子水平顯著高于正常人群[8]。臨床常用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑進(jìn)行治療，但是不適合長期使用且存在副作用[9，10]。因此，特應(yīng)性皮炎亟需尋找有效且安全的治療方法。近年來，隨著對青蒿素認(rèn)識的逐漸加深，發(fā)現(xiàn)其在治療炎癥性皮膚病中具有重要意義。AN作為青蒿素的副產(chǎn)物，也可用于治療神經(jīng)性皮炎、皮膚真菌病、痤瘡等皮膚疾病，且與臨床上常用藥劑相比，其耐受性強(qiáng)且不易產(chǎn)生不良反應(yīng)[11]。

本研究結(jié)果顯示，Model組左耳呈現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，且伴有毛細(xì)血管擴(kuò)張，左耳厚度、左耳表皮層及角質(zhì)層厚度大于Control組；不同濃度AN處理組小鼠左耳的紅腫及毛細(xì)血管擴(kuò)張程度、左耳厚度、左耳表皮層及角質(zhì)層厚度小于Model組，且隨著AN干預(yù)濃度的增加，修復(fù)效果也不斷提升。分析認(rèn)為，特應(yīng)性皮炎患處皮膚常出現(xiàn)紅腫、皮膚增厚等現(xiàn)象，AN可改善特應(yīng)性皮炎的病理變化，在緩解特應(yīng)性皮炎進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，Model組血清IL-1β、IL-6、IgE水平均高于Control組（P＜0.05）；1.0%及以上濃度AN組血清IL-1β、IL-6、IgE水平均低于NC組（P＜0.05）。分析認(rèn)為，特應(yīng)性皮炎是炎癥性皮膚病，機(jī)體中的相關(guān)炎癥因子水平發(fā)生改變，促進(jìn)炎癥的進(jìn)展；而青蒿素及其衍生物可通過抑制相關(guān)促炎因子的產(chǎn)生以改善炎癥性皮膚病的嚴(yán)重程度，緩解疾病進(jìn)展[12]。即1.0%（對應(yīng)人體使用濃度0.11%）及以上濃度AN能舒緩特應(yīng)性皮炎小鼠的炎癥反應(yīng)以及相關(guān)疾病表型在特應(yīng)性皮炎的治療方面具有巨大應(yīng)用前景。T淋巴細(xì)胞的異常活化和浸潤介導(dǎo)的免疫功能失調(diào)是特應(yīng)性皮炎疾病進(jìn)展中的重要因素，其中輔助性T細(xì)胞Th1/Th2軸在特應(yīng)性皮炎發(fā)生發(fā)展中處于關(guān)鍵地位[13]。特應(yīng)性皮炎患者機(jī)體中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能和數(shù)量均受到不利影響，機(jī)體對Th2細(xì)胞的抑制作用減弱，導(dǎo)致Th2細(xì)胞的功能亢進(jìn)，引發(fā)一系列的炎性反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)特應(yīng)性皮炎進(jìn)展[14]。本研究結(jié)果還顯示，Model組耳朵勻漿IL-4、IL-5、TSLP水平均高于Control組，IFN-γ水平低于Control組（P＜0.05）；1.5% AN組耳朵勻漿IL-4、IL-5、TSLP水平均低于Model組，IFN-γ水平均高于Model組（P＜0.05）。分析認(rèn)為，TSLP是一種新型促敏分子，被譽(yù)為炎癥反應(yīng)的“總開關(guān)”，可誘導(dǎo)淋巴結(jié)內(nèi)的Th0細(xì)胞向Th2型細(xì)胞分化，使得Th1/Th2的平衡機(jī)制向Th2傾斜，在驅(qū)動(dòng)特應(yīng)性皮炎疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[15]。IL-4、IL-5是由Th2細(xì)胞分泌，IFN-γ是由Th1細(xì)胞分泌。因此，AN可調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞向Th1細(xì)胞漂移，改變局部微環(huán)境中細(xì)胞因子的組成，減輕炎癥反應(yīng)，緩解皮膚損傷，是針對特應(yīng)性皮炎干預(yù)的有效手段。

綜上所述，本研究通過動(dòng)物模型疾病表征、組織病理變化情況以及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)情況，明確了AN可通過改善特應(yīng)性皮炎小鼠機(jī)體Th1/Th2平衡，減輕炎癥反應(yīng)，緩解皮膚損傷。