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        葡萄根癌病研究進(jìn)展及防治措施

        2022-09-22 08:54:50袁麗芳尹向田王鵬飛李廷剛蔣錫龍湯小寧韓金濤魏彥鋒
        中外葡萄與葡萄酒 2022年5期
        關(guān)鍵詞:癌病病原菌質(zhì)粒

        袁麗芳,尹向田,王鵬飛,李廷剛,蔣錫龍,湯小寧,韓金濤*,魏彥鋒*

        (1. 山東省葡萄研究院,山東濟(jì)南 250100;2. 山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院,山東濟(jì)南 250100)

        我國是葡萄大國,2020年栽培面積達(dá)76.75萬 hm2,排世界第二位。葡萄根癌病是常見的細(xì)菌性病害,在我國葡萄產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍,主要為害樹體主干,影響樹體健康生長,給葡萄產(chǎn)業(yè)帶來了巨大損失。

        葡萄根癌病由葡萄土壤桿菌(Allorhizobium vitis)引起,植株染病后生長衰弱、葡萄品質(zhì)下降,產(chǎn)量降低,嚴(yán)重者植株死亡[1-3]。此外,該病原多從傷口進(jìn)行侵染,因此葡萄嫁接苗存在感病風(fēng)險,若用帶菌苗木建園,一旦發(fā)病只能銷毀。對葡萄根癌病進(jìn)行快速診斷和檢測是進(jìn)行有效預(yù)防的前提,目前農(nóng)業(yè)防治和生物防治是防治該病的首要方法。本文對國內(nèi)外葡萄根癌病的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,并提出常規(guī)防治措施,以期為葡萄根癌病的后續(xù)研究提供幫助。

        1 危害及田間癥狀

        葡萄根癌病(也稱冠癭病,crown gall disease)是葡萄生產(chǎn)中的一種毀滅性細(xì)菌病害,給世界范圍內(nèi)的葡萄育苗基地和種植園帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。在我國東北、華北、西北、黃河及長江流域地區(qū)均有根癌病發(fā)生,部分葡萄園發(fā)病率高達(dá)80%~90%,產(chǎn)量損失30%~70%,嚴(yán)重時甚至絕收[4-5]。

        葡萄根癌病的典型癥狀是形成腫瘤[6-7]。該病的病原菌主要存活在病殘體或土壤中,通過傷口侵入植物體內(nèi),由木質(zhì)部進(jìn)行傳輸?shù)竭_(dá)植物細(xì)胞,使細(xì)胞產(chǎn)生過量的生長激素,從而形成瘤狀物[8]。葡萄幼苗期,在嫁接部位可形成大小不一的瘤狀物,初期為黃豆粒大小,外皮綠色,隨著瘤狀物逐漸膨大呈現(xiàn)直徑數(shù)厘米的球形,表面粗糙,內(nèi)部組織逐漸木質(zhì)化,后期顏色變?yōu)楹稚蛏詈稚kS著葡萄樹齡的增加,除主干外,瘤狀物可出現(xiàn)在主枝、側(cè)枝和結(jié)果母枝上[3]。此外,根癌病病原菌可破壞葡萄植株根冠對水和礦物質(zhì)的吸收,影響植株形成層和維管束對營養(yǎng)的運輸,導(dǎo)致植株營養(yǎng)不良,枝梢干枯,嚴(yán)重時可導(dǎo)致藤蔓死亡。

        2 病原菌

        2.1 病原菌的種類及分類

        土壤桿菌包括根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、發(fā)根土壤桿菌(A. rhizogenes)、懸鉤子土壤桿菌(A. rubi)和葡萄土壤桿菌(A. vitis)[5,9-10]。當(dāng)菌株攜帶腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒(tumor-inducing plasmid, Ti plasmid,Ti質(zhì)粒)時就引起根癌病。根據(jù)根瘤中誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭堿的類型,Ti質(zhì)??煞譃檎卖~堿型(octopine)、章魚堿/黃瓜堿型(octopine/cucumopine)、胭脂堿型(nopaline)、農(nóng)桿堿型(agropine)和vitopin型[3]。目前,基于基因組信息恢復(fù)并修訂了土壤桿菌屬(Agrobacterium)和其它根瘤菌屬(Allorhizobium)的分類地位,根癌土壤桿菌和懸鉤子土壤桿菌屬于土壤桿菌屬,發(fā)根土壤桿菌劃歸在根瘤菌屬(Rhizobium)。葡萄土壤桿菌(Allorhizobium vitis),之前命名為Agrobacterium vitis、Agrobacterium biovar 3、Rhizobium vitis,被重新劃分為異根瘤菌屬(Allorhizobium)[10-14]。

        葡萄根癌病的病原菌主要是不同冠癭堿類型的葡萄土壤桿菌[15-17]。在少數(shù)情況下,根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌也可以引起葡萄根癌病[18-22]。葡萄土壤桿菌最初由Ophel和Kerr于1990年定名為Agrobacterium vitis,該病原菌分布廣泛,許多國家包括澳大利亞[23]、保加利亞[24]、德國[25]、意大利[4]、日本[26]、塞爾維亞[27]、西班牙[28]、美國[29]、俄羅斯[30]和摩洛哥[31]等,均分離鑒定到該病原菌。在我國山東、河北及新疆等地區(qū)引起葡萄根癌病的病原菌為葡萄土壤桿菌章魚堿型[32-34]。

        2.2 形態(tài)特征及生理生化特性

        葡萄根癌病是革蘭氏陰性菌,呈短桿狀,大小為0.8~1.0 μm×3.0 μm,具周生鞭毛;菌落乳白色,圓形,邊緣整齊。最適生長溫度28 ℃,高于37 ℃不能生長,可在pH4~10范圍生長,耐受0~3%的NaCl[35]。不同于根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌,該病原菌多數(shù)可在pH4.5條件下分解果膠,但在pH7條件下缺乏運動性(表1)[32,36]。

        表1 葡萄土壤桿菌、根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌的生理生化特性Table 1 Comparative analysis of physiological and biochemical characteristics of A. vitis with A. tumefaciens and A. rhizogenes

        2.3 基因組信息

        目前,全基因組測序的葡萄土壤桿菌菌株共有9株,分別是S4、VAR03-1、VAT03-9、F2/5、CG412和VAR06-30等(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#!/prokaryotes/1215/)。葡萄土壤桿菌的基因組大小為5.57~6.32 Mb,包含有兩個環(huán)形染色體和1~5個質(zhì)粒,GC含量為57.48%~58.61%。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌大多含有一個環(huán)形染色體和一個線性染色體,GC含量為58.92%~59.96%,與葡萄土壤桿菌相比較高(表2)[37]。葡萄土壤桿菌的Ti質(zhì)粒大小約200 kb,GC含量56%~57%,包含轉(zhuǎn)運DNA(transferred DNA,T-DNA)、毒力區(qū)域(virulence region)、冠癭堿代謝基因(opine catabolism genes)、復(fù)制區(qū)(replication region)和可結(jié)合轉(zhuǎn)運的基因(conjugative transfer genes)[38]。Ti質(zhì)粒屬于repABC質(zhì)粒家族,含有兩套獨立的TypeIV分泌系統(tǒng),第一個T4SS系統(tǒng)(vir)是負(fù)責(zé)將T-DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到宿主植物,而第二個系統(tǒng)(tra/trb)則介導(dǎo)Ti質(zhì)粒的偶聯(lián)轉(zhuǎn)移。Ti質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移由群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)調(diào)控,受冠癭堿的產(chǎn)生而誘導(dǎo)。

        表2 土壤桿菌基因組信息比較Table 2 Comparison of genomes information of Agrobacterium sp.

        2.4 寄主范圍

        土壤桿菌是引起植物根癌病的一種世界范圍內(nèi)的致病菌,可以引起包括葡萄在內(nèi)的93科331屬的643個種的植物根癌病[39-40]。根癌土壤桿菌可以侵染多種植物,包括葡萄、蘋果、櫻桃、獼猴桃、玫瑰、番茄等[41-44];發(fā)根土壤桿菌可以侵染蘋果、梨、扁桃和櫻桃[45-48];葡萄土壤桿菌主要侵染葡萄,還可以侵染香蕉,引起香蕉葉枯病[49]。葡萄土壤桿菌能在向日葵、煙草、蕃茄、曼陀羅、懸鉤子等幾種植物上形成癭瘤,通常采用這幾種植物為指示植物在溫室內(nèi)做致病性測定[38]。

        3 葡萄土壤桿菌的致病機(jī)理

        通過傷口侵入寄主體內(nèi),將自身Ti質(zhì)粒上的T-DNA整合到寄主細(xì)胞核DNA中,從而引發(fā)葡萄根癌病。葡萄土壤桿菌的致病能力主要由Ti質(zhì)粒決定,Ti質(zhì)粒包含4個保守的功能基因區(qū):T-DNA區(qū),包括致瘤基因區(qū)和冠癭堿合成相關(guān)基因區(qū);毒性Vir區(qū),包括Vir A、Vir B、Vir C、Vir D、Vir E、Vir F六個遺傳位點;Tra區(qū),促使細(xì)菌質(zhì)粒在細(xì)菌間的接合轉(zhuǎn)移和群體信號感應(yīng);rep區(qū),參與質(zhì)粒復(fù)制。T-DNA區(qū)的冠癭堿合成相關(guān)基因,包括章魚堿合成相關(guān)基因(ocs)、黃瓜堿型合成相關(guān)基因(cus)、胭脂堿合成相關(guān)基因(nos)、精氨酸合成相關(guān)基因(vis)和農(nóng)桿菌素堿合成相關(guān)基因(acs),它們參與冠癭堿合成,為病原菌提供賴以生存、繁殖所必需的營養(yǎng)和能量;致瘤基因區(qū)基因調(diào)控生長素和細(xì)胞分裂素的合成,生長素的合成需要基因iaaM和iaaH參與,iaaM編碼色氨酸側(cè)鏈氧化酶(tryptonphan side-chain oxidase),催化色氨酸成吲哚乙酰胺(indoleacetamide,IAM);iaaH編碼吲哚-3-乙酰胺水解酶,催化IAM成吲哚乙酸(indoleacetic acid,IAA),ipt是細(xì)胞分裂素合成的必需基因,在一些菌株中,T-DNA中不存在iaaM、iaaH和ipt,6b基因具有和iaaM等相似的功能,生長素和細(xì)胞分裂素的過量合成打破了寄主植物細(xì)胞內(nèi)激素原有的平衡,導(dǎo)致植物細(xì)胞無限制地增生,進(jìn)而形成腫瘤[38,41]。

        表3 葡萄土壤桿菌的特異性引物信息Table 3 Specific primer information of A. vitis

        此外,多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)和游動性是葡萄土壤桿菌所具有的特性,是該病原菌中非常重要的致病因子[50]。葡萄土壤桿菌可以產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶,誘導(dǎo)葡萄根部壞死[18,51-52];群體感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌的一種調(diào)控機(jī)制,參與調(diào)控多種生理過程,包括營養(yǎng)或位點競爭、毒性基因的表達(dá)、細(xì)菌Ti質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移、細(xì)菌趨化性和運動性、生物膜的形成、定殖能力等。游動性葡萄土壤桿菌具有在葡萄上穩(wěn)定定殖的重要機(jī)制,其游動性是由群體感應(yīng)系統(tǒng)信號分子N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯類(N-acyl-homoserine lactone signal molecules)所調(diào)控。研究表明,葡萄土壤桿菌aviR(屬于群體感應(yīng)luxR家族)基因由于缺失突變體菌株喪失了表面游動性[53]。

        4 葡萄土壤桿菌的鑒定及檢測

        葡萄主要依靠扦插和嫁接的方式進(jìn)行繁殖,帶菌的苗木是葡萄根癌病快速傳播的重要途徑。葡萄土壤桿菌主要生活在葡萄根冠及周圍土壤中,能在葡萄藤蔓上生存和繁殖。該病原菌通過木質(zhì)部在葡萄體內(nèi)擴(kuò)展,對植株進(jìn)行系統(tǒng)侵染。因此,快速準(zhǔn)確的檢測技術(shù)是預(yù)防該病的前提。近些年,分子生物學(xué)檢測技術(shù)的快速發(fā)展為病原菌的檢測奠定了基礎(chǔ)。相比傳統(tǒng)的特異性檢測培養(yǎng)基,PCR檢測技術(shù)因具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用。基于PCR檢測技術(shù)建立的葡萄土壤桿菌的檢測體系有特異性引物檢測,該技術(shù)可以定性鑒定葡萄土壤桿菌菌株[4,54-55];熒光定量PCR(qPCR)檢測技術(shù)可以快速對葡萄土壤桿菌進(jìn)行定性和定量分析,檢測用時短且靈敏度高、特異性強(qiáng)[4,56];磁珠捕獲雜交定量PCR(Magnetic Capture Hybridization, MCH-qPCR)指DNA提取經(jīng)磁珠捕獲雜交處理,檢測結(jié)果比直接進(jìn)行熒光定量靈敏度提高1000倍[57-58];數(shù)字微滴PCR(ddPCR)不依賴基因擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和內(nèi)參基因即可確定基因拷貝數(shù)[59];環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)檢測技術(shù)不需要精準(zhǔn)的PCR儀,在恒溫水浴下即可完成,其檢測結(jié)果可進(jìn)行可視化觀察[60]。Lim等[61]根據(jù)葡萄根癌病菌葡萄土壤桿菌的特異性DNA片段設(shè)計引物,利用巢式PCR進(jìn)行檢測,其靈敏度為2 cfu·mL-1,能夠有效檢測土壤中的病原菌。Nguyen-Huu[62]設(shè)計了5對引物分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測,這5對引物均能特異地檢測出葡萄土壤桿菌,靈敏度為100 cfu·mg-1。施文驍[34]建立的LAMP技術(shù)可用于田間快速檢測,對葡萄土壤桿菌DNA的靈敏度為20 pg,60~90 min就可完成。

        5 綜合防治

        目前,葡萄根癌病最有效的防治措施是建立無病原菌的育苗基地,因為沒有特別有效的防治方法。植株一旦染病將導(dǎo)致減產(chǎn)、甚至植株死亡。近年來,針對葡萄根癌病主要通過農(nóng)業(yè)防治和生物防治進(jìn)行。

        5.1 農(nóng)業(yè)防治

        建園時使用無毒苗木,避免引進(jìn)帶病的種苗是預(yù)防根癌病的前提。選育無病苗木和栽植抗病品種是預(yù)防葡萄根癌病的重要途徑[63]。目前,鮮食葡萄中‘紅地球’‘玫瑰香’‘巨峰’等品種高度感病,‘龍眼’‘康太’等品種對根癌病有一定抗性;釀酒葡萄中‘霞多麗’‘赤霞珠’‘黑比諾’也有一定抗性。此外,根癌病抗性葡萄砧木有‘河岸2號’‘河岸6號’‘河岸9號’等[64-65]。因此,對葡萄根癌病菌的早期診斷,及時清除和銷毀病苗,并加強(qiáng)田間管理,增施有機(jī)肥和礦質(zhì)營養(yǎng),盡量避免在農(nóng)事操作時造成傷口,都可以減少根癌病的發(fā)生。

        5.2 生物防治

        生物防治是根癌病的有效措施,非致病菌A.radiobacterK84可以有效防治不同寄主植物的根癌病,該菌產(chǎn)生的細(xì)菌素(農(nóng)桿菌素)對根癌病菌有抑制作用,但是對于葡萄土壤桿菌引起的葡萄根癌病無防效[66]。無致病性的A. vitisE26、VAR03-1和ARK-1可作為生防菌來抑制土壤桿菌的生長和葡萄植株腫瘤的形成[67-78]。E26菌株可以穩(wěn)定的產(chǎn)生細(xì)菌素,其在溫室和田間對葡萄根癌病有顯著的防治效果,并且對土壤環(huán)境及微生物無風(fēng)險。分離自葡萄上的A. vitisF2/5能抑制致病的葡萄土壤桿菌,但同時可以引起葡萄根部壞死[69]。室內(nèi)試驗表明,假單孢菌(Pseudomonasspp.)和水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilisHX2)可以抑制指示植物根瘤的形成[70]。此外,商品生防制劑枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisSR63和木霉菌Trichoderma asperellumT1可以有效抑制葡萄土壤桿菌。

        多聚半乳糖醛酸酶可以降解葡萄木質(zhì)部細(xì)胞壁的組成成分果膠[71]。近年來,有研究利用噬菌體的展示技術(shù)篩選分離出一種多肽SVTIHHLGGGS,該多肽可以緊密結(jié)合在葡萄土壤桿菌中的多聚半乳糖醛酸酶。室內(nèi)試驗證明,該多肽可以降低多聚半乳糖醛酸酶活性35%[72],效果顯著。此外,葡萄土壤桿菌不同菌株中效應(yīng)蛋白(Tae4)和免疫蛋白(Tai4)變異較大,能否利用免疫蛋白進(jìn)行病害防治還需后續(xù)研究[73]。

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