邱易耐，董俊君，周丹杰，張德娥，周方飛，肖 莉

(湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

熊果酸(Uroslic acid，UA)為天然有機(jī)三萜類化合物，廣泛存在于枇杷葉、車前草、山茱萸和白花蛇舌草等傳統(tǒng)中藥材中[1].研究發(fā)現(xiàn),UA除具有抗病毒、抗炎等作用外，還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等抗腫瘤活性，是一種具有較高開發(fā)潛力的天然活性物質(zhì)[2].但UA因水溶性較差、口服生物利用度較低，因此限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用[3].

殼聚糖(Chitosan，CS)作為一種天然多糖類藥用載體材料，毒性低且具有較優(yōu)的生物相容性，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[4].CS作為多種藥物的載體，具有結(jié)腸定位作用和靶向給藥作用，可用于提高藥物的穩(wěn)定性，延緩藥物釋放，掩蓋藥物的不良?xì)馕?，同時(shí)也可用作眼、鼻用藥的輔料[5].

本文以載藥量及包封率為指標(biāo)，以CS為載體材料負(fù)載UA，采用乳化分散-交聯(lián)法制備微球，利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化制備工藝，并通過重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)考察工藝的穩(wěn)定性，從而為實(shí)現(xiàn)UA的精準(zhǔn)給藥提供一定的理論依據(jù).

1 試劑與儀器

試劑：熊果酸、殼聚糖、石油醚、甲醇購(gòu)自百靈威試劑公司；司盤80、戊二醛(25%)、液體石蠟、異丙醇、冰醋酸購(gòu)自吉至試劑公司.上述試劑均為分析純.

儀器： LC-20AT高效液相色譜、ISO-9001電子天平、TD3低速離心機(jī)、KQ-5200E型超聲波清洗器、85-2恒溫磁力攪拌器.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 UA-CS的制備

采用乳化分散-交聯(lián)法制備UA-CS[6].稱取適量CS，加入2.5%乙酸溶液，配制成濃度為15 mg/mL的CS溶液，再加入處方量的UA，攪勻后作為水相，并置于40 ℃下保溫備用；取適量液體石蠟置于燒杯中，加入處方量的司盤-80，攪勻后作為油相，并置于40 ℃下保溫備用；在低速攪拌條件下，用注射器將水相緩慢滴加到油相中，在40 ℃下攪拌乳化1 h后，加入適量的戊二醛，在室溫下交聯(lián)固化2.5 h，4 000 r/min離心15 min;棄去上清液，分別用石油醚、異丙醇和超純水反復(fù)洗滌微球3次，抽濾，真空干燥，即得UA-CS.

2.2 UA-CS的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2.1 UA含量的測(cè)定

色譜條件:色譜柱Alltima C18(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)，柱溫w為25 ℃,流動(dòng)相甲醇∶水=88∶12，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm.

UA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精準(zhǔn)稱取UA標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入甲醇溶解定容，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的儲(chǔ)備液；分別精準(zhǔn)量取儲(chǔ)備液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精準(zhǔn)量取10 μL進(jìn)樣測(cè)定；以峰面積(A)對(duì)樣品濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=13 025 621C-6 328(r=0.999 6)，其在0.02～0.05 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.2.2 UA-CS包封率(DL)和載藥量(LE)的測(cè)定

精準(zhǔn)稱取 10 mg UA-CS產(chǎn)品，加入 20 mL 2.5%乙酸溶液，超聲溶解后室溫震蕩12 h，3 000 r/min離心20 min;取上清液1 mL置于10 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋定容后按2.2.1的方法進(jìn)樣；計(jì)算UA-CS中的藥物含量，再根據(jù)式(1)和式(2)計(jì)算微球的DL和LE:

DL=微球中UA的量/投入U(xiǎn)A總量×100%，

(1)

LE=微球中UA的量/微球總重量×100%.

(2)

2.3 UA-CS制備工藝的優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳化溫度(A)、油水兩項(xiàng)體積比(B)和藥材比(C)對(duì)微球的質(zhì)量影響最顯著.因此，選取這3個(gè)因素作為變量因素，每個(gè)因素選定3個(gè)水平，并采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化各因素水平.其因素水平見表1.

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面因素水平表

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以DL和LE為考察指標(biāo)，對(duì)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)處理(Y=0.5DL+0.5LE)，并按照表1的優(yōu)化方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2.

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2(續(xù))

3.2 模型擬合與方差分析

以加權(quán)系數(shù)(Y)為指標(biāo)，采用Design-expert軟件對(duì)各因素進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程：

Y=0.59+0.037A-0.045B-0.015C+0.04AB+ 5.000×10-3AC-5.000×10-3BC-0.099A2-0.12B2-0.04C2.

多元回歸模型的方差分析結(jié)果見表3.由ANVOA分析可知：在考察指標(biāo)的二項(xiàng)式方程中，模型的F值為9.88(P<0.01)，說明UA-CS的優(yōu)化結(jié)果回歸模型顯著；擬合相關(guān)系數(shù)R2=0.927 0，說明該模型的擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小.該多元回歸模型可用于預(yù)測(cè)微球最優(yōu)制備工藝條件.以F值作為依據(jù)，得出3個(gè)因素對(duì)微球質(zhì)量的影響大小依次為：B>A>C.

表3 回歸模型方差分析

固定3個(gè)因素之一并取中間值，通過Design-expert軟件繪制三維響應(yīng)面圖(圖1至圖3)，進(jìn)一步分析3個(gè)因素的交互作用對(duì)UA-CS的影響.由圖1至圖3知，AB、AC、BC的曲面坡度均較為平緩，說明3個(gè)因素之間的交互作用對(duì)微球質(zhì)量的影響不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致.

設(shè)置目標(biāo)值為最大值，通過Design-expert軟件分析得出UA-CS的最優(yōu)制備工藝為：乳化溫度為41.5 ℃、藥材比為2.84∶1、油水比為2.83∶1、綜合指標(biāo)Y為0.601.

圖1 因素A與因素B三維效應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots showing the interactions of factor A and factor B

圖2 因素A與因素C三維效應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots showing the interactions of factor A and factor C

圖3 因素B與因素C三維效應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plots showing the interactions of factor B and factor C

3.3 制備工藝重現(xiàn)性考察

按照最優(yōu)工藝參數(shù)平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)制備微球，以考察UA-CS制備工藝的重現(xiàn)性，結(jié)果如表4所示.綜合指標(biāo)平均值為0.596(RSD為0.84%)，比模型擬合值低0.005，說明模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率較高，優(yōu)化后的制備工藝重現(xiàn)性良好.

表4 UA-CS微球最佳制備工藝的重現(xiàn)性

4 結(jié) 論

本文采用乳化分散-交聯(lián)固化法制備UA-CS，并在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化得到微球的最佳制備工藝：殼聚糖濃度為1.5%、乳化溫度為41.5 ℃、乳化劑與液體石蠟比為1∶25、油水兩相比為2.83∶1、藥材比為2.84∶1.在此條件下制備的微球包封率平均為88.7%、載藥量平均為30.48%.

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)相對(duì)較多、考察因素水平范圍相對(duì)較大等特點(diǎn)[7].實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在優(yōu)化工藝條件下，其綜合指標(biāo)平均值為0.596(RSD為0.84%)，比模型擬合值低0.005，說明本次建立的擬合模型較成功，預(yù)測(cè)性良好.該研究結(jié)果為UA緩釋制劑的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).