袁曉陽(yáng)，程 剛，吳玉嬌，張 峰，徐 靚，魏 偉，嚴(yán)尚學(xué)

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥 230032

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病，關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退化和喪失，伴隨整個(gè)關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)和功能改變，包括滑膜、半月板(在膝部)、關(guān)節(jié)周圍韌帶和軟骨下骨[1]等，臨床表現(xiàn)為緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、僵硬、關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)受限和關(guān)節(jié)畸形等。現(xiàn)有臨床治療藥物如非甾體抗炎藥、注射用玻璃酸鈉、度洛西汀等，只能減輕局部腫脹、疼痛等癥狀，不能有效改善關(guān)節(jié)軟骨損傷，針對(duì)OA的治療仍然以對(duì)癥治療或施行關(guān)節(jié)置換手術(shù)為主[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)治療OA的臨床試驗(yàn)研究中，大多數(shù)試驗(yàn)處于Ⅰ/Ⅱ期安全性和有效性研究階段[3]。因此，MSCs 用于治療OA的安全性、有效性及其作用機(jī)制仍有待探索。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是由成體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)導(dǎo)入重編程而來(lái)的細(xì)胞，不但具備自我更新和多向分化潛能，還克服了胚胎干細(xì)胞存在的倫理和免疫原性等問(wèn)題。課題組前期研究[4]顯示，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(iPSC-MSC)可改善OA大鼠關(guān)節(jié)病理，具有軟骨保護(hù)作用。為進(jìn)一步研究iPSC-MSC對(duì)軟骨組織的作用及其機(jī)制，該研究以膝關(guān)節(jié)OA手術(shù)患者的軟骨組織樣本為對(duì)象，觀察iPSC-MSCs體外對(duì)炎癥因子釋放、軟骨基質(zhì)保護(hù)的作用，探討iPSC-MSCs防治關(guān)節(jié)軟骨退變的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本來(lái)源 經(jīng)患者知情同意，收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)的關(guān)節(jié)軟骨組織。OA患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)制定的《骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)；②保守治療無(wú)效需接受膝關(guān)節(jié)置換術(shù)；③意識(shí)清楚，簽署知情同意書(shū)。OA患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1個(gè)月內(nèi)使用關(guān)節(jié)腔注射患者；②合并嚴(yán)重心腦血管疾病、肝腎功能不全或免疫系統(tǒng)疾病者；③有膝關(guān)節(jié)化膿性感染、手術(shù)史者。

1.1.2細(xì)胞與試劑 iPSC-MSCs(批號(hào)：202104001)由安徽中盛溯源生物科技有限公司提供, 實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)表型鑒定、計(jì)數(shù)和活力檢查。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β(SRP3083)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Human IL-6 ELISA試劑盒(Cat：#m1058097-J)、Human IL-10 ELISA 試劑盒(Cat：#m1064299-J)、Human MMP-13 ELISA試劑盒(Cat：#m1026259-J)為上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品； Rabbit Anti-CollagenⅠ(abs120555)、Mouse anti-Collagen Ⅱ(NB600-844)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1樣本處理 無(wú)菌環(huán)境下將KOA手術(shù)病人捐獻(xiàn)的關(guān)節(jié)軟骨組織剪成直徑約6 mm，厚1 mm的組織塊，置于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液的24孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h。

1.2.2分組及給藥 將處理好的軟骨組織塊作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分為對(duì)照組、IL-1β誘導(dǎo)組、iPSC-MSCs(1×105、1×106、1×107)細(xì)胞共培養(yǎng)組。除對(duì)照組外，各組加入IL-1β(終濃度10 ng/ml)培養(yǎng)96 h，再向iPSC-MSCs各組加入相應(yīng)數(shù)量細(xì)胞，對(duì)照組和IL-1β誘導(dǎo)組加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)完成后，分別收集軟骨組織塊和培養(yǎng)上清液，培養(yǎng)上清液置于-80 ℃冰箱待測(cè)；軟骨組織塊一半用于糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAG)檢測(cè)，另一半置10%福爾馬林固定，用于病理組織學(xué)檢查。

1.2.3ELISA法檢測(cè)軟骨組織體外培養(yǎng)上清液MMP-13、IL-6、IL-10水平 將培養(yǎng)上清液解凍后，3 000 r/min離心20 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)各因子水平。

1.2.4病理學(xué)檢測(cè) 取經(jīng)10%福爾馬林室溫固定的軟骨組織，脫鈣后，石蠟縱向包埋、切片后進(jìn)行HE染色，鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.2.5免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原在軟骨組織樣本中的表達(dá)水平 樣本經(jīng)處理后，脫鈣包埋切片，分別用乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液和3%過(guò)氧化氫進(jìn)行抗原修復(fù)并阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物的干擾，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，第二天室溫復(fù)溫后磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后，加二抗室溫孵育20 min，經(jīng)染色封片后在顯微鏡下觀察。

1.2.6軟骨組織糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)水平檢測(cè) 采用DMMB(1,9-二甲基二亞基藍(lán))法。取另一半組織培養(yǎng)塊后立即測(cè)定其濕重。60 ℃干燥3 d后測(cè)定其干重。將樣本放入1 ml PBS緩沖液中浸泡過(guò)夜。加入10 μl番木瓜酶液，60 ℃孵育6 h。在96孔培養(yǎng)板中加入10 μl標(biāo)準(zhǔn)品及10 μl樣本溶液，再加入20 μl DMMB溶液。1 min后，以PBS作為空白對(duì)照調(diào)零，用酶標(biāo)儀(Infinite M1000 Pro全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司)在690 nm處測(cè)定各樣品孔的吸光度(A)，從硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)樣品的濃度，結(jié)果以硫酸軟骨素(μg/mg)軟骨干重表示。

2 結(jié)果

2.1 iPSC-MSCs體外對(duì)OA患者關(guān)節(jié)軟骨組織病理的影響顯微鏡下檢查可見(jiàn)，對(duì)照組軟骨組織無(wú)異常分化細(xì)胞，軟骨細(xì)胞分布較均勻，大小和形態(tài)一致；IL-1β誘導(dǎo)組軟骨組織出現(xiàn)大量軟骨細(xì)胞腫脹形變、核皺縮、破裂死亡，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；iPSC-MSCs(1×106、1×107)細(xì)胞共培養(yǎng)可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨組織細(xì)胞病變(圖1)。

2.2 iPSC-MSCs體外對(duì)OA患者關(guān)節(jié)軟骨組織Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原表達(dá)的影響免疫組化法檢測(cè)軟骨組織中Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原表達(dá)水平，結(jié)果顯示，IL-1β可誘導(dǎo)軟骨組織Ⅰ型膠原水平表達(dá)升高，iPSC-MSCs(1×106、1×107)細(xì)胞與軟骨組織共培養(yǎng)，可降低IL-1β誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原表達(dá)水平(圖2)。同時(shí)，IL-1β可降低軟骨組織中Ⅱ型膠原含量，iPSC-MSCs(1×106、1×107)與軟骨組織共培養(yǎng)，可升高軟骨組織中Ⅱ型膠原表達(dá)水平(圖3)。

2.3 iPSC-MSCs體外對(duì)OA患者關(guān)節(jié)軟骨組織GAG水平的影響表1結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，IL-1β誘導(dǎo)組軟骨組織GAG含量降低(P<0.05)，iPSC-MSCs(1×105、1×106、1×107)細(xì)胞體外共培養(yǎng)均可升高軟骨組織GAG水平(P<0.05)。

圖1 iPSC-MSCs體外對(duì)OA患者關(guān)節(jié)軟骨組織病理的影響 ×50

圖2 iPSC-MSCs體外對(duì)OA患者關(guān)節(jié)軟骨組織Ⅰ型膠原表達(dá)的影響 ×50

圖3 iPSC-MSCs體外對(duì)OA患者關(guān)節(jié)軟骨組織Ⅱ型膠原表達(dá)的影響 ×50

表1 iPSC-MSCs體外對(duì)OA患者關(guān)節(jié)軟骨組織GAG水平的影響

2.4 iPSC-MSCs體外對(duì)OA患者關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-13、IL-6和IL-10分泌水平的影響檢測(cè)iPSC-MSCs與OA患者軟骨組織的共培養(yǎng)上清液，結(jié)果顯示(表2)，與對(duì)照組比較，IL-1β誘導(dǎo)組培養(yǎng)上清液中MMP-13、IL-6水平升高(P<0.01)，IL-10水平下降(P<0.01)；與IL-1β誘導(dǎo)組比較，iPSC-MSCs(1×105、1×106、1×107)細(xì)胞共培養(yǎng)可不同程度地降低培養(yǎng)上清液中MMP-13、IL-6水平，升高IL-10水平。

表2 iPSC-MSCs體外對(duì)OA患者關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-13、IL-6和IL-10分泌水平的影響

3 討論

OA作為臨床常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，主要臨床癥狀包括慢性疼痛、關(guān)節(jié)不穩(wěn)定、僵硬、關(guān)節(jié) 畸形和放射學(xué)關(guān)節(jié)間隙變窄[5]。關(guān)節(jié)軟骨主要由組織液、膠原(主要是Ⅱ型膠原)、蛋白聚糖和軟骨細(xì)胞組成。關(guān)節(jié)軟骨的退行性變化的標(biāo)志是蛋白多糖含量減少和水含量增加[6]，由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏血液供應(yīng)，而且軟骨細(xì)胞是高度分化的細(xì)胞，增殖和遷移能力差[7-8]，因此運(yùn)用干細(xì)胞治療OA的療法最近幾年有了很大的發(fā)展，如骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞在治療OA患者中起到了抗炎和軟骨保護(hù)作用[9-10]。然而，干細(xì)胞治療仍有許多缺點(diǎn)需要克服，包括腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)、倫理問(wèn)題和移植排斥等。iPSCs與胚胎干細(xì)胞相似，由患者特異性成體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有在形態(tài)、自我更新和分化能力方面的優(yōu)勢(shì)[11]。已有研究[12]指出，iPSC-MSCs可以有效抑制OA兔軟骨中炎癥因子IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)，通過(guò)單層培養(yǎng)使用iPSC-MSCs衍生的軟骨細(xì)胞，可以修復(fù)有缺陷的軟骨。課題組前期研究[4]顯示通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射iPSC-MSCs可以改善OA大鼠關(guān)節(jié)病理，具有的軟骨保護(hù)作用但對(duì)軟骨基質(zhì)的保護(hù)作用機(jī)制尚未明確。

已有文獻(xiàn)[13]表明，在OA患者和動(dòng)物模型中IL-6、IL-10的水平分別提高和下降，IL-6可以放大炎癥反應(yīng)，加重軟骨組織損傷，IL-10誘導(dǎo)的2型巨噬細(xì)胞亞型在組織重塑中起到作用。本研究觀察了不同細(xì)胞數(shù)量iPSC-MSCs體外對(duì)KOA患者關(guān)節(jié)軟骨組織炎癥因子水平的影響，結(jié)果表明，iPSC-MSCs共培養(yǎng)可降低促炎因子IL-6水平，升高抗炎因子IL-10水平。因此，iPSC-MSC可通過(guò)抑制IL-6產(chǎn)生、促進(jìn)IL-10分泌，減輕關(guān)節(jié)軟骨局部炎癥，從而改善OA患者軟骨組織損傷。

細(xì)胞外軟骨基質(zhì)(extracellular Cartilage Matrix ，ECM)合成和分解代謝是影響OA發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要影響因素。OA早期和晚期的滑膜炎與軟骨的改變有關(guān)，發(fā)炎的滑膜產(chǎn)生分解代謝和促炎因子，導(dǎo)致產(chǎn)生多余的蛋白水解酶，最終導(dǎo)致軟骨分解。其中MMP-13是軟骨退行性變化的關(guān)鍵酶，具有強(qiáng)大的基質(zhì)分解作用，可降解多種膠原，參與結(jié)締組織的重構(gòu)，它被認(rèn)為是OA發(fā)病過(guò)程中發(fā)生的退行性過(guò)程的主要促成因素。OA發(fā)生時(shí)，軟骨組織Ⅰ型膠原水平升高，Ⅱ型膠原水平下降。本研究進(jìn)一步觀察了iPSC-MSCs對(duì)OA患者軟骨組織ECM合成與降解蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明iPSC-MSCs可以上調(diào)ECM中Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)；下調(diào)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，維持軟骨基本結(jié)構(gòu)。GAG含量與軟骨生物力學(xué)特性存在高度相關(guān)性，已有研究[14]表明GAG含量的降低會(huì)影響軟骨的剛度和黏彈性，會(huì)導(dǎo)致更多的關(guān)節(jié)軟骨損傷。本研究結(jié)果表明，iPSC-MSCs與關(guān)節(jié)軟骨組織共培養(yǎng)，與IL-1β誘導(dǎo)組降低GAG水平相比，iPSC-MSCs(1×105、1×106、1×107)細(xì)胞可升高軟骨組織GAG水平，促進(jìn)軟骨基質(zhì)的合成。目前以MSC移植作為OA的臨床治療仍然還處于起步階段，MSC的不同種類、作用效果、作用機(jī)制以及安全性等還不是非常明確。iPSC來(lái)源的MSCs具有來(lái)源簡(jiǎn)單、細(xì)胞質(zhì)量可控、不涉及倫理學(xué)問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)，是如今研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要觀察iPSC-MSCs與OA患者軟骨組織共培養(yǎng)對(duì)炎癥導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解保護(hù)作用的機(jī)制，證實(shí)iPSC-MSCs抑制炎癥因子釋放，促進(jìn)抗炎因子合成，抑制ECM降解。