劉瀟一，張春梅，張 磊，許 振，魏 琦，蔣海峰，董婷玉，楊雪枝，嚴(yán)尚學(xué)，常 艷，魏 偉

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽醫(yī)科大學(xué)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎研究中心，合肥 230032

有報(bào)道[1]認(rèn)為，大約10.8%的人群會(huì)受到腎臟疾病的影響。腎臟疾病主要損害的病理部位是腎小球，腎小球是腎組織中主要起濾過(guò)作用的單位[2]。腎小球系膜細(xì)胞(glomerular mesangial cells，GMCs)過(guò)度增殖是腎小球疾病(如腎小球腎炎、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病等)的主要病理特征[3]。

腎小球主要由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和GMCs組成。原代腎組織中細(xì)胞提取培養(yǎng)中，與內(nèi)皮細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，GMCs是較易生長(zhǎng)的腎小球細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兊纳L(zhǎng)需求最小，增殖能力較強(qiáng)[4]。目前已有對(duì)大鼠、小鼠、兔、人及豬的GMCs分離方法的報(bào)道[5]，但尚未見(jiàn)對(duì)獼猴原代GMCs分離方法的報(bào)道。有文獻(xiàn)[6]報(bào)道稱(chēng)，可以利用小鼠腎臟進(jìn)行GMCs培養(yǎng)，但其操作步驟繁瑣，利用50、100目和200目三道篩網(wǎng)才能篩出純度較高的腎小球組織。腎小球位于腎臟腎皮質(zhì)部位，小鼠腎皮質(zhì)部位小，需要足夠量的小鼠腎組織才能貼出GMCs[6]。人原代GMCs的提取方法也有報(bào)道[7]，但是取材較為困難(一般為胎兒的腎)。與其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，獼猴與人類(lèi)的遺傳基因、生理病理狀態(tài)以及免疫反應(yīng)和新陳代謝具有高度的相似性，社會(huì)行為也與人類(lèi)似，是基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用之間的一個(gè)理想轉(zhuǎn)化模型[8]。該研究結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道，以及GMCs的生理特性和生長(zhǎng)要求，成功建立了獼猴原代GMCs的分離培養(yǎng)方法，并對(duì)其進(jìn)行鑒定和功能研究，為進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)材料與工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取12只3～5歲普通級(jí)雄性實(shí)驗(yàn)獼猴，體質(zhì)量為4～6 kg，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。溫度:20～26 ℃；日溫差:≤4 ℃；相對(duì)濕度:40%～70%。晝夜交替滿(mǎn)足獼猴作息時(shí)間，飼料、水不受限制，通過(guò)瓜果蔬菜補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，定時(shí)為獼猴播放音樂(lè)及視頻，嚴(yán)格遵守動(dòng)物福利標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自旌德縣皖南獼猴馴養(yǎng)繁殖基地，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2020-001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(皖)2020-001。該實(shí)驗(yàn)過(guò)程經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：PT-2020-001)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器注射用鹽酸替來(lái)他明鹽酸唑拉西泮(舒泰50)購(gòu)自上海維克有限公司；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清(fatal bovine serum, FBS)購(gòu)自以色列Biological Industries公司; 0.25%胰蛋白酶(含EDTA)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；小鼠腎小球系膜細(xì)胞系 SV40 MES 13 購(gòu)自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司；DAPI染色液和0.5%結(jié)晶紫水溶液購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自合肥Biosharp公司；TNF-α購(gòu)自美國(guó) PeproTech公司；α-SMA(兔抗單克隆抗體，美國(guó)Proteintech公司)、GAPDH(兔抗單克隆抗體，美國(guó)Proteintech公司); Nephrin(兔多克隆抗體，美國(guó)affinity公司)抗體；Transwell小室均購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Ⅵ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。DMi1型倒置生物顯微鏡：徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司；BX 53正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司；Image Xpress Micro4型高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析儀：美國(guó)Molecular Devcies公司； Infinite M1000 PRO多功能酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司。

1.3 獼猴腎小球系膜細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法

1.3.1動(dòng)物麻醉與提取腎小球 獼猴在肌肉注射舒泰50(6 mg/kg)深度麻醉后，采取股動(dòng)脈放血處死。獼猴處死后解剖，在超凈臺(tái)中沿腹部中線打開(kāi)腹腔，無(wú)菌取出獼猴腎臟。利用預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水沖洗腎臟，去除腎組織中的血塊和血紅細(xì)胞，之后轉(zhuǎn)移至另一個(gè)空的無(wú)菌大皿中。利用無(wú)菌眼科剪、眼科鑷去除多余腎組織(如：腎盂和腎包膜)，利用無(wú)菌手術(shù)刀剖開(kāi)腎臟，取一小塊腎皮質(zhì)。將腎皮質(zhì)放入無(wú)菌1.5 ml離心管中，利用無(wú)菌眼科剪剪碎腎皮質(zhì)，組織塊大小≤1 mm3；加入少量混有高糖DMEM的無(wú)菌生理鹽水混勻，利用巴氏吸管分次吸取剪碎的腎組織懸液放到重疊的2層紗網(wǎng)上(上100目，下200目)，利用5 ml注射器輕碾組織塊，同時(shí)利用無(wú)菌生理鹽水沖洗，直至組織塊發(fā)白；將200目紗網(wǎng)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌大皿中，巴氏吸管吸取無(wú)菌生理鹽水反復(fù)反向沖洗200目紗網(wǎng)上碾碎的組織塊，收集沖下的組織塊，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌15 ml離心管中。離心管低速離心5 min ，轉(zhuǎn)速1 000 r/min，之后棄去上清液，加入適量的無(wú)菌生理鹽水構(gòu)成腎小球懸液，整個(gè)過(guò)程盡量控制在2～3 h之內(nèi)且保持無(wú)菌操作。

1.3.2腎小球活性鑒定及計(jì)數(shù) 取上述腎小球組織懸液90 μl，加入定量10 μl的0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液充分混勻，5 min后立即取10 μl滴于覆以蓋玻片的細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，5×物鏡下觀察提取腎小球的數(shù)量、染色情況及有無(wú)脫去布曼囊，并進(jìn)行腎小球計(jì)數(shù)。腎小球活性及濃度的計(jì)算公式[9]如下

1.3.3獼猴腎小球消化與接種腎小球 在腎小球懸液中分別加入不同濃度的Ⅵ型膠原酶(0.1 mg/ml 及0.2 mg/ml)和0.02 mg/ml Dnasel，分別放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩充分消化不同時(shí)間(10 min和15 min)，之后加入2 ml 20%FBS-DMEM培養(yǎng)液終止消化，充分混勻。再迅速以1 000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5 min。盡量完全去除上清液，加入500 μl 20%FBS-DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行重懸。利用移液槍吸取適量重懸液至培養(yǎng)瓶中(盡量鋪滿(mǎn)瓶底)，同時(shí)輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使上述腎小球懸液均勻鋪在瓶底后，將培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面朝上放入37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，使腎小球組織塊貼壁，4～5 h后再緩慢將細(xì)胞瓶翻面培養(yǎng)，并加入3 ml 20%FBS-DMEM培養(yǎng)液，使完全培養(yǎng)液浸潤(rùn)，培養(yǎng)細(xì)胞。注意3 d內(nèi)勿晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，4 d采用半定量換液，目的是給貼壁腎小球組織適應(yīng)環(huán)境；8 d首次全量換液并觀察腎小球細(xì)胞生長(zhǎng)情況，之后每隔3 d全量換液1次，直至細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底進(jìn)行首次消化傳代。

1.3.4原代系膜細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 往培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入適量0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化腎小球細(xì)胞(細(xì)胞以鋪滿(mǎn)瓶底為度，同時(shí)消化液應(yīng)提前在室溫條件下進(jìn)行復(fù)溫)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中1 min后拿出，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化(細(xì)胞回縮變圓)時(shí)加入完全培養(yǎng)液終止其消化。用移液槍吸取培養(yǎng)液，輕輕反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶壁上的細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于15 ml離心管中，以 1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速，離心5 min，棄去上清液，使用適量20%FBS-DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，稀釋成適當(dāng)密度接種于新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 獼猴原代系膜細(xì)胞的鑒定

1.4.1形態(tài)學(xué)觀察 倒置光學(xué)顯微鏡觀察并拍照記錄獼猴原代GMCs形態(tài)特征和生長(zhǎng)狀況。

1.4.2免疫熒光鑒定 選擇狀態(tài)良好的GMCs(3～4代)種在鋪有無(wú)菌蓋玻片的24孔板中培養(yǎng)24 h，利用SV40 MES 13(小鼠系膜細(xì)胞系)做陽(yáng)性對(duì)照，細(xì)胞密度約為50%～60%。加入PBS輕輕晃動(dòng)洗滌3 min×2 次；加入預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20 min，棄去，加入PBS輕輕晃動(dòng)洗滌3 min×3 次；加入含0.5%BSA的PBS，室溫封閉30 min，棄去封閉液；分別在加入抗兔的Nephrin和α-SMA一抗(一抗?jié)舛葹? ∶100)，4 ℃過(guò)夜，加入PBS輕輕晃動(dòng)洗滌3 min×3 次；加入594標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶1 000)37 ℃搖床賦予2 h，PBS輕輕晃動(dòng)洗滌5 min ×3次；加入DAPI染細(xì)胞核，室溫?fù)u床賦予8 min，PBS輕輕晃動(dòng)洗滌5 min×3 次；摳片加入抗熒光淬滅劑，封片；熒光顯微鏡下觀察。

1.4.3Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 利用配置好的細(xì)胞裂解液提取本方法獲得的GMCs以及SV40 MES 13的蛋白，配制10%的SDS-PAGE凝膠，上樣電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，利用TBST配制的5%脫脂牛奶37 ℃搖床封閉2 h，洗去牛奶后，用1 ∶1 000的兔抗Nephrin和α-SMA多克隆抗體或1 ∶1 000兔抗GAPDH抗體4 ℃ 條件下孵育過(guò)夜，1 ∶10 000兔二抗 37 ℃搖床孵育2 h，洗去二抗后，加入提前配置好的顯影液曝光，采用 Image J圖像分析軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，比較各組之間的差異。

1.5 獼猴腎小球原代系膜細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)

1.5.1高內(nèi)涵檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，20%FBS-DMEM培養(yǎng)液終止消化，并制備細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)，以0.4×104個(gè)細(xì)胞均勻鋪入96孔板，利用10 ng/ml TNF-α刺激24 h[10]。96孔板用生理鹽水洗3次，每次3 min。 4%多聚甲醛固定30 min，并用生理鹽水清洗。加DAPI染核5～8 min，生理鹽水洗3次，加入適量生理鹽水，并用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)拍照。

1.5.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活力 細(xì)胞制成懸液后，以0.4×104個(gè)/孔鋪入96孔板，饑餓處理之后24 h加10 ng/ml TNF-α。37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，生理鹽水洗滌細(xì)胞。每孔加100 μl 20%FBS-DMEM完全培養(yǎng)液、10 μl CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h后，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度(λ=450 nm)。

1.5.3Transwell法檢測(cè)獼猴腎小球系膜細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞制成懸液后，接種于24孔板，10 ng/ml TNF-α刺激24 h。消化細(xì)胞并將Transwell小室放入24孔板，上室加細(xì)胞懸液，下室加20%FBS-DMEM培養(yǎng)液。37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中遷移24 h；將小室放入4%多聚甲醛固定30 min；并用生理鹽水清洗；含0.1%結(jié)晶紫的生理鹽水，染色20 min；顯微鏡下觀察拍照，每組隨機(jī)選取9個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)目。

1.5.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)獼猴腎小球原代系膜細(xì)胞遷移能力 取原代GMCs，24 h后融合率達(dá)100%后，用200 μl無(wú)菌槍頭垂直于孔板底部中央劃痕，棄去培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS沖洗脫落細(xì)胞，10 ng/ml TNF-α刺激24 h，分別于0、24 h進(jìn)行拍照，觀察劃痕愈合情況，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

2 結(jié)果

2.1 腎小球提取條件的比較Ⅳ型膠原酶不同濃度和消化的時(shí)間，細(xì)胞最開(kāi)始爬出的速度及狀態(tài)不同。3 d觀察0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化10 min的腎小球貼壁較多，0.2 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化15 min的腎小球貼壁較少。7 d后0.2 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化10 min，15 min和0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化15 min的腎小球細(xì)胞呈星形或紡錘形細(xì)胞數(shù)量較少，生長(zhǎng)緩慢(圖1A～D)；0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化10 min的腎小球細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較好(圖1A)。21 d后0.2 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化15 min的腎小球已無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)，0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化15 min的腎小球細(xì)胞有較少的細(xì)胞生長(zhǎng)；0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化10 min的腎小球細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。

2.2 腎小球系膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定經(jīng)2種不同目數(shù)的紗網(wǎng)提取的腎小球用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色后于倒置顯微鏡下觀察顯示: 大部分腎小球均脫去布曼囊(腎小球中有細(xì)胞散出，但又不破碎)且不著色(圖2A)。原代培養(yǎng)的腎小球3 d后開(kāi)始貼壁。應(yīng)用倒置顯微鏡觀察顯示:培養(yǎng)7 d后腎小球周?chē)延屑?xì)胞移出，腎小球組織周?chē)霈F(xiàn)梭形及星形或不規(guī)則形狀的細(xì)胞，細(xì)胞胞體中央有一清晰的卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出數(shù)個(gè)長(zhǎng)短不一的突起，處于指數(shù)增生期的細(xì)胞常呈放射狀(圖1A，圖2B)。21～28 d原代GMCs生長(zhǎng)進(jìn)入旺盛時(shí)期，不少地方的細(xì)胞匯合，且呈堆疊狀生長(zhǎng)狀態(tài)(圖2C～D)。

2.3 原代腎小球系膜細(xì)胞Nephrin和α-SMA蛋白表達(dá)提取原代GMCs、SV40 MES 13蛋白，免疫熒光和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Nephrin(相對(duì)分子量為 135 ku)和α-SMA(相對(duì)分子量為 42 ku)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)得到的原代GMCs α-SMA表達(dá)水平與對(duì)照組SV40 MES 13 α-SMA蛋白表達(dá)相似；SV40 MES 13和原代GMCs均不表達(dá)Nephrin蛋白(圖3、4) 。

圖1 D7原代腎小球細(xì)胞生長(zhǎng)情況 ×50

圖2 原代GMCs形態(tài)學(xué)

圖3 免疫熒光鑒定原代GMCs Nephrin；α-SMA蛋白表達(dá) ×50

2.4 獼猴腎小球原代系膜細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)

2.4.1TNF-α對(duì)獼猴原代腎小球系膜細(xì)胞活力以及增殖的影響 傳代后的GMCs均勻鋪在到96孔板中，10 ng/ml TNF-α刺激24 h后加CCK-8檢測(cè)λ =450 nm處的吸光度，與Control組相比,10 ng/ml TNF-α刺激組GMCs活力提高(圖5B)。圖5C和5D顯示高內(nèi)涵成像系統(tǒng)法檢測(cè)原代GMCs的增殖能力。根據(jù)細(xì)胞直徑最小到最大范圍和細(xì)胞熒光最弱到最強(qiáng)范圍設(shè)定軟件參數(shù)，減去背景熒光強(qiáng)度，統(tǒng)計(jì)分析所有細(xì)胞。導(dǎo)出的Excel表格，統(tǒng)計(jì)每組細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)，分析細(xì)胞的增殖能力。與Control組相比，原代GMCs經(jīng)TNF-α刺激后增殖能力增強(qiáng)(圖5A)。

圖4 Western blot法鑒定原代GMCs Nephrin、α-SMA蛋白表達(dá)

2.5 TNF-α對(duì)獼猴原代腎小球系膜細(xì)胞遷移的影響Transwell小室檢測(cè)原代GMCs遷移功能，利用結(jié)晶紫染色后，利用顯微鏡進(jìn)行拍照觀察記錄。與Control組相比，TNF-α刺激后原代GMCs遷移數(shù)量顯著增多(圖6A)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析可知，TNF-α刺激后原代GMCs遷移能力增強(qiáng)(圖6A)。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，TNF-α刺激組劃痕愈合率增加(圖6B)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

圖5 TNF-α對(duì)原代GMCs活力以及增殖的影響 ×50

圖6 TNF-α對(duì)獼猴原代腎小球系膜細(xì)胞遷移的影響 ×50

膠原酶法和組織黏附法是目前培養(yǎng)原代GMCs常用的方法。膠原酶消化法適用于大部分的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，然而組織黏附法只適用于幼年時(shí)期的動(dòng)物，這對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡有限制。本實(shí)驗(yàn)利用組織黏附法貼獼猴原代GMCs，但是未見(jiàn)原代GMCs移出，所以結(jié)合以上原因，采取了膠原酶消化法獲取原代GMCs。由于不同動(dòng)物適用的消化條件不同，所以課題組對(duì)比了幾種不同的消化濃度和時(shí)間，根據(jù)腎小球活性、貼壁數(shù)量、GMCs貼出的時(shí)間和GMCs傳代后的狀態(tài)，選出最適合獼猴原代GMCs的消化條件(0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化10 min)。根據(jù)以上結(jié)果可知Ⅳ型膠原酶消化濃度過(guò)大或者消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致腎小球活性降低，不容易貼出細(xì)胞，貼出的細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢。0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化10 min細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，這與已有文獻(xiàn)報(bào)道的消化濃度相比較低，保持腎小球活性。之前小鼠提取腎小球過(guò)程中，需要利用三層篩網(wǎng)才能提取出較純的腎小球，但是本實(shí)驗(yàn)采用了兩層篩網(wǎng)便提取出較純腎小球。在培養(yǎng)過(guò)程中，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶的時(shí)間很重要，一般為4～5 h，若時(shí)間過(guò)短腎小球則未貼壁；過(guò)長(zhǎng)則導(dǎo)致腎小球組織活性喪失。首次換液時(shí)間一般為3～4 d且為半定量換液，之后每天觀察GMCs的移出情況。由于適宜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的血清濃度為5%，培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞通常需要額外加生長(zhǎng)因子，體外培養(yǎng)要求條件與GMCs不同，且原代上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)一般需要5～7 d傳代，而GMCs則需要21～30 d[11]。經(jīng)過(guò)以上條件篩選和形態(tài)學(xué)觀察，以及利用免疫熒光和Western blot法檢測(cè)特異性蛋白表達(dá)鑒定提取的GMCs符合實(shí)驗(yàn)要求。本次實(shí)驗(yàn)顯示，系膜細(xì)胞傳5～6代形態(tài)和功能便開(kāi)始變化，不能支持后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子，主要由多種免疫細(xì)胞(如活化的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)產(chǎn)生[12]，生理?xiàng)l件下，它具有顯著的抗病毒效應(yīng)，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的作用[13]。炎癥狀態(tài)下，TNF-α可以通過(guò)NF-κB通路導(dǎo)致GMCs功能發(fā)生改變[14]。所以本實(shí)驗(yàn)選用TNF-α為刺激劑，檢測(cè)獼猴原代GMCs功能的變化，經(jīng)刺激后原代GMCs的增殖和遷移能力顯著增強(qiáng)，這提示獼猴原代GMCs提取成功。

GMCs是體外研究腎小球疾病的一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，它存在于腎小球毛細(xì)血管袢中，能維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能。人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型對(duì)于了解疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和治療干預(yù)方式至關(guān)重要。人類(lèi)與非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物各個(gè)系統(tǒng)發(fā)育具有密切的聯(lián)系，并且與它們的生理有許多相似之處，例如高度相似的免疫系統(tǒng)以及相似的組織結(jié)構(gòu)等[15]。之前無(wú)論是小鼠、大鼠、兔等動(dòng)物原代GMCs，都難以完整體現(xiàn)人原代GMCs的生理病理功能。本研究以獼猴為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成功探索出非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物GMCs的分離方法，并對(duì)GMCs的功能進(jìn)行了鑒定，為研究腎臟相關(guān)疾病提供了一個(gè)體外細(xì)胞模型。