張 帆，陳 麗，曹旭東，趙春輝，陳小林

作者單位：南方科技大學(xué)醫(yī)院心內(nèi)科，深圳 518055

缺血性心臟病是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的重要原因，再灌注治療是挽救缺血心肌的關(guān)鍵[1]，然而再灌注損傷的存在極大限制了治療效果，因此探討心肌缺血再灌流(myocardial ischemia reperfusion, MI/R)損傷的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療方法一直是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。Sirtuins是一類高度保守的組蛋白去乙酰化酶家族，其中沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator,SIRT1)在心血管系統(tǒng)中研究最為廣泛[2]，在應(yīng)激下調(diào)控心肌細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)；此外，SIRT1在缺血再灌流損傷中保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響[3]。

鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2, SGLT2)抑制劑如恩格列凈(empagliflozin, EMPA)是一類新型的降糖物，選擇性抑制腎近端小管SGLT2對(duì)葡萄糖的重吸收，降低血糖[4]。EMPA還表現(xiàn)出了不依賴降糖的心血管保護(hù)功能，包括降低血壓、血脂和尿酸，控制體質(zhì)量和改善腎功能損傷等[5]。EMPA-REG OUTCOME試驗(yàn)首次證實(shí)了EMPA具有心血管保護(hù)作用[6]。因此，該研究擬采用離體心臟MI/R模型，探討EMPA通過激活SIRT1信號(hào)改善非糖尿病大鼠MI/R中氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與動(dòng)物EMPA和氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；丙二醛(malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和琥珀酸脫氫酶(succinodehydrogenase,SDH)含量和活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；EX527購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，先用DMSO溶解后再用灌流液稀釋；Cytochrome c、Cleaved caspase-3、SOD2、gp91phox和SIRT1抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Siginal Technology公司；GAPDH、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；40只8周齡雄性SD大鼠購(gòu)自南方科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量約220 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)使用許可證：SYXK(粵)2017-0170，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水、飲食，所有動(dòng)物操作經(jīng)南方科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意，并嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 Langendorff離體心臟灌流和實(shí)驗(yàn)分組采用以往離體心臟灌流的方法[7]，簡(jiǎn)述如下：2%異氟烷吸入式麻醉大鼠，固定在恒溫手術(shù)臺(tái)，快速暴露心臟并游離，將心臟固定在Langendorff主動(dòng)脈逆行灌流管口，用Krebs-Henseleit(KH)液灌流20 min，KH液包含：118 mmol/L NaCl、25 mmol/L NaHCO3、4.75 mmol/L KCl、0.94 mmol/L KH2PO4、1.2 mmol/L MgSO4、1.4 mmol/L CaCl2、7 mmol/L Glucose、0.4 mmol/L oleate、1% 牛血清白蛋白、10 mU/ml 胰島素，維持37 ℃，pH 7.4；將含有液體的球囊插入左室，連接Chart 8數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)左室壓力變化，調(diào)節(jié)球囊內(nèi)液體使各組初始左室舒張末壓為0.67 kPa。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為：對(duì)照組(Control)、心肌缺血再灌流組(MI/R)、EMPA聯(lián)合MI/R組(EMPA+MI/R)以及EMPA和EX527聯(lián)合MI/R組(EMPA+EX527+MI/R)；心臟缺血40 min，再灌流2 h，EMPA+MI/R組再灌流開始前給予2.5 mol/L EMPA處理10 min，EMPA+EX527+MI/R組再灌流開始前先給予10 mol/L EX527處理5 min，再給予2.5 mol/L EMPA處理10 min。根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道[7]確定EMPA的濃度。

1.3 心肌梗死面積的測(cè)量實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，快速用干冰將心臟冰凍，沿心臟縱軸將心臟切成約2 mm薄片，將中間的一片放入1% TTC溶液中37 ℃避光水浴15 min，再放入4%多聚甲醛中固定2 d，拍照后用Image J軟件測(cè)量面積，心肌梗死面積比例=白色區(qū)面積/總面積100%。

1.4 心臟功能的記錄利用Chart 8數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(AdInstruments)記錄左室壓力(Left ventricular pressure,LVP)、左室收縮峰壓(Left ventricular systolic peak pressure,LVSP)和左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)的變化，比較各組LVSP和LVEDP數(shù)值的變化。

1.5 HE染色再灌流結(jié)束后，取下心臟并浸泡在4%多聚甲醛中固定2 d，再采用脫水復(fù)蠟將各組心臟包埋制備成蠟塊切片，常規(guī)HE染色，并在鏡下拍照觀察。

1.6 ELISA檢測(cè)按照MDA、SOD和SDH試劑盒說明書的步驟，提取心肌組織樣品，配制工作液和標(biāo)準(zhǔn)品，并測(cè)定樣品濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組心肌組織中MDA含量，SOD和SDH活性。

1.7 DHE染色再灌注結(jié)束后，立即用OCT包埋劑將心臟包埋并切成薄片；用濃度為10 μmol/L的DHE染液按照說明書步驟在37 ℃水浴避光孵育1 h，利用激光共聚焦顯微鏡觀察并保存各組ROS圖像。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)稱量左室前壁部位心肌組織，加RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑在冰上研磨裂解30 min，低溫高速離心機(jī)26 000 r/min 4 ℃離心20 min，棄沉淀，上清液中加入上樣緩沖液，金屬浴煮10 min，分裝并凍存于-80 ℃冰箱；經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，低溫濕轉(zhuǎn)，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，切膜并放入相應(yīng)一抗Cytochrome c、Cleaved caspase-3、SOD2、gp91phox、SIRT1和GAPDH中4 ℃過夜；TBST洗膜6次，每次5 min，用相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜6次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光，Image J圖像分析軟件分析條帶灰度，GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用表示，并用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的比較如圖1，Control組大鼠心肌纖維排列有序，心臟LVSP和LVEDP正常；MI/R組大鼠心肌纖維出現(xiàn)斷裂，LVSP降低，LVEDP升高，與Control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=134.7，P<0.001)；EMPA+MI/R組能改善心肌纖維排列，減輕斷裂，LVSP增加，LVEDP降低，和MI/R組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=106.3，P<0.001)；而使用SIRT1抑制劑EX527后，能逆轉(zhuǎn)EMPA對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用，心肌纖維出現(xiàn)斷裂，LVSP降低，LVEDP升高，和EMPA+MI/R組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=142，P<0.001)。

2.2 各組大鼠心肌梗死面積和細(xì)胞凋亡的比較如圖2，TTC染色和Western blot結(jié)果表明：Control組心肌組織梗死面積為(0.87±0.62)%，凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Cytochrome c蛋白表達(dá)量低；與Control組比較，MI/R組心肌梗死面積為(33.2±6.90)%，Cleaved caspase-3和Cytochrome c蛋白表達(dá)增加(F=116，P<0.001)；與MI/R組比較，EMPA+MI/R組心肌梗死面積為(10.1±7.24)%，Cleaved caspase-3和Cytochrome c蛋白表達(dá)降低(F=91.6，P<0.001)。與EMPA+MI/R組比較，EMPA+EX527+MI/R組心肌梗死面積為(32.8±7.06)%，Cleaved caspase-3和Cytochrome c蛋白表達(dá)量增加(F=99.8，P<0.001)。

2.3 各組大鼠心肌SIRT1、gp91phox和SOD2蛋白表達(dá)的比較如圖3，Western blot結(jié)果表明：和Control組比較，MI/R組心肌組織中SIRT1和SOD2蛋白表達(dá)降低，gp91phox蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；和MI/R組比較，EMPA+MI/R組心肌組織中SIRT1和SOD2蛋白表達(dá)增加，gp91phox蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；而和EMPA+MI/R組比較，EMPA+EX527+MI/R組心肌組織中SIRT1和SOD2蛋白表達(dá)降低，gp91phox蛋白表達(dá)增加(P<0.01)。

圖1 各組間心臟結(jié)構(gòu)和功能的比較

圖2 各組間心肌梗死面積和細(xì)胞凋亡的比較

圖3 各組心肌SIRT1、gp91phox和SOD2蛋白表達(dá)的比較

圖4 各組心肌氧化應(yīng)激損傷的比較

2.4 各組大鼠心肌氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)的比較如圖4，DHE染色和ELISA結(jié)果表明：和Control組比較，MI/R組ROS表達(dá)和MDA含量增加，SOD和SDH活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.2，P<0.001)；和MI/R組比較，EMPA+MI/R組ROS表達(dá)和MDA含量降低，SOD和SDH活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=57.5，P<0.001)；和EMPA+MI/R組比較，EMPA+EX527+MI/R組ROS表達(dá)和MDA含量增加，SOD和SDH活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=72.7，P<0.001)。

3 討論

盡管在藥物和手術(shù)治療方面均取得了巨大進(jìn)步，缺血性心臟病仍然是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的重要原因[8]。冠狀動(dòng)脈持續(xù)的缺血或缺氧會(huì)導(dǎo)致不可逆的心肌壞死，并可能伴有心律失常、休克或心力衰竭等嚴(yán)重事件[9]。隨著再灌流治療的發(fā)展，急性心肌梗死患者缺血引起的心肌損傷已明顯減輕，然而，再灌流引起的心肌損傷卻越來越明顯，這也成為了嚴(yán)重限制再灌流治療效果的瓶頸因素。本研究探討了SGLT2抑制劑EMPA在大鼠離體心臟缺血再灌流模型中的保護(hù)作用和機(jī)制，為EMPA在心血管疾病中的應(yīng)用提供了新的依據(jù)。

研究[5-6]表明，SGLT2抑制劑具有良好的心血管保護(hù)作用。而EMPA在糖尿病心肌損傷尤其是糖尿病MI/R損傷中具有明確的保護(hù)作用，EMPA能減小糖尿病小鼠MI/R后心肌梗死面積，改善左室舒張功能[10]。另外，EMPA還能改善肥胖和糖尿病小鼠心肌纖維化，降低心肌氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[11]。然而，EMPA在非糖尿病MI/R中的作用尚不清楚。本研究顯示，EMPA能夠減輕非糖尿病大鼠離體心臟缺血再灌流后心肌纖維斷裂，改善心臟功能，抑制細(xì)胞凋亡，這些結(jié)果證明了EMPA在非糖尿病大鼠MI/R中的保護(hù)作用。另外，SIRT1抑制劑EX527能夠逆轉(zhuǎn)EMPA的這些保護(hù)作用，這說明SIRT1參與EMPA的MI/R保護(hù)作用。

線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。在心肌缺血再灌流損傷中，ROS導(dǎo)致的線粒體氧化應(yīng)激促進(jìn)了心肌細(xì)胞凋亡并加重心肌氧化應(yīng)激損傷[12]。細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來源是NADPH氧化酶家族，而其中g(shù)p91phox亞型在心肌病理性重塑中發(fā)揮重要作用[13]。SIRT1在心肌缺血再灌流中發(fā)揮重要的抗氧化和抗凋亡作用，增加SIRT1表達(dá)和去乙?；富钚钥梢砸种芌OS累積和MDA含量并上調(diào)抗氧化酶如SOD和SDH活性[14]；同時(shí)，SIRT1抑制凋亡蛋白Caspase-3激活和Bax的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)[15]。本研究顯示，MI/R后心肌線粒體氧化應(yīng)激損傷增加，表現(xiàn)為ROS和MDA含量以及gp91phox表達(dá)增加，SOD和SDH活性降低；而EMPA能明顯降低MI/R中ROS和MDA含量以及gp91phox表達(dá)，增加SOD和SDH活性；而應(yīng)用EX527后能逆轉(zhuǎn)EMPA抗氧化應(yīng)激損傷的作用。與此同時(shí)，EMPA能夠上調(diào)MI/R處理后SIRT1的表達(dá)，而EX527可以阻斷EMPA的這一作用，這些結(jié)果都表明SIRT1參與EMPA抗MI/R氧化應(yīng)激損傷的作用。

綜上所述，本研究首次在非糖尿病大鼠心臟缺血再灌流損傷中證實(shí)，EMPA具有通過減輕心肌細(xì)胞凋亡和線粒體氧化應(yīng)激水平改善大鼠心臟損傷的作用，而這一作用與調(diào)控SIRT1信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為EMPA在非糖尿病心血管疾病中發(fā)揮保護(hù)作用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，也為EMPA在臨床治療心血管疾病的應(yīng)用提供了依據(jù)。