吳 昊，楊 琳，唐麗琴,2，魏 偉

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 2300322中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，合肥 230001

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是一種慢性腎病，是1型和2型糖尿病的一種慢性微血管并發(fā)癥。高血糖、高血脂、代謝異常、微血管循環(huán)障礙和炎癥反應(yīng)等都可以引起糖尿病腎病的發(fā)生。糖尿病腎病的主要病理特征是腎小球基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)增生、系膜細(xì)胞增殖、足細(xì)胞損傷和腎小管纖維化等[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和凋亡在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中起著重要作用，足細(xì)胞發(fā)生EMT和凋亡后會使腎小球的濾過屏障受損，腎小球?yàn)V過率降低，出現(xiàn)蛋白尿，加快糖尿病腎病進(jìn)程。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是酪氨酸激酶2(janus kinase 2，JAK2)的下游信號[3]，JAK2的激活可引起STAT3的磷酸化，磷酸化的STAT3會影響細(xì)胞的生長、凋亡和EMT過程[4]。小檗堿(berberine，BBR)是一種季銨類生物堿，具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂、抑制炎癥和腎臟保護(hù)等作用，課題組前期研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，BBR可能在DN的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，但是其具體機(jī)制仍不清晰。因此該文研究了BBR對足細(xì)胞EMT和凋亡的緩解作用以及其與JAK2/STAT3信號通路的關(guān)系，為臨床上對DN的防治提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器小鼠MPC5細(xì)胞系(BNCC 337685)，BBR(BW 50137，純度為98.37%，高效液相色譜法)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。細(xì)胞凋亡試劑盒(貨號：AP101-100-kit，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；抗熒光淬滅劑(貨號：P0126，上海碧云天公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(貨號 ：SH30809.01，上海江林生物科技有限公司)；Transwell 小室(貨號：3422，Corning公司)；兔抗磷酸化酪氨酸激酶2(phosphorylated janus kinase 2，p-JAK2)抗體(貨號：4406T)、鼠抗STAT3抗體(貨號：9139S)、兔抗磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3)抗體(貨號：9145S)、兔抗細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子(bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim)抗體(貨號：2933)購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗JAK2抗體(貨號：17670-I-AP)、鼠抗波形蛋白(vimentin)抗體(貨號：60330-1-Ig)購自武漢Proteintech公司；兔抗足細(xì)胞裂孔膜蛋白(nephrin)抗體(貨號：ab216341)、鼠抗α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(貨號：ab7817)購自英國abcam公司。激光共聚焦顯微鏡購自德國萊卡公司；OLYMPUS CKX 31型倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯有限公司；FC貝克500型貝爾曼流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；電泳架購自北京六一儀器廠；Image Quant Las 4000 mini型化學(xué)發(fā)光成像分析儀購自美國GEHealthcare Life Sciences公司；電子分析天平購自上海精天電子儀器廠。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇的足細(xì)胞用含有10%血清、1%雙抗、0.2% γ-干擾素的 RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶的90%左右時，消化離心進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 6孔板中加入2 ml 1×106/ml細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為5組，即正常組(Control，葡萄糖濃度11.1 mmol/L)、模型組(HG，葡萄糖濃度30 mmol/L)和不同濃度BBR給藥組(30、60、90 μmol/L)，按分組加高糖刺激和給藥之后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用不含EDTA的胰酶消化，1 500 r/min，4 ℃離心10 min后，去除上清液，每管加入500 μl稀釋5倍的Binding buffer，混勻，將混勻后的液體轉(zhuǎn)移至流式管中，加入凋亡試劑盒中的相應(yīng)抗體，室溫避光孵育5 min后，上機(jī)檢測觀察每組細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 在6孔板背面水平劃出三條平行的直線，間距相等，然后將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，待細(xì)胞長至6孔板的80%左右時在孔中均勻的劃出與背面直線垂直的三條直線，PBS清洗2次，分組加刺激和給藥同1.2.2項(xiàng)，于0、24 h在顯微鏡下拍照留存，用image J軟件分析劃痕面積，并按公式計算劃痕愈合率，劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100 %。

1.2.4Transwell法檢測細(xì)胞遷移 24孔板中加入500 μl含15% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，然后將Transwell小室放入24孔板中，上室加入200 μl 1×104/ml含5% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液，分組和加藥同1.2.2項(xiàng)，培養(yǎng)24 h后取出 Transwell小室，預(yù)冷PBS洗2次，洗去死細(xì)胞，用含0.05%結(jié)晶紫的PBS染色20 min，PBS清洗2次，擦去上室未遷移的細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果，隨機(jī)選取5個視野拍攝保存，計算每個視野的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 將細(xì)胞懸液以1×108個/孔接種于6孔板，分組及加藥同1.2.2項(xiàng)，37 ℃培養(yǎng)24 h后，PBS清洗2次去除死細(xì)胞，每孔加100 μl RIPA細(xì)胞裂解液(RIPA ∶PMSF ∶磷酸酶抑制劑=99 ∶1 ∶1)，放置1 h后，將細(xì)胞刮下并收集于EP管，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，吸上清液于新的EP管中，加入適量5×蛋白上樣緩沖溶液，煮沸10 min后得到蛋白。進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，分別孵育nephrin、α-SMA、vimentin、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bim蛋白對應(yīng)抗體，最后于化學(xué)發(fā)光成像分析儀上進(jìn)行檢測，所得結(jié)果用image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.6激光共聚焦法檢測nephrin、α-SMA、vimenin的表達(dá) 將細(xì)胞懸液接種于含有蓋玻片的24孔板中，分組加刺激和給藥同1.2.2項(xiàng)，37 ℃培養(yǎng)24 h后，預(yù)冷PBS洗去死細(xì)胞，經(jīng)過4%多聚甲醛100 μl固定30 min、0.5% BSA 120 μl封閉1 h、一抗80 μl 4 ℃孵育過夜、熒光二抗(1 ∶100)120 μl 37 ℃孵育2 h、DAPI 100 μl染核10 min等步驟后，指甲油封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光結(jié)果并拍照留存。

2 結(jié)果

2.1 BBR對足細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示(圖 1)，HG組與Control組相比，足細(xì)胞凋亡率上升(F=38.627，P<0.01)；BBR給藥組(30、60、90 μmol/L)與HG組相比，足細(xì)胞凋亡率逐漸降低。

2.2 BBR對足細(xì)胞遷移能力的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2A)，HG組與Control 組相比，劃痕愈合率增加(F=34.139，P<0.01)；BBR給藥組(30、60、90 μmol/L)與HG組相比，劃痕愈合率逐漸降低，BBR給藥組(30、60、90 μmol/L)均能降低足細(xì)胞的異常遷移。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2B)，HG組與Control組相比，遷移到下室的足細(xì)胞增多(F=51.417，P<0.01)；BBR給藥組(30、60、90 μmol/L)與HG組相比，遷移到下室的足細(xì)胞減少。

2.3 BBR對p-JAK2、p-STAT3和Bim蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示(圖 3)，HG組與Control組相比，足細(xì)胞的p-STAT3、Bim和p-JAK2的蛋白表達(dá)增加(F=10.875、30.433、13.709，P<0.05)；BBR給藥組(30、60、90 μmol/L)與HG組相比，足細(xì)胞的p-STAT3、Bim和p-JAK2的蛋白表達(dá)降低。

圖1 BBR對足細(xì)胞凋亡的影響

圖2 BBR對足細(xì)胞遷移能力的影響

圖3 BBR對p-JAK2、p-STAT3和Bim蛋白表達(dá)的影響

2.4 BBR對nephrin、α-SMA 和vimentin表達(dá)水平的影響Western blot結(jié)果顯示(圖4A)，HG組與Control組相比，足細(xì)胞上nephrin的蛋白表達(dá)降低(F=9.382，P<0.05)，vimentin和α-SMA的蛋白表達(dá)增加(F=6.628、3.683，P<0.05)；BBR給藥組(30、60、90 μmol/L)與HG組相比，能夠增加足細(xì)胞上nephrin的蛋白表達(dá)，降低vimentin和α-SMA的蛋白表達(dá)。激光共聚焦結(jié)果顯示(圖4B)，HG組與Control組相比，足細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上的nephrin的熒光強(qiáng)度降低(F=9.722，P<0.01)，足細(xì)胞質(zhì)上vimentin和α-SMA的熒光強(qiáng)度增加(F=12.931、4.820，P<0.05)，即nephrin的表達(dá)降低，vimentin和α-SMA的表達(dá)增加；BBR 給藥組(30、60、90 μmol/L)與HG組相比，能夠增加nephrin的熒光強(qiáng)度，降低vimentin和α-SMA的熒光強(qiáng)度，即nephrin的表達(dá)增加，vimentin和α-SMA的表達(dá)降低。

3 討論

足細(xì)胞是一種終末分化的上皮細(xì)胞，覆蓋在腎小球基底膜外，是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，對維持腎小球?yàn)V過功能至關(guān)重要[7]。DN時，足細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量發(fā)生變化，即足細(xì)胞肥大，足突融合甚至消失，足細(xì)胞丟失等[8]。足細(xì)胞丟失是DN足細(xì)胞損傷的顯著性標(biāo)志，有研究[9]發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞EMT和凋亡是造成足細(xì)胞丟失的主要機(jī)制，它們在足細(xì)胞損傷中起著關(guān)鍵作用。足細(xì)胞EMT是指足細(xì)胞失去其標(biāo)志性的上皮特征而獲得間充質(zhì)細(xì)胞特征的過程。足細(xì)胞發(fā)生EMT后，其上皮細(xì)胞樣標(biāo)志蛋白如nephrin、E-cadenrin和ZO-1等表達(dá)降低，間充質(zhì)細(xì)胞樣標(biāo)志蛋白如α-SMA、vimentin等表達(dá)升高，遷移能力增加，可使足細(xì)胞從腎小球基底膜上脫落，使腎小球?yàn)V過屏障受損，出現(xiàn)蛋白尿[10-11]。足細(xì)胞凋亡是足細(xì)胞的一種程序化死亡，發(fā)生凋亡后，其凋亡能力升高，數(shù)量顯著減少，可使腎小球的濾過屏障受損，腎小球的濾過率降低，進(jìn)而出現(xiàn)一系列腎臟疾病。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，使用30 mmol/L葡萄糖成功刺激足細(xì)胞24 h 后，足細(xì)胞出現(xiàn)EMT和凋亡現(xiàn)象。與Control組相比，HG組足細(xì)胞的遷移能力增加，足細(xì)胞上nephrin表達(dá)降低，α-SMA、vimentin和Bim表達(dá)增加。而不同濃度BBR 給藥后，足細(xì)胞的凋亡率降低，異常遷移減少，足細(xì)胞上nephrin表達(dá)增加，α-SMA、vimentin和Bim表達(dá)降低。這些結(jié)果說明BBR可以緩解高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT和凋亡，發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞作用。但具體作用機(jī)制不明，仍需進(jìn)一步探索。

JAK2/STAT3信號通路是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在生物體中廣泛存在，參與多種疾病的發(fā)展過程。JAK2是STAT3的上游激酶，活化后的JAK2會激活 STAT3，使STAT3在Y705位點(diǎn)上被磷酸化[12]。磷酸化的STAT3會以二聚體的形式從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，激活細(xì)胞因子應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄[13]。研究[14]表明，JAK2/STAT3信號通路在細(xì)胞的EMT和凋亡中發(fā)揮著重要作用，如：JAK2/STAT3通路可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Slug的上調(diào)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT過程；姜黃素可通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活來緩解膿毒癥腎損傷細(xì)胞的異常凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測JAK2/STAT3信號通路的相關(guān)蛋白顯示，HG刺激足細(xì)胞后，p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá)增加，足細(xì)胞發(fā)生EMT和凋亡現(xiàn)象。BBR 給藥后，p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)降低，足細(xì)胞的EMT和凋亡現(xiàn)象隨之減輕。由此可以得出，高糖可能通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號通路導(dǎo)致足細(xì)胞EMT和凋亡，而BBR可能通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號通路來緩解這種現(xiàn)象的發(fā)生。

圖4 BBR對nephrin、α-SMA和vimentin表達(dá)的影響

綜上所述，HG刺激能夠激活JAK2/STAT3信號通路，誘導(dǎo)足細(xì)胞的EMT和凋亡過程，而BBR可以通過抑制JAK2/STAT3信號通路來緩解足細(xì)胞的EMT和凋亡過程，調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮對足細(xì)胞保護(hù)作用。