管 婉 儲(chǔ) 婷 鮑大鵬 黃天宇, 張 建, 黃衛(wèi)華 李福后 唐利華,,3,*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403；2 江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；3 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；4 浙江省慶元縣食用菌科研中心，浙江 慶元 323800)

香菇(Lentinulaedodes)起源于我國(guó)，別名香信、冬菇、菊花菇、香紋，是世界上久負(fù)盛名的食用菌。隨著近年來(lái)我國(guó)農(nóng)業(yè)優(yōu)惠政策相繼實(shí)施，我國(guó)香菇產(chǎn)量持續(xù)增長(zhǎng)并穩(wěn)居世界前列。然而，現(xiàn)階段我國(guó)的香菇生產(chǎn)模式和生產(chǎn)工藝較發(fā)達(dá)國(guó)家仍相對(duì)落后，優(yōu)化栽培模式與生產(chǎn)參數(shù)迫在眉睫。

光照是食用菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要影響因素[1-2]，不同品種食用菌對(duì)光照條件的要求各異[3-4]。已有研究報(bào)道，黑暗處理有利于白僵菌加拿大1號(hào)菌株菌絲生長(zhǎng)[5]，而藍(lán)光誘導(dǎo)能夠促進(jìn)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)提高蛹蟲(chóng)草蟲(chóng)草素含量[6]，一定量的藍(lán)光照射對(duì)杏鮑菇子實(shí)體的形態(tài)發(fā)育有明顯促進(jìn)作用[7]。香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色作為香菇菌絲發(fā)菌完成后的重要生理成熟過(guò)程，其轉(zhuǎn)色的好壞直接影響到香菇原基的發(fā)生和發(fā)育，在香菇出菇管理中至關(guān)重要。已有試驗(yàn)表明，光能夠誘導(dǎo)香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色[8]，但缺乏具體的作用機(jī)制研究。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)作為生物體內(nèi)的信號(hào)分子，其作用早已被廣泛關(guān)注。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶作為活性氧的主要來(lái)源，對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)控同樣具有重要作用[9-10]?，F(xiàn)今關(guān)于光照與活性氧在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)制研究已經(jīng)十分深入，如弱光下蘋(píng)果葉片的過(guò)氧化氫含量、超氧陰離子產(chǎn)生速率以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量均大幅升高時(shí)，過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)與超氧化物歧酶(superoxide dismutase, SOD)活性則顯著降低[11]。而在不適宜的光環(huán)境下，會(huì)誘使生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮作用以維持體內(nèi)氧化平衡，如提高抗氧化酶[過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)、POD、SOD]活性來(lái)適應(yīng)強(qiáng)光環(huán)境[12]。但目前關(guān)于光照對(duì)食用菌生長(zhǎng)發(fā)育的影響研究仍鮮有報(bào)道。

本研究以自然光照條件與黑暗條件下香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色(10、30、50 d)的菌皮為材料，檢測(cè)其活性氧代謝變化情況，并通過(guò)透射電鏡分析及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)對(duì)自噬基因Atg8的表達(dá)水平進(jìn)行分析，旨在進(jìn)一步明確香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色過(guò)程的光照條件，為后續(xù)香菇栽培及其菌絲轉(zhuǎn)色的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

香菇(Lentinulaedodes)菌株W1，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

1.2 試驗(yàn)試劑

1.3 主要儀器

ECAN Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；DW-86L626超低溫冰箱，海爾集團(tuán)青島海爾冰箱有限公司；5418R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;HC110-PRO恒溫金屬浴，北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司；KMC-1300V漩渦混合器，韓國(guó)Biocex公司；UV-1800分光光度計(jì)，上海島津企業(yè)管理有限公司；HP-2132精密色差儀，蘇州美方機(jī)電有限公司；FTC3000熒光定量PCR儀，上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)所用香菇菌包濕重300 g，含水量65%，木屑質(zhì)量占79%，麩皮質(zhì)量占20%，石膏質(zhì)量占1%，置于上海國(guó)森生物科技有限公司的香菇菇房(光照強(qiáng)度200～300 Lx，濕度75%～85%，每天光照12 h)培養(yǎng)。設(shè)置光照組(Light)與黑暗組(Dark)，從香菇菌包接種后開(kāi)始觀察記錄，分3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，每次間隔20 d，分別為轉(zhuǎn)色10、30、50 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)光照組和黑暗組隨機(jī)各取3包，使用色差儀在每個(gè)菌包的表層四周隨機(jī)取10個(gè)均勻散布的點(diǎn)測(cè)量色差值(L*值)，計(jì)算每個(gè)菌包的平均色差值(L*值)，再計(jì)算每組的平均色差值(L*值)，最后將菌包破袋后用手術(shù)刀刮取表層菌皮，迅速液氮速凍待測(cè)。

1.5 透射電鏡的自噬分析

用 2.5% GA將轉(zhuǎn)色50 d的香菇光照組與黑暗組樣品迅速固定后，送往武漢紐泰斯生物科技有限公司利用透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)分析細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)變化。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因Atg8的表達(dá)情況

轉(zhuǎn)色時(shí)間最久的50 d光照組和黑暗組表征對(duì)比最明顯(圖1)，最具進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。為進(jìn)一步分析光照對(duì)香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色影響的自噬情況，取香菇菌絲轉(zhuǎn)色50 d的光照組與黑暗組樣品，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)，先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后設(shè)計(jì)特異性的引物(表1)和sybr green I熒光染料進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。qRT-PCR反應(yīng)體系50 μL：2×PCR buffer 25 μL，正反引物(25 mol·μL-1)各1 μL，cDNA 2 μL，DEPC水21 μL。qRT-PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性20 s，59℃退火20 s，72℃延伸25 s，35個(gè)循環(huán)；94℃ 90 s，60℃ 3 min，72℃檢測(cè)信號(hào)。采用2-ΔΔCt法分析香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色不同時(shí)期自噬相關(guān)基因Atg8的相對(duì)表達(dá)量。

表1 本研究中使用的引物Table 1 The primers used in this study

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Graphed prism 8對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖，每個(gè)試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，圖中數(shù)值均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照對(duì)香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色的影響

注：***表示同一時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.001)。Note: *** indicate significant difference at 0.001 level at the same time point.圖1 光照(上)與黑暗(下)處理后香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色10 d(A)、30 d(B)、50 d(C)情況及色差L*值變化(D)Fig.1 Brown film formation of Lentinula edodes after light (top) and dark (bottom) treatments for 10 d (A), 30 d (B), and 50 d (C) and changes in color difference L* values (D)

試驗(yàn)選用光照組與黑暗組兩組處理，在香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色10 d(圖1-A)、30 d(圖1-B)、50 d(圖1-C)分別拍照記錄及分析取樣，L*值代表明暗度(黑白)，L*值越大，說(shuō)明顏色越白。香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色10 d的黑暗組色差值(77.46)大于光照組(66.67)(圖1-D)，在轉(zhuǎn)色10 d(圖1-A)可直觀觀察到光照處理下的香菇菌包菌絲濃密，菌皮顏色加深且伴有棕褐色菌皮，呈現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)色特征，而黑暗處理下的香菇菌包表層皆為白色菌絲，與菌絲剛長(zhǎng)滿時(shí)基本一致，表層無(wú)棕褐色菌皮生成，無(wú)轉(zhuǎn)色特征。香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色30 d的黑暗組色差值(75.65)大于光照組(53.5)(圖1-D)，在轉(zhuǎn)色30 d(圖1-B)可直觀觀察到光照處理下的香菇菌包已有大面積棕褐色菌皮，而黑暗處理下的香菇菌包表層仍為白色菌絲，無(wú)轉(zhuǎn)色特征。香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色50 d的黑暗組色差值(66.08)遠(yuǎn)大于光照組(42.34)(圖1-D)，在轉(zhuǎn)色50 d(圖1-C)可直觀觀察到光照處理下的香菇菌包轉(zhuǎn)色即將完成，而黑暗處理下的香菇菌包表層仍為白色菌絲，無(wú)轉(zhuǎn)色特征。由光照組與黑暗組的L*值(圖1-D)表明，隨著發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，光照組和黑暗組的L*值都變小，黑暗組在轉(zhuǎn)色10和30 d的L值變化較小，但在轉(zhuǎn)色50 d時(shí)的L*值降低，可能是由于香菇菌絲在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不斷吸收營(yíng)養(yǎng)，菌絲老化引起菌皮表層顏色加深，因此L*值降低。相較于黑暗組，光照組L*值顯著降低，表明光照誘導(dǎo)香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色。綜上可知，黑暗條件下的香菇菌絲不轉(zhuǎn)色，香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色過(guò)程需要光照條件。

注：*、**和***分別表示同一時(shí)間點(diǎn)在0.05、0.01和0.001水平上差異顯著。下同。Note: *, ** and *** indicate significant difference at 0.05, 0.01 and 0.001 level at the same time point, respectively. The same as following.圖2 光照與黑暗處理后香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色期間H2O2含量(A)、O2·-含量(B)、MDA含量(C)、NADPH氧化酶活性(D)變化Fig.2 Changes of H2O2 content (A), superoxide anion content (B), MDA content (C) and NADPH oxidase activity (D) during postripeness color change of Lentinula edodes mycelia after light and dark treatment

2.2 光照對(duì)香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色期間活性氧含量的影響

在香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色10、30、50 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，光照組的H2O2含量(圖2-A)、O2·-含量 (圖2-B)、NADPH氧化酶活性(圖2-D)均高于黑暗組。其中H2O2含量與NADPH氧化酶活性變化趨勢(shì)較一致，在轉(zhuǎn)色50 d光照組O2·-含量與H2O2含量分別比黑暗組高128.6%、61.3%?？梢?jiàn)，光照時(shí)間越長(zhǎng)，光照對(duì)香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色的影響越大，活性氧含量越高。

圖3 光照與黑暗處理后香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色期間SOD活性(A)、CAT活性(B)、POD活性(C)變化Fig.3 Changes of SOD (A)、CAT activity (B)、POD (C) during postripeness color change of Lentinula edodes mycelia under light and dark treatment

MDA含量可以反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度。光照組的MDA含量(圖2-C)在轉(zhuǎn)色10 d顯著低于黑暗組，隨著后熟轉(zhuǎn)色時(shí)間增加，光照組的MDA含量又極顯著高于黑暗組，在轉(zhuǎn)色50 d時(shí)，光照組MDA含量較黑暗組高70.39%。而在光誘導(dǎo)香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色30 d，MDA含量最高，說(shuō)明不能僅依據(jù)H2O2含量判斷香菇過(guò)氧化程度，推測(cè)這與H2O2還能作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子參與基因分子調(diào)控有關(guān)。

2.3 光照對(duì)香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色期間抗氧化酶活性的影響

2.4 自噬特征的透射電鏡分析

香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色50 d是試驗(yàn)時(shí)間最久，光照組與黑暗組表征差異最大的時(shí)間點(diǎn)。由透射電鏡分析兩組自噬特征變化，光照組(圖4-A)中可直觀觀察到正在形成的新月?tīng)钔淌膳莺鸵呀?jīng)完成包裹的雙層膜多層膜自噬體，呈自噬特征。黑暗組(圖4-B)未觀察到自噬體，未出現(xiàn)自噬特征。

圖4 香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色50 d光照(A)與黑暗(B)處理的自噬比較Fig.4 Comparison of autophagy of Lentinula edodes mycelium after 50 days of postripeness color change under light (A) and dark (B)

2.5 自噬相關(guān)基因Atg8的表達(dá)情況

由圖5可知，香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色50 d光照組與黑暗組兩組自噬基因Atg8的表達(dá)量差異較大。與黑暗組相比，光照組Atg8基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高。

圖5 香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色后期(50 d)光照組與黑暗組自噬相關(guān)基因Atg8表達(dá)量Fig.5 Expression of autophagy related gene Atg8 in light group and dark group at the late stage during postripeness color change of Lentinula edodes mycelia (50 d)

3 討論

在本研究中，自然光照條件下香菇菌絲正常后熟轉(zhuǎn)色，而黑暗條件下香菇菌絲一直不轉(zhuǎn)色，與洪沛等[18]報(bào)道的不同光源條件下香菇菌絲生長(zhǎng)情況存在顯著差異的結(jié)果吻合。前人研究表明，活性氧在信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[19-22]。根據(jù)環(huán)境的不同，調(diào)節(jié)活性氧平衡可以啟動(dòng)不同的細(xì)胞反應(yīng)，包括觸發(fā)涉及細(xì)胞保護(hù)的信號(hào)通路、啟動(dòng)線粒體分裂和自噬激活[23-26]。厲曉東等[27]研究表明自噬在絲狀真菌細(xì)胞凋亡中有顯著影響，Atg8調(diào)控自噬體形成過(guò)程中自噬泡的延伸[28]，且自噬對(duì)于氧化應(yīng)激過(guò)程中活性氧積累所產(chǎn)生的細(xì)胞受損或有毒物質(zhì)的降解是必需的[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于不轉(zhuǎn)色的黑暗組，香菇菌絲轉(zhuǎn)色50 d的光照組Atg8基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高，這與房麗麗等[30]報(bào)道的香菇菌絲轉(zhuǎn)色后的Atg8表達(dá)量比轉(zhuǎn)色前高的結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明自噬參與香菇轉(zhuǎn)色過(guò)程。

現(xiàn)今，隨著香菇生產(chǎn)設(shè)施、設(shè)備條件的不斷改善和環(huán)境控制技術(shù)水平的不斷提高，對(duì)設(shè)施化和工廠化生產(chǎn)技術(shù)水平提出了更高的要求[31-33]。本研究探討不同光照環(huán)境對(duì)香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色的影響，分析活性氧與自噬在其中所起的作用，為香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色過(guò)程對(duì)光環(huán)境的需求提供了一定的理論依據(jù)，也為深入研究光綜合誘導(dǎo)特殊有效成分大量積累的特殊調(diào)控機(jī)制提供了有效參考。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色需要光照條件，黑暗條件下香菇菌絲不轉(zhuǎn)色。相比黑暗條件，自然光照條件下香菇菌絲活性氧含量整體呈升高趨勢(shì)，且細(xì)胞自噬特征明顯。本研究為進(jìn)一步探索香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色機(jī)制提供了參考，但關(guān)于光環(huán)境因素(光強(qiáng)、光源、光周期)對(duì)香菇菌絲后熟轉(zhuǎn)色的影響還有待進(jìn)一步深入研究。