楊玉珍

(南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院植物組織培養(yǎng)中心，河南南陽 473000)

野生彩茶“藍(lán)寶石”(cv. “l(fā)anbaoshi”),屬山茶科山茶屬灌木小葉種變種，發(fā)現(xiàn)于大別山腹地桐柏山天云峰北斗湖畔，牙尖初期呈紫紅色，散開后逐漸變藍(lán)色至深藍(lán)色。有反射藍(lán)光，故命名為“藍(lán)寶石”。送檢結(jié)果表明，其花青素含量約6.4 mg/g、氨基酸4.4%、茶多酚22.8%、茶紅素8.65%、茶褐素8.07%、茶黃素0.61%、咖啡堿3.8%。制作綠茶湯色黃綠相間，制作紅茶形如火焰，棕紅鮮艷，香味醇厚耐泡。彩茶母樹稀缺，若采用傳統(tǒng)的扦插繁育，由于基數(shù)少，成苗需3年左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場對該珍貴彩茶種苗的需求，因此急需快速大量繁育。目前，茶樹組織培養(yǎng)技術(shù)雖有成功先例，但彩茶尚缺少相關(guān)組織培養(yǎng)研究。有關(guān)資料顯示，茶樹組織培養(yǎng)中因多酚含量高，且自身攜帶較多內(nèi)生菌，導(dǎo)致外植體易污染、褐化嚴(yán)重、難以分化和生長緩慢等，其中最關(guān)鍵的問題是褐化，尤其是彩茶，檢測結(jié)果顯示其茶黃素、茶紅素、茶褐素、茶多酚、兒茶素、咖啡堿含量均較高，外植體更易褐化死亡。外植體能否克服褐化成活下來，是決定后期能否繼續(xù)開展組培與快速繁育的關(guān)鍵，也是彩茶良種無性繁殖技術(shù)的瓶頸問題。因此，筆者以彩茶“藍(lán)寶石”新生枝條為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，探尋建立快速繁育的關(guān)鍵技術(shù)，以期為彩茶產(chǎn)業(yè)化種植提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

供試材料為桐柏山野生彩茶“藍(lán)寶石”母株上采集的新生枝條。試驗地點在南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院植物組織培養(yǎng)中心。

將健壯彩茶枝條從山上帶回后沖洗干凈，基部浸泡在潔凈水中2 d，置于陰涼低溫處，每天換水，接種當(dāng)天把枝條取出，將彩茶“藍(lán)寶石”基部成熟葉片摘下，用洗滌劑溶液浸泡5 min左右，用軟毛刷仔細(xì)清洗后，剪成1.5 cm左右?guī)б秆康那o段。將帶腋芽的莖段分別用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡2 h，然后用800倍甲基托布津溶液浸泡2 h，然后用自來水沖洗0.5 h。

不同滅菌時間處理。將預(yù)處理后的莖段置于超凈工作臺上，先用75%乙醇消毒20 s，再置于0.1% HgCl溶液中分別處理10、12、15、20、25 min，再用無菌水沖洗5遍；根據(jù)文獻(xiàn)資料和預(yù)備試驗結(jié)果，用MS作為基本培養(yǎng)基，5個處理時間分別接種20瓶，每瓶接種1個莖段，10 d后觀察統(tǒng)計污染率、褐化率。

添加不同抗褐化成分對比。MS分別加入10 mg/L V溶液、1 g/L AC、100 mg/L PVP、10 mg/L V+1 g/L AC及對照(CK)共5個處理，每處理接種20瓶，每瓶接種1個莖段，10 d后觀察統(tǒng)計污染率、褐化率。

不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。將獲得的無菌莖段接種到培養(yǎng)基上，選取6-BA、NAA、IBA 3種激素進(jìn)行不同濃度的組合配比試驗，MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，探討其對彩茶“藍(lán)寶石”腋芽萌發(fā)的影響。每處理分別接種20瓶，每瓶接種1個外植體莖段，定期觀察無菌芽的生長情況，30 d后統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)情況。

叢生芽增殖培養(yǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)資料和以上的試驗結(jié)果，選擇 MS+1.0 mg/L 6-BA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置NAA濃度為0.5～1.0 mg/L，6-BA濃度為1.0～3.0 mg/L，IBA濃度為1.0～2.0 mg/L，GA濃度為0.5～1.0 mg/L，將誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的不定芽分切后，接種到增殖培養(yǎng)基上，每處理接種20瓶，每瓶接種1個芽叢，35 d后觀察芽的生長情況。

培養(yǎng)條件。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，3%蔗糖，0.5%瓊脂，pH 為5.6～5.8。光照時間12 h/d，強度2 500 lx，溫度控制在22～24 ℃。

2 結(jié)果與分析

由于茶樹植株中酚類物質(zhì)含量高，外植體切割時傷口的多酚類物質(zhì)遇到氧氣產(chǎn)生褐色醛類物質(zhì)，易擴(kuò)散到培養(yǎng)基使外植體和培養(yǎng)基褐變，以致外植體死亡。農(nóng)艷豐等研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加1.0 g/L V和1.0 g/L AC，能將外植體的褐化率降至41%。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)、預(yù)備試驗和以往經(jīng)驗，在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑及吸附劑也能減輕外植體在組織培養(yǎng)過程中褐變，如在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑V、PVP、活性炭，可以吸附培養(yǎng)基中的醌和酚等有害物質(zhì)，減輕褐變。因此，筆者首先將外植體基部浸泡在潔凈水中1 d，置于陰涼低溫處，每天換水進(jìn)行統(tǒng)一預(yù)處理，以有效隔斷氧化，溶解、稀釋傷口產(chǎn)生的酚類物質(zhì)，減少酚類物質(zhì)在培養(yǎng)基中的富集，有效減輕褐變。茶樹組織培養(yǎng)分為一般性污染和內(nèi)源性污染。內(nèi)源性污染是由植株自身攜帶的內(nèi)生菌引起的，一般的表面滅菌難以達(dá)到應(yīng)有的效果，建立無菌體系時，極易發(fā)生內(nèi)生菌污染。試驗用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡2 h，使高錳酸鉀對浸泡的莖段切口產(chǎn)生氧化，從而預(yù)先去除部分醌類物質(zhì)，以抑制褐化現(xiàn)象；然后用800倍甲基托布津溶液進(jìn)行浸泡2 d,以減少表面及內(nèi)生菌引起的污染，一系列預(yù)處理可有效降低因外植體滅菌處理時間過長導(dǎo)致的褐化死亡和污染。

將外植體采用 0.1% HgCl按不同時間滅菌，接種后20 d調(diào)查記錄，比較不同滅菌方式處理效果。由表1可知，對外植體采用不同滅菌時間處理，滅菌時間過長，對材料造成傷害，導(dǎo)致材料褐化枯死。處理12 min時間過短，滅菌不徹底，材料污染率高，達(dá)90%；處理24 min污染率低(20%)，但大部分莖段褪去綠色褐化死亡，枯死率達(dá)70%,說明滅菌劑在滅菌的同時傷害了莖段；滅菌處理20 min莖段污染率為35%，存活率達(dá)到35%，較為理想。

表1 不同滅菌時間對莖段存活率的影響Table 1 Effect of different sterilization time on stem survival rate

在預(yù)處理的基礎(chǔ)上，批量采用75%乙醇進(jìn)行表面消毒20 s，0.1% HgCl滅菌處理外植體20 min，接種10 d后，將存活莖段轉(zhuǎn)接到不同培養(yǎng)基中進(jìn)行進(jìn)一步抗褐化處理。由表2可知，不同處理對抗褐化均有一定的效果，4 個處理與 CK 相比，褐化率均有所降低，均控制在 45% 及以下。培養(yǎng)基中以添加10 mg/L V+1 g AC效果最好，存活率達(dá)75%。這與農(nóng)艷豐等的研究結(jié)果一致。該試驗表明，彩茶培養(yǎng)基中同時添加1 g/L AC和10 mg/L V能有效防止褐化。

表2 不同添加物對外植體的抗褐化效果Table 2 Anti-browning effect of different additives on explants

莖段在啟動培養(yǎng)基上15 d側(cè)芽開始萌動，30 d后將啟動培養(yǎng)的側(cè)芽切下，接種于添加不同激素的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，30 d后統(tǒng)計不同培養(yǎng)基中的不定芽生長情況。由表3可知， 6-BA濃度在0.5～1.0 mg/L 時，叢生芽的長勢較好，但2.0 mg/L 6-BA 時，叢生芽的分化數(shù)量逐漸減少。當(dāng)6-BA 濃度為2.0～3.0 mg/L時，外植體的基部誘導(dǎo)出了愈傷組織，腋芽生長緩慢，既不長高也不分化叢生芽。但隨著NAA濃度升高，叢生芽的長勢變差，芽誘導(dǎo)的個數(shù)逐漸減少。當(dāng)NAA為0.5 mg/L時，叢生芽呈綠色；而當(dāng) NAA為1.0 mg/L 時，叢生芽少，比較細(xì)弱，向上生長較快。比較配方E、F數(shù)據(jù)可知，1.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基添加較高濃度的NAA和IBA時有利于外植體腋芽誘導(dǎo)叢生芽，即1.0 mg/L 6-BA和 0.5 mg/L NAA時，添加IBA對叢生芽的生長有明顯的促進(jìn)作用，此時腋芽誘導(dǎo)叢生芽的效果較好，萌芽數(shù)量多，長勢最好。不同激素配比處理的不定芽誘導(dǎo)情況見圖1。

表3 不同激素配比處理誘導(dǎo)不定芽效果Table 3 Effects of different hormone ratios on the induction of adventitious buds

圖1 不同激素配比不定芽誘導(dǎo)情況Fig.1 Adventitious bud induction with different hormone ratios

誘導(dǎo)出不定芽后，需要繼續(xù)誘導(dǎo)大量叢生芽，試驗將誘導(dǎo)出的不定芽轉(zhuǎn)接到不同濃度組合增殖培養(yǎng)基中，篩選最佳增殖培養(yǎng)基，接種后30 d調(diào)查叢生芽增殖生長情況，結(jié)果見表4。由表4可知，增殖階段與腋芽誘導(dǎo)不定芽階段相比，6-BA濃度從1.0 mg/L增加到2.0 mg/L對不定芽的誘導(dǎo)增殖作用更明顯，不添加IBA改為添加GA后對不定芽誘導(dǎo)沒有明顯的促進(jìn)作用，說明GA對彩茶“藍(lán)寶石”叢生芽誘導(dǎo)生長作用不明顯，但過高濃度的6-BA反而導(dǎo)致叢生芽低矮，緊實，生長緩慢。從圖2可以看出，處理e的生長情況最好，當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L，NAA為1.0 mg/L，IBA 2.0 mg/L時有利于不定芽的分化，芽增殖倍數(shù)較高，達(dá)7，且苗健壯，生長快。叢生芽在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長25 d左右，將叢生芽切分后轉(zhuǎn)入新鮮的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每35 d繼代1次。

3 結(jié)論

該試驗在參考前人有關(guān)茶樹和其他富含內(nèi)生菌的外植體材料組織培養(yǎng)方案研究的基礎(chǔ)上，研究彩茶“藍(lán)寶石”的無菌體系建立及抗褐化方法，誘導(dǎo)出大量叢生芽，為快速繁育稀缺新種質(zhì)茶樹優(yōu)良種苗奠定基礎(chǔ)，同時為茶樹良種繁育和資源保存提供技術(shù)支持。該試驗外植體滅菌預(yù)處理為枝條清水浸泡，再用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡2 h，使高錳酸鉀對浸泡中的莖段切口產(chǎn)生氧化，從而預(yù)先去除部分醌類物質(zhì)，以降低酚類物質(zhì)氧化產(chǎn)生的褐化現(xiàn)象；然后用800倍甲基托布津溶液浸泡2 d以減少表面及內(nèi)生菌引起的污染，一系列預(yù)處理對降低外植體滅菌處理時間過長導(dǎo)致的褐化死亡和污染打下基礎(chǔ)。使用濃度0.1% HgCl溶液進(jìn)行滅菌，以20 min為較好。莖段腋芽誘導(dǎo)不定芽以較低濃度的NAA配合6-BA可誘導(dǎo)叢生芽的生長，但增殖及生長速度不高，前期高濃度6-BA還會導(dǎo)致褐化明顯，分析原因可能是由于6-BA刺激多酚氧化酶的活性，在外植體脫分化階段，分生能力強的細(xì)胞大量增殖，酚類的氧化會受到激活，從而誘導(dǎo)出大量愈傷組織生成。因此，野生彩茶腋芽誘導(dǎo)不定芽最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L；但在叢生芽增殖階段，已經(jīng)完成了脫分化，褐變已被抑制，增加激素用量不再引起褐變，誘導(dǎo)出無菌短枝和叢生芽經(jīng)分切后再用較高濃度激素的培養(yǎng)基，彩茶叢生芽的增殖效果較好，叢生芽的數(shù)量多，添加適量IBA后對無菌短枝的伸長效果明顯，長勢最好，因此篩選叢生芽增殖階段培養(yǎng)基以MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+IBA 2.0 mg/L為佳。后續(xù)需要繼續(xù)探討其他激素對生根的影響，篩選最適宜配比。試驗還發(fā)現(xiàn)試管苗幼嫩叢生芽階段彩茶葉色表現(xiàn)不明顯，大苗階段會呈現(xiàn)品種特性，生根試驗和移栽煉苗還需要進(jìn)一步探索和研究。

表4 不同激素配比對不定芽增殖的影響Table 4 Effects of different hormone ratio on inducing adventitious bud proliferation

圖2 不同激素配比不定芽增殖情況Fig.2 Proliferation of adventitious buds with different hormone ratios