田文曲，郭娜，任新玲，馬冰馨，姚青云，李倪捷，李鈺瑩

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院生殖中心，武漢 430000)

近年來，隨著人口老齡化、不良生活方式、環(huán)境惡化、工作壓力等多重因素的加劇，男性不育患者的數(shù)量逐年上升，男性因素引起的不育占不孕癥的40%左右[1]。盡管卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)在治療男性不育方面具有較好的臨床效果，但ICSI技術(shù)帶來的醫(yī)源性子代安全問題亟需引起人們關(guān)注。輔助生殖技術(shù)(ART)的首要目標是選擇具有高發(fā)育潛力的胚胎，實現(xiàn)單胎健康活產(chǎn)。第三天(D3)新鮮卵裂期胚胎移植是目前許多生殖中心常用的移植策略，通常根據(jù)標準化的評分細則比如卵裂球的數(shù)量、碎片化程度、卵裂球的均勻度等形態(tài)學指標來選擇胚胎進行移植。有報道認為D3卵裂球數(shù)量代表胚胎的卵裂率，被認為是預測胚胎發(fā)育潛力和妊娠結(jié)局的最關(guān)鍵指標[2]，且許多研究表明細胞數(shù)量與胚胎發(fā)育潛力相關(guān)[2-3]。然而，臨床上對于ICSI來源的胚胎其卵裂球數(shù)量與新生兒結(jié)局的相關(guān)性研究報道較少。隨著ICSI應(yīng)用范圍不斷擴大以及單胚胎移植策略的廣泛應(yīng)用，有必要確定一套非侵入性、性價比高且實用的標準來指導ICSI周期單胚胎選擇。因此，本研究擬通過回顧性分析新鮮ICSI移植周期患者的臨床資料，探討新鮮ICSI移植周期D3胚胎卵裂球細胞數(shù)對ART妊娠結(jié)局及新生兒子代的影響，為進一步改善新鮮ICSI移植周期胚胎選擇策略、提高單胚胎移植成功率以及優(yōu)生優(yōu)育提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2018年1月至2020年12月在我院生殖醫(yī)學中心行ICSI治療的2 618個周期的臨床資料。

納入標準：(1)新鮮D3卵裂期單胚胎移植；(2)夫妻雙方染色體核型正常；(3)女方宮腔形態(tài)正常，無不良孕產(chǎn)史及反復流產(chǎn)病史。

排除標準：(1)染色體異?；颊?；(2)子宮畸形及其他內(nèi)分泌代謝性疾病；(3)數(shù)據(jù)缺失周期。

根據(jù)D3移植胚胎的卵裂球數(shù)目共分為6組：≤6細胞組(78例)、7細胞組(199例)、8細胞組(1 936例)、9細胞組(178例)、10細胞組(163例)和≥11細胞組(64例)。該研究的實施通過本院醫(yī)學倫理委員會批準，患者夫妻雙方了解并知情同意。

二、研究方法

1.促排卵方案及取卵：患者均采用本中心常規(guī)的GnRH-a長方案、拮抗劑方案或超長方案促排卵，根據(jù)卵巢反應(yīng)性調(diào)整促排藥物劑量，依據(jù)卵巢激素水平和陰道B超監(jiān)測卵泡發(fā)育。若B超監(jiān)測發(fā)現(xiàn)有3個以上主導卵泡直徑達到≥18 mm時，當晚給予肌肉注射重組人絨毛膜促性腺激素(艾澤，默克雪蘭諾，瑞士)250 μg或人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠)8 000～10 000 U誘發(fā)排卵，HCG注射36～37 h后經(jīng)陰道超聲引導下穿刺取卵。

2.胚胎培養(yǎng)、評估及移植：ICSI授精后16～18 h觀察卵母細胞受精情況，受精后第2天(D2)、第3天(D3)觀察胚胎卵裂情況，記錄胚胎卵裂球細胞數(shù)、碎片化程度、細胞大小均一度。移植胚胎的選擇主要根據(jù)D3胚胎形態(tài)，兼顧考慮原核期和D2胚胎形態(tài)。挑選1枚D3卵裂期胚胎進行移植，其余胚胎進行冷凍或繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚期冷凍。原則上優(yōu)先選擇D3優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎進行移植，若無優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎則在患者知情同意后選擇非優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植。

3.觀察指標：臨床妊娠定義為胚胎移植后4周經(jīng)陰道超聲檢查見孕囊者，臨床妊娠率=該組臨床妊娠周期數(shù)/該組總周期數(shù)×100%。若患者出現(xiàn)臨床妊娠，但在后續(xù)發(fā)育過程中出現(xiàn)胚胎停育或因發(fā)現(xiàn)胎兒畸形而人為終止妊娠者，該周期妊娠結(jié)局定義為流產(chǎn)，流產(chǎn)率=該組流產(chǎn)周期數(shù)/該組妊娠周期數(shù)×100%。胎兒娩出并具有生命體征的周期，結(jié)局定義為活產(chǎn)，活產(chǎn)率=該組活產(chǎn)周期數(shù)/該組總周期數(shù)×100%。在活產(chǎn)周期中，妊娠滿20周但在37周前分娩的新生兒為早產(chǎn)兒；出生體重<2 500 g的新生兒為低出生體重兒；出生體重>4 000 g的新生兒為巨大兒。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 28.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，使用 Kolmogorov-Smirnov 檢驗評估數(shù)據(jù)分布，發(fā)現(xiàn)各研究指標均不滿足正態(tài)分布和方差齊性，計量資料以中位數(shù)(最小值～最大值)[M(min，max)]表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。計數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用R×C列聯(lián)表χ2檢驗和Fisher確切概率法。P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。在將每組與8細胞組進行比較時，依據(jù)用于多重比較的Bonferroni校正，校正后P<0.01被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、患者一般資料比較

各組間患者移植時年齡、基礎(chǔ)促卵泡生成素(bFSH)、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、原發(fā)不孕比例、不孕年限及子宮內(nèi)膜厚度等指標均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組患者的基線資料比較[M(min，max)，n(%)]

二、各組患者的妊娠結(jié)局比較

在新鮮ICSI移植周期中，8細胞組臨床妊娠率、活產(chǎn)率顯著高于≤6細胞組、7細胞組和9細胞組(P<0.01)；10細胞組和≥11細胞組臨床妊娠率和活產(chǎn)率略低于8細胞組，差異尚無統(tǒng)計學意義(P>0.01)(表2)?！?細胞組中5細胞移植周期活產(chǎn)1例，6細胞移植周期活產(chǎn)8例。

表2 各組間妊娠結(jié)局比較(%)

三、新生兒結(jié)局比較

各組間活產(chǎn)嬰兒的孕周、男嬰占比、出生體重、早產(chǎn)兒、巨大兒等指標差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.01)，但7細胞組低出生體重兒占比顯著高于8細胞組(P<0.01)(表3)。各組均無出生缺陷兒出生，有7個妊娠周期在產(chǎn)檢過程中發(fā)現(xiàn)胎兒發(fā)育異常，包括1例骨畸形(移植8細胞)，3例心臟發(fā)育畸形(2例8細胞、1例10細胞)，1例宮內(nèi)發(fā)育遲緩(8細胞)，2例胎兒染色體異常(1例8細胞、1例7細胞)，均及時行引產(chǎn)手術(shù)。

表3 各組間新生兒結(jié)局的比較[M(min，max)，n(%)]

討 論

1992年卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)的問世解決了男性不育的難題，ICSI憑借其高受精率和可以降低完全受精失敗風險的優(yōu)點，應(yīng)用范圍不斷擴大。與此同時，人們卻不得不關(guān)注其所帶來的醫(yī)源性子代安全性問題。隨著臨床個體化控制性卵巢刺激方案的改進和胚胎培養(yǎng)體系的精準提高，新鮮周期胚胎移植策略不僅可以獲得較高的臨床妊娠率，還可以避免胚胎冷凍復蘇損傷的風險，因此受到越來越多患者的親睞[4-5]。鑒于ICSI廣泛應(yīng)用以及D3新鮮卵裂期胚胎移植是當今許多輔助生殖中心的常規(guī)做法，本研究將重點關(guān)注ICSI來源胚胎卵裂球數(shù)量對新鮮單胚胎移植周期妊娠結(jié)局及新生兒結(jié)局的影響，以期為臨床提供更好的單胚胎選擇策略，提高臨床妊娠率，實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。

目前，胚胎形態(tài)學評估依然是各大生殖中心最主要和最常用的評估方法。如何提高這種方法的有效性也是臨床和實驗室工作的重點。評價胚胎質(zhì)量的形態(tài)學標準通常由卵裂球數(shù)目、細胞均一性和碎片化程度決定。卵裂球數(shù)目被認為是預測囊胚形成、胚胎植入率和活產(chǎn)率最關(guān)鍵的指標之一。目前，普遍認為第3天(D3)8細胞胚胎具有最好的發(fā)育潛能，而細胞數(shù)較少的胚胎預后較差[2-3，6]。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，4～5和6細胞組的胚胎著床率和臨床妊娠率明顯低于7～9和>9細胞組，而流產(chǎn)率則明顯增高；6細胞組D3胚胎著床率和臨床妊娠率明顯下降，不屬于優(yōu)質(zhì)胚胎。本研究也發(fā)現(xiàn)≤6細胞組D3胚胎臨床妊娠率低，流產(chǎn)率增加，可能與卵裂球數(shù)目低的D3胚胎發(fā)生非整倍體風險高有關(guān)。目前一致認為慢分裂胚胎發(fā)育潛能低，而對于快分裂胚胎的發(fā)育能力仍存有爭議。有研究報道，活產(chǎn)率與細胞數(shù)增加至8細胞呈正相關(guān)，而細胞數(shù)超過8細胞則活產(chǎn)率降低[8]。有研究在研究胚胎發(fā)育和倍性的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，快速分裂的胚胎染色體畸變率更高[9]。Kroener等[10]建議優(yōu)先移植6～9細胞的胚胎，而不是>9細胞胚胎。然而，Pons等[11]研究結(jié)果提示9～11細胞胚胎的整倍體率低于8細胞胚胎，而11細胞以上的胚胎獲得整倍體囊胚的概率與8細胞相同，當分裂胚胎的整倍體囊胚被移植時，可表現(xiàn)出與8細胞胚胎的整倍體囊胚相似的植入率和活產(chǎn)率。本研究結(jié)果也提示優(yōu)先推薦8細胞胚胎進行移植，其次為≥11細胞胚胎和10細胞胚胎；9細胞胚胎和7細胞胚胎具有相似的臨床結(jié)局，但7細胞組胚胎低出生體重兒風險增加；≤6細胞胚胎臨床結(jié)局最差，但依然有健康活產(chǎn)的機會。

利用延時成像技術(shù)對胚胎發(fā)育進行非侵入性觀察是近期提出的一種更好的胚胎活力評估方法，它可以記錄和注釋胚胎發(fā)育的信息，通過特定參數(shù)對胚胎發(fā)育潛能和妊娠結(jié)局進行預測。有研究認為從一個到三個卵裂球的直接卵裂、四細胞階段的多核化以及兩細胞階段的卵裂球大小均會影響胚胎活力和植入潛能[2]。胚胎活力還與受精時開始的一系列嚴格調(diào)控的細胞事件相關(guān)[12]。盡管該技術(shù)在當代 ART 應(yīng)用中占據(jù)了重要地位，但技術(shù)改進以及開發(fā)用于選擇最可行胚胎的有效算法目前還不夠理想。延時成像技術(shù)的臨床有效性和安全性一直存有爭議[13]。當前延時成像系統(tǒng)的主要缺點之一是胚胎培養(yǎng)組件不允許胚胎旋轉(zhuǎn)，尤其是當卵裂球重疊或存在大量的細胞質(zhì)碎片時，目視觀察變得有所“失真”[14]，甚至這種胚胎“美顏”的效果圖并不能真實反映胚胎的植入潛能，從而為胚胎選擇帶來一定誤導。其次，胚胎每5～15 min暴露于內(nèi)置攝像系統(tǒng)的光照下，如果計算整個培養(yǎng)過程中每個胚胎拍攝圖像總數(shù)，光照周期會大大增加，其安全性問題則值得擔憂[15]。此外，成本/效益比也是一個非常重要的因素，延時培養(yǎng)系統(tǒng)不僅價格昂貴，而且還需要專業(yè)人士定期進行維護，這對于生殖周期有限的中心來說實用價值有限。因此，在現(xiàn)有形態(tài)學評估標準基礎(chǔ)上，確定一套實用、廉價、非侵入性的標準來提高胚胎選擇效率就具有十分重要的意義。本研究也存在一定的局限性。本研究是一項針對新鮮胚胎移植周期的單中心回顧性研究，無法排除新鮮周期高雌激素環(huán)境對胚胎植入的可能影響。有關(guān)D3胚胎卵裂球數(shù)目與胚胎倍性的相關(guān)性，有待后續(xù)研究中進一步驗證，以完善此評估方法，證實其臨床有效性。

綜上所述，當同時存在多個可供移植的胚胎時，推薦優(yōu)先移植8細胞胚胎。此外，10個以上細胞的胚胎也表現(xiàn)出較好的臨床結(jié)局。本研究結(jié)果表明，D3胚胎的卵裂球數(shù)量可作為移植前胚胎評估與篩選的標準之一，有助于在臨床實踐中提高新鮮周期單胚胎移植的成功率。