孫永紅,別俊,何群育,郭奇遇

(南充市中心醫(yī)院,四川 南充 637000 1 腫瘤科； 2 口腔科)

食管癌侵襲性強(qiáng)，男性的估計(jì)發(fā)病率是女性的3倍，總體5年生存率僅為20%左右[1]。因此，仍需要探索有效篩查、診斷和治療食管癌的新方法。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種單鏈不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，其長(zhǎng)度在200～100 000 nt之間[2]，如ELFN1-AS1、FAM83A-AS1等均可促進(jìn)食管癌的進(jìn)展[3-4]。轉(zhuǎn)錄因子7樣蛋白2(TCF7L2)是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，并可以調(diào)控β連環(huán)蛋白1(CTNNB1)的轉(zhuǎn)錄[5]，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TCF7L2-SATB1通路與食管癌病人不良預(yù)后有關(guān)[6-7]。環(huán)氧化酶-2(COX-2)是一種蛋白酶，研究表明約有82%的食管癌組織表達(dá)COX-2，并且參與食管癌的起源和發(fā)展[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)的一種新型的LncRNA TMEM9B-AS1，主要在結(jié)腸和腎臟表達(dá)[9]。但是，其對(duì)食管癌的影響和作用機(jī)制尚不清楚，目前仍無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究旨在探討TMEM9B-AS1在體外對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲和增殖能力的影響，以及介導(dǎo)TCF7L2-SATB1途徑對(duì)食管癌細(xì)胞COX-2和CTNNB1蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人食管癌細(xì)胞KYSE510(ATCC?CRL-9609)以及96孔和24孔組織培養(yǎng)板(康寧公司，美國(guó))，DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司，美國(guó))。TMEM9B-AS1過表達(dá)、沉默質(zhì)粒以及相應(yīng)的陰性對(duì)照(NC)(吉瑪公司，中國(guó))，Lipofectamine?2000(Invitrogen公司，美國(guó))。Trizol試劑(Aidlab公司，中國(guó))，RNAspin Mini試劑盒(GE Healthcare，美國(guó))，BestarTMqPCR試劑盒(DBI Bioscience公司，德國(guó))，PCR儀(ABI7900，ABI公司，美國(guó))。一抗以及山羊抗免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶1 000稀釋，#ab6721，美國(guó)Abcam公司)，PVDF膜(Bio-Rad公司，美國(guó))，ECL 顯色試劑盒(Thermo Fisher公司，美國(guó))，Matrigel膠和Transwell裝置(Corning公司，美國(guó))。光學(xué)顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 將KYSE510細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)液中，內(nèi)含有體積分?jǐn)?shù)0.10牛血清、0.1 g/L鏈霉素和100 kU/ L青霉素。細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃和95%濕度下培養(yǎng)。將KYSE510分為對(duì)照組(A組)、TMEM9B-AS1組(B組)和siTMEM9B-AS1組(C組)，分別轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒、TMEM9B-AS1質(zhì)粒以及siTMEM9B-AS1質(zhì)粒。按試劑盒說明書利用Lipofectamine?2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件為7 ℃和體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究，分別進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)、細(xì)胞計(jì)數(shù)(CCK-8)檢測(cè)、轉(zhuǎn)移小室(Transwell)實(shí)驗(yàn)及蛋白質(zhì)印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2RT-qPCR檢測(cè)TMEM9B-AS1、TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1的mRNA表達(dá) 使用RNeasy Mini試劑盒提取細(xì)胞總RNA，然后將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用BestarTMqPCR預(yù)混液進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，條件如下：95 ℃、2 min， 94 ℃、20 s，58 ℃、 20 s，72 ℃、20 s，40個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx 3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，計(jì)算TMEM9B-AS1、TCF7L2、SATB1、COX-2以及CTNNB1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 將100 μL的細(xì)胞懸浮液添加到96孔板中，孵育48 h和72 h后，將體積為10 μL的CCK-8溶液添加到每個(gè)孔中并孵育2 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處每個(gè)孔的光密度(OD)值。

1.2.4Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將基質(zhì)膠Matrigel(1∶8稀釋)加入24 孔板-Transwell 裝置的上室，并在 37 ℃ 下孵育 30 min。 將 600 μL 完全培養(yǎng)液填充到裝置的下室。將細(xì)胞(密度為5×107/L)在無(wú)血清培養(yǎng)液中于37 ℃培養(yǎng) 24 h進(jìn)行饑餓處理。消化后，向上室中加入 100 μL 細(xì)胞溶液(密度為5×108/L)。培養(yǎng)24 h后，洗去未侵入的細(xì)胞。滲入下室的細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)0.95乙醇固定，1 g/L結(jié)晶紫室溫染色20 min。隨機(jī)取5個(gè)400倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5Western blot檢測(cè)TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1蛋白的表達(dá) 細(xì)胞裂解后通過離心(4 ℃，12 000 r/min，5 min)收集總蛋白。采用SDS-PAGE分離每個(gè)樣品中等量(50 μg)的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下將膜浸入50 g/L脫脂牛奶中2 h，封閉非特異性抗原。隨后，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜，然后將膜與相應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯像，采用Quantum One軟件分析條帶灰度值并計(jì)算TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1蛋白相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組食管癌細(xì)胞TMEM9B-AS1的表達(dá)

對(duì)照組、TMEM9B-AS1組和siTMEM9B-AS1組食管癌細(xì)胞TMEM9B-AS1的表達(dá)水平分別為1.00±0.08、4.27±0.45和0.32±0.03，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.035，P<0.001)。提示轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功。

2.2 TMEM9B-AS1對(duì)食管癌細(xì)胞增殖活力影響

結(jié)果表明，各組食管癌細(xì)胞不同時(shí)間的增殖活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F48 h=7.391，F(xiàn)72 h=19.190，P<0.05)。析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示，不同時(shí)間和不同組別對(duì)食管癌細(xì)胞增殖活力均有影響，且二者存在交互效應(yīng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=4.347，F(xiàn)組別=18.681，F(xiàn)時(shí)間×組別=6.528，P<0.001)。兩兩比較的結(jié)果顯示，TMEM9B-AS1組的細(xì)胞增殖活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而siTMEM9B-AS1組細(xì)胞增殖活力則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 TMEM9B-AS1對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖活力影響

2.3 TMEM9B-AS1對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力影響

對(duì)照組、TMEM9B-AS1組和siTMEM9B-AS1組癌細(xì)胞的浸入數(shù)分別為186.45±8.75、314.79±15.42和96.21±7.38，差異有顯著性(F=30.268，P<0.001)。與對(duì)照組比較，TMEM9B-AS1組細(xì)胞的侵襲能力顯著升高，而siTMEM9B-AS1組則顯著降低(P<0.05)。見圖1。

A：對(duì)照組；B：TMEM9B-AS1組；C：siTMEM9B-AS1組。

2.4 TMEM9B-AS1對(duì)食管癌細(xì)胞TCF7L2以及SATB1表達(dá)影響

對(duì)照組、TMEM9B-AS1組和siTMEM9B-AS1組食管癌細(xì)胞TCF7L2、SATB1的mRNA和蛋白表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FmRNA=42.658、49.318，F(xiàn)蛋白=35.154、37.489，P<0.001)。與對(duì)照組比較，TMEM9B-AS1組細(xì)胞TCF7L2、SATB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，siTMEM9B-AS1組則顯著降低(P<0.05)。見圖2和表2。

A：對(duì)照組，B：TMEM9B-AS1組，C：siTMEM9B-AS1組。

表2 TMEM9B-AS1對(duì)食管癌細(xì)胞TCF7L2-SATB1途徑影響

2.5 TMEM9B-AS1對(duì)食管癌細(xì)胞CTNNB1和COX-2表達(dá)影響

對(duì)照組、TMEM9B-AS1組和siTMEM9B-AS1組食管癌細(xì)胞CTNNB1、COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FmRNA=54.309、56.084，F(xiàn)蛋白=36.448、42.738，P<0.001)。與對(duì)照組比較，TMEM9B-AS1組細(xì)胞CTNNB1、COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而siTMEM9B-AS1組則顯著降低(P<0.05)。見圖3和表3。

A：對(duì)照組，B：TMEM9B-AS1組，C：siTMEM9B-AS1組。

表3 TMEM9B-AS1對(duì)食管癌細(xì)胞中CTNNB1、COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)影響

3 討 論

食管癌發(fā)病率逐年升高，但是目前尚無(wú)治療食管癌的有效手段[10-11]。由于食管癌細(xì)胞早期可侵入黏膜下層或者轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官，許多病人在術(shù)后短時(shí)間內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)腫瘤局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12-13]。由于食管癌病人術(shù)后生存率低、預(yù)期生存期短、預(yù)后差[14]，因此，探究食管癌發(fā)病機(jī)制具有重大意義。

LncRNA是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。LncRNA具有許多生物學(xué)功能，首先，作為轉(zhuǎn)錄因子的組成部分，可以通過調(diào)控原癌基因和抑癌基因的轉(zhuǎn)錄參與食管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[15-17]。在轉(zhuǎn)錄后水平上，LncRNA可以通過調(diào)節(jié)mRNA的剪切水平調(diào)控基因的表達(dá)，如LncRNA DGCR5通過SRSF1介導(dǎo)的Mcl-1選擇性剪接參與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生[18]。此外，LncRNA也可通過競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA形式調(diào)控微小RNA，最終調(diào)控mRNA表達(dá)，如LINC00460通過靶向miR-1224-5p促進(jìn)食管癌轉(zhuǎn)移潛能和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]。本研究主要分析新LncRNA TMEM9B-AS1在食管癌發(fā)生和發(fā)展中的作用。編碼LncRNA TMEM9B-AS1的基因位于11號(hào)染色體(NC_000011.10)，轉(zhuǎn)錄本為389個(gè)堿基，表達(dá)于多種組織和器官，以結(jié)腸和腎臟為主。本研究利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式分別構(gòu)建了TMEM9B-AS1沉默和過表達(dá)的細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，在TMEM9B-AS1的水平升高后，食管癌細(xì)胞增殖和侵襲能力顯著升高；而TMEM9B-AS1的水平降低后，細(xì)胞食管癌增殖和侵襲能力顯著降低。本文體外水平研究顯示TMEM9B-AS1具有促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖和遷移的作用，說明其可能參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展。

為進(jìn)一步分析TMEM9B-AS1在食管癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了TCF7L2-CTNNB1途徑以及COX-2和SATB1蛋白的表達(dá)。TCF7L2蛋白參與Wnt信號(hào)通路，并通過序列特異性方式與其啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)下游MYC基因的表達(dá)，其可調(diào)控CTNNB1的轉(zhuǎn)錄激活[5,20-21]。BAHRAMIAN等[22]收集腫瘤組織和鄰近組織研究發(fā)現(xiàn)，TCF7L2在食管癌和胃癌中顯著表達(dá)，可能在功能上參與癌癥細(xì)胞的增殖、凋亡和血管生成通路。TCF7L2在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中通過ERK1/2依賴性途徑調(diào)控促癌基因轉(zhuǎn)錄，參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展[23-24]。以上研究表明TCF7L2過表達(dá)可能對(duì)食管癌的發(fā)生具有促進(jìn)作用。而CTNNB1基因是編碼β-catenin蛋白的基因，其是促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，抑制該通路也是治療食管癌的重要思路[25-27]。在哺乳動(dòng)物中，TCF7L2可以和β-catenin通過DNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，共同控制和調(diào)控Wnt信號(hào)通路。此外，SATB1是一種核基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合蛋白，參與調(diào)控染色質(zhì)的合成，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，SATB1直接與β-catenin相互作用，并通過與其啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)Wnt靶標(biāo)的表達(dá)[28-30]。并通過調(diào)控全局染色質(zhì)調(diào)節(jié)眾多基因的表達(dá)，研究已經(jīng)顯示SATB1通過上調(diào)FN1和PDGFRB在食管癌中發(fā)揮原癌基因的作用[31]。同時(shí)，COX-2蛋白對(duì)食管癌也具有促進(jìn)作用，研究顯示miR-128的甲基化沉默通過提高COX-2的表達(dá)促進(jìn)食管癌的發(fā)展[32]。以上4種分子TCF7L2-SATB1途徑，COX-2和CTNNB1均對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、遷移以及發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，在食管癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)TMEM9B-AS1，可以明顯促進(jìn)食管癌細(xì)胞中TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1的mRNA和蛋白表達(dá)，而抑制TMEM9B-AS1在食管癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)則可以促進(jìn)上述指標(biāo)的mRNA和蛋白表達(dá)水平。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在各種類型的癌癥中通過調(diào)節(jié)COX-2基因的表達(dá)來(lái)影響疾病的發(fā)展[33]。因此，COX-2是Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游的分子。

本文研究結(jié)果表明，TMEM9B-AS1很可能是通過TCF7L2-SATB1途徑來(lái)抑制或者促進(jìn)下游分子COX2的表達(dá)以及減少CTNNB1與TCF7L2的結(jié)合，從而影響食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展。CARROSSINI等[34]研究結(jié)果顯示，COX-2表達(dá)和食管癌病人異位脂肪量呈顯著正相關(guān)，并在腺癌中檢測(cè)到共定位，但在食管鱗狀細(xì)胞癌中未檢測(cè)到。CONG等[35]在食管鱗狀細(xì)胞癌中檢測(cè)到48.3%的SATB1表達(dá)量，而正常組織只有7.8%，但分析結(jié)果顯示SATB1表達(dá)與臨床病理學(xué)特征沒有顯著相關(guān)性。但SATB1高表達(dá)病人的生存期明顯短于SATB1低表達(dá)者，因此，高SATB1表達(dá)是食管鱗狀細(xì)胞癌病人的獨(dú)立預(yù)后因素，并且可作為其靶向治療的潛在分子。后續(xù)臨床研究應(yīng)關(guān)注到COX-2和SATB1表達(dá)在兩種類型癌癥中的差別。

綜上所述，上調(diào)TMEM9B-AS1表達(dá)可以通過TCF7L2-SATB1途徑，提高COX-2和CTNNB1的表達(dá)，并增強(qiáng)食管癌細(xì)胞增殖和侵襲的能力。但目前研究?jī)H僅在體外細(xì)胞水平驗(yàn)證了TMEM9B-AS1在食管癌中的作用，仍缺乏組織水平和動(dòng)物模型的體內(nèi)驗(yàn)證，尤其是在轉(zhuǎn)基因工具鼠中的驗(yàn)證效果更有說服力。其次，食管癌呈現(xiàn)出兩種主要的組織學(xué)亞型(腺癌和鱗狀細(xì)胞癌)，兩種亞型在病理學(xué)和分子機(jī)制方面均存在很大差異，因此應(yīng)研究分子以及信號(hào)通路在不同類型食管癌中的表達(dá)差異。再者關(guān)于4種分子TCF7L2、SATB1、COX-2和CTNNB1在食管癌細(xì)胞里互相作用機(jī)制仍未探究，因此未來(lái)研究應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注和解決TMEM9B-AS1在食管癌機(jī)制和治療中的臨床意義，其促癌的作用仍需要進(jìn)行體內(nèi)研究，調(diào)控TCF7L2-SATB1途徑的分子機(jī)制也需要進(jìn)一步研究和探索。