陳 娟，馮俊明，李明松，雷 雪，黃 鄂

(重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院病理科 402760)

端粒酶是一種具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的核糖核蛋白，由人端粒酶RNA組分(human telomeric RNA component，hTERC)、人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomeric reverse transcriptase，hTERT)及端粒酶相關(guān)蛋白 (telomeraseassociated protein，TP)3部分亞基構(gòu)成[1-2]。該三組分可調(diào)節(jié)端粒酶活性，其中任一組分發(fā)生改變便會(huì)影響端粒酶活性[2-3]。研究證明，在正常人體組織中端粒酶活性受到抑制，在惡性腫瘤中卻被激活。而端粒酶的活化直接影響細(xì)胞的分裂、增殖，端粒酶活性的增強(qiáng)可使細(xì)胞獲得無限增殖能力，最終導(dǎo)致細(xì)胞的病變，乃至癌變[3-4]?，F(xiàn)已有文獻(xiàn)報(bào)道，端粒酶活性的增強(qiáng)會(huì)加快肺癌[5-6]、腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[7-9]及胰腺癌[10]的發(fā)展，并提示一個(gè)不理想的預(yù)后。

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，現(xiàn)已有文獻(xiàn)報(bào)道宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與hTERC及hTERT的激活呈正相關(guān)，宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變級別越高，其活性越強(qiáng)[11-12]。而端粒酶相關(guān)蛋白(TP1)在宮頸鱗狀上皮病變的作用尚少見相關(guān)研究。本研究旨在探索TP1在不同級別宮頸鱗狀上皮病變中(慢性宮頸炎、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變及高級別鱗狀上皮內(nèi)病變)的表達(dá)情況及其與端粒酶活性的關(guān)系，探討其在宮頸鱗狀上皮病變中的可能作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用回顧性研究的方法，收集2019年1-12月在本院行宮頸活檢的100例女性患者為研究對象，年齡22～77歲，平均(43.26±10.09)歲。以組織病理檢查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)將其分為3組：慢性宮頸炎組29例、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組34例、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組37例，對3組患者的組織活檢標(biāo)本進(jìn)行TP1免疫組織化學(xué)染色及端粒酶活性檢測。納入標(biāo)準(zhǔn)：在本院已行宮頸組織活檢，且活檢組織標(biāo)本最大徑≥2 mm；排除標(biāo)準(zhǔn)：宮頸活檢組織標(biāo)本最大徑<2 mm或富含大量黏液的活檢標(biāo)本。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核并通過(2019-KY-07)。

1.2 方法

1.2.1TP1免疫組織化學(xué)染色

TP1免疫組織化學(xué)試劑一抗購自美國Santa Cruz公司，濃度為1.0 mg/μL，無核水稀釋到10 ng/μL，采用SP免疫組織化學(xué)染色法，通用型二抗購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。操作步驟嚴(yán)格按說明書執(zhí)行。結(jié)果判讀：TP1陽性表達(dá)于核漿，棕色顆粒狀。無陽性細(xì)胞判為-，陽性細(xì)胞數(shù)≤25%判為+，陽性細(xì)胞數(shù)>25%～50%判為++，陽性細(xì)胞數(shù)>50%陽性為+++。細(xì)胞陽性率=20個(gè)高倍鏡下(400倍)陽性細(xì)胞數(shù)/20個(gè)高倍鏡下細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.2端粒酶活性檢測

端粒重復(fù)序列擴(kuò)增-ELISA(TRAP-PCR-ELISA)檢測3組標(biāo)本中端粒酶活性，試劑盒購自美國Bochringer mannheim公司，按說明書操作。測定波長450 nm(A450)和630 nm(A630)處吸光度值，吸光度差值(△A)=A450-A630,△A值代表細(xì)胞端粒酶活性。陽性對照由試劑盒提供，陰性對照為端粒酶提取物加1 mg/L RNaseA，37 ℃孵育20 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TP1在宮頸鱗狀上皮病變中的陽性率比較

不同組別宮頸鱗狀上皮病變的TP1陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.328，P<0.001)；兩兩比較顯示，低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組及高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組TP1陽性率均高于慢性宮頸炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.343,P校正=0.002；χ2=34.545，P校正<0.001)；低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組與高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組TP1陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.870，P校正=0.085),見表1。

表1 TP1在宮頸鱗狀上皮病變不同組別中的表達(dá)情況

2.2 TP1與宮頸鱗狀上皮病變級別的相關(guān)性

慢性宮頸炎組TP1-，低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組TP1+，高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組TP1++～+++。TP1的表達(dá)與宮頸鱗狀上皮病變級別呈正相關(guān)(Kendall′s tau-b=0.773，P<0.001)，隨著宮頸鱗狀上皮病變級別的增高，TP1表達(dá)增強(qiáng)，見圖1。

A：慢性宮頸炎組(-)；B：低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組(+)；C：高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組(++～+++)。

2.3 端粒酶活性檢測結(jié)果

端粒酶活性在陽性對照為1.37±0.04，陰性對照為0.06±0.01，在慢性宮頸炎組(0.36±0.04)、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組(1.02±0.07)及高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組(1.75±0.05)逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.863，P<0.05)。

2.4 TP1的表達(dá)強(qiáng)度與端粒酶活性的相關(guān)性

TP1表達(dá)-、+、++、+++對應(yīng)的端粒酶活性分別為0.12±0.03、0.90±0.03、1.36±0.04、1.79±0.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=10.992，P=0.028)，TP1表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)對應(yīng)的端粒酶活性逐漸增強(qiáng)。

3 討 論

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤，發(fā)病主要與高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染有關(guān)，目前通過宮頸癌篩查基本可以做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。雖然現(xiàn)在臨床上已有宮頸癌疫苗，但仍有少部分HPV高危型感染患者病情發(fā)展迅速，或發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)到了宮頸癌晚期，其原因目前尚不清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道，端粒酶hTERC及hTERT兩組分被激活，使端粒酶活性增加，從而進(jìn)一步增強(qiáng)高危型HPV在宮頸病變中的致瘤作用[13]，其可能機(jī)制為端粒酶活性增加，參與調(diào)節(jié)酪氨酸蛋白酶信號傳遞，激活HPVE6/E7癌基因，有助于在潛伏期將HPVE6/E7癌基因整合到宿主端粒中，并能有效抑制抑癌基因P53及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)腫瘤抑制蛋白的活性，細(xì)胞周期失去調(diào)控從而抑制細(xì)胞凋亡，使高危型HPV病毒能在宿主中持續(xù)存活，從而導(dǎo)致宮頸鱗狀上皮病變[14]，進(jìn)一步加快癌變過程。

端粒酶協(xié)同蛋白TP1作為端粒酶三組分之一，在腫瘤細(xì)胞形成過程中的作用尚缺乏文獻(xiàn)報(bào)道。趙瑞皎等[15]發(fā)現(xiàn)，TP1在卵巢惡性漿液性上皮性腫瘤中的表達(dá)強(qiáng)于良性漿液性上皮性腫瘤，而與端粒酶活性無相關(guān)性，提示TP1可能通過某未知的途徑促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。而在KATZENELLENBOGEN[16]的研究中發(fā)現(xiàn)，HPVE6可以通過多重機(jī)制使端粒酶活性增加，如通過抑制Maz及鋅指轉(zhuǎn)錄因子Sp1的活性，從而使TP1表達(dá)上調(diào)，加快了宮頸鱗狀上皮病變的進(jìn)一步發(fā)展。在本研究中，低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組及高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組TP1陽性率均明顯高于慢性宮頸炎組，而低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組及高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組TP1陽性率無明顯差異，同樣提示TP1可能通過某種途徑參與了HPV的感染途徑，而主要可能在HPV持續(xù)感染、DNA整合過程起著重要的作用[14]。TP1的表達(dá)與宮頸鱗狀上皮病變級別呈正相關(guān)，隨著宮頸鱗狀上皮病變級別的增高而表達(dá)增強(qiáng)，提示TP1在宮頸鱗狀上皮癌變過程中起著促進(jìn)作用。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，端粒酶活性信號在慢性宮頸炎組、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變組及高級別鱗狀上皮內(nèi)病變組是逐漸增強(qiáng)的，并且TP1的表達(dá)與端粒酶活性呈正相關(guān)，提示TP1高表達(dá)可能增強(qiáng)了端粒酶的活性，從而促進(jìn)或加快了宮頸鱗狀上皮病變進(jìn)一步發(fā)展，異型增生，乃至癌變。

綜上所述，TP1隨著宮頸鱗狀上皮病變級別的增高而表達(dá)上調(diào)，且與端粒酶活性存在正相關(guān)性，提示TP1高表達(dá)可能增強(qiáng)了端粒酶的活性，從而促進(jìn)宮頸鱗狀上皮病變進(jìn)一步發(fā)展，甚至永生化、癌變，但TP1可否作為宮頸鱗狀上皮病變判斷級別及預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)還需進(jìn)一步探索和實(shí)驗(yàn)證明。