代酉麗 綜述，蔣孝添，李叢華 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院門診部 401331)

創(chuàng)傷、壞死、腫瘤、先天畸形等各種原因都可能導(dǎo)致大面積骨缺損和骨愈合失敗，這些在人或動(dòng)物的一生中不能完全愈合的缺陷稱為臨界骨缺損[1]。臨界骨缺損通常需要手術(shù)用自體骨移植或骨移植替代物重建。其中自體骨移植常需要額外手術(shù)，且供體有限；骨替代材料存在塑形性和成骨能力不足等缺點(diǎn)[2]。而且，由于祖細(xì)胞數(shù)量不足，缺乏向缺損部位的遷移，無(wú)法分化為成骨細(xì)胞，在臨界骨缺損的愈合過(guò)程中仍存在難題[3]。因此，骨組織工程受到了廣泛關(guān)注，其可通過(guò)添加多種生長(zhǎng)因子的具有骨誘導(dǎo)性的支架，將干細(xì)胞運(yùn)送至缺損部位以促進(jìn)骨再生。

生長(zhǎng)因子的釋放是組織再生研究中具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題，目前濃縮生長(zhǎng)因子(concentrated growth factor，CGF)作為能夠控制其釋放的儲(chǔ)蓄庫(kù)，正受到許多研究者的關(guān)注。CGF作為第3代血小板濃縮物，柔軟疏松的纖維蛋白支架內(nèi)包埋了大量的血小板、白細(xì)胞和紅細(xì)胞，含有大量生長(zhǎng)因子，很多學(xué)者研究表明CGF可以單獨(dú)或和其他骨移植材料聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)干細(xì)胞增殖及成骨分化。在骨組織工程中，牙源性干細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)等常被用于研究。其中，牙源性干細(xì)胞是具有自我更新能力和多向分化潛力的間充質(zhì)干細(xì)胞群體。從較早發(fā)育階段的組織(如牙胚、牙囊、初生脫落的乳牙)或成人牙齒組織(如成人牙髓、根尖乳頭、牙周韌帶和牙齦)中分離出神經(jīng)嵴來(lái)源的干細(xì)胞，其可分化形成顱面軟骨和骨，用于自體移植重建人顱面骨[4]。

1 CGF的發(fā)展

1974年，含有多種自體生長(zhǎng)因子和纖維蛋白支架的血小板濃縮物被發(fā)現(xiàn)[5]。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)作為第1代濃縮血小板已被用于各種醫(yī)療領(lǐng)域，但是近年來(lái)其使用受到限制，主要是由于添加凝血酶和氯化鈣增強(qiáng)纖維聚合作用已被證明會(huì)引起交叉感染、免疫排斥等不良反應(yīng)[6]。為了克服這些問(wèn)題，在不添加抗凝劑的情況下離心并分離出富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)[7]。與PRP不同，PRF的纖維蛋白基質(zhì)充當(dāng)3D支架，允許生長(zhǎng)因子緩慢釋放，同時(shí)為細(xì)胞黏附、遷移和分化提供空間[8]。2006年，有學(xué)者通過(guò)改變離心速度從PRF中分離出CGF，其可誘導(dǎo)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，從而形成具有高抗張強(qiáng)度的基質(zhì)，促進(jìn)血小板破裂和生長(zhǎng)因子釋放[9-10]。目前認(rèn)為CGF在成分和臨床適用性方面優(yōu)于PRP和PRF。

2 CGF的主要成分及作用

CGF主要由多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞、血小板及纖維網(wǎng)狀支架組成。在CGF的制備中，血液樣品通過(guò)固定程序進(jìn)行差速離心處理分離出CGF凝膠層，由上層貧血小板層、中層血漿和下層紅細(xì)胞層3層組成，CGF也具有3個(gè)部分，即最上面部分呈白色，最下面部分呈紅色，中間部分為血沉層，呈棕黃色[11]。電子顯微鏡掃描顯示，CGF上部為3D網(wǎng)絡(luò)，主要由纖維蛋白和一些類似天然纖維蛋白的小直徑纖維蛋白分子組成，有利于細(xì)胞黏附；下部含有大量的細(xì)胞成分，包括血小板、白細(xì)胞和紅細(xì)胞[12]，值得注意的是，其中還存在大量參與血管生成的分化細(xì)胞簇——CD34陽(yáng)性細(xì)胞[13]。通過(guò)纖溶激活包裹在CGF的纖維蛋白支架中的血小板可促進(jìn)生長(zhǎng)因子的持續(xù)釋放，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，上述生長(zhǎng)因子已經(jīng)被證實(shí)是組織工程中調(diào)節(jié)干細(xì)胞活性所必需的[9，14]。TGF-β1在大多數(shù)生理環(huán)境中是一種趨化和促有絲分裂因子，可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成[15]。PDGF刺激成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，還參與血管生成和膠原蛋白的生物合成[16]。IGF調(diào)節(jié)多種細(xì)胞類型的增殖、遷移和分化，并誘導(dǎo)周圍神經(jīng)形成[17]。VEGF是血管生成中內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并在新生血管形成過(guò)程中調(diào)節(jié)缺血環(huán)境中的血管通透性[18]。BMPs是一類參與骨形成和發(fā)育的分泌型多功能蛋白[19]。EGF在細(xì)胞分化、遷移和凋亡中發(fā)揮作用，并且在體外和體內(nèi)均可作為有效的有絲分裂原[20]。bFGF是一種具有促有絲分裂和血管生成活性的單鏈蛋白，可促進(jìn)受損內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)和血管生成[21]。

3 CGF對(duì)干細(xì)胞成骨分化的作用

3.1 CGF促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)增殖及成骨分化

YU等[22]報(bào)道，將CGF與比格犬PDLSCs共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，CGF能顯著促進(jìn)PDLSCs增殖，增強(qiáng)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性、礦化結(jié)節(jié)的沉積能力和上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)其成骨分化，而且這種作用隨CGF濃度增加而增強(qiáng)。賈婷婷[23]將PDLSCs接種于CGF膜上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CGF膜也可顯著促進(jìn)PDLSCs增殖和成骨分化。QIAO等[24]初步探討了關(guān)于CGF促進(jìn)hPDLCs成骨分化的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)CGF顯著促進(jìn)人PDLSCs(hPDLCs)的增殖和ALP活性，且與重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子-AB(rhPDGF-AB)和重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(rhTGF-β1)的聯(lián)合作用相比，其作用更強(qiáng)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在早期參與了CGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和分化。而關(guān)于CGF對(duì)炎癥環(huán)境下PDLSCs的作用，LI等[25]研究報(bào)道在腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境下，CGF滲出液明顯增強(qiáng)了hPDLCs的增殖和成骨分化，CGF中所含的TGF-β1通過(guò)上調(diào)Runx2轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)減輕了TNF-α對(duì)hPDLCs成骨分化的抑制作用。而AGHAMOHAMADI等[26]報(bào)道，CGF促進(jìn)PDLSCs增殖無(wú)劑量依賴性，高濃度CGF顯著抑制PDLSCs增殖，并認(rèn)為由TGF-β和蛋白水解酶介導(dǎo)。

3.2 CGF促進(jìn)牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)增殖及成骨分化

牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合物對(duì)于牙齒的長(zhǎng)期完整性和活力至關(guān)重要，但它容易受到外部因素的損傷。隨著干細(xì)胞組織工程的發(fā)展，將牙源性干細(xì)胞與組織修復(fù)微環(huán)境相結(jié)合以促進(jìn)牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合物再生的可能性增加。JIN等[27]發(fā)現(xiàn)，CGF以劑量依賴的方式促進(jìn)DPSCs增殖，高濃度CGF抑制DPSCs的內(nèi)皮分化和成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，且高劑量CGF的負(fù)面作用可能與濃度增加時(shí)TGF-β、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6過(guò)量有關(guān)。JUN等[28]用CGF提取物處理人DPSCs(hDPSCs)，發(fā)現(xiàn)CGF提取物顯著促進(jìn)hDPSCs增殖和遷移，且呈劑量依賴性。XU等[29]的實(shí)驗(yàn)也表明，CGF以劑量依賴的方式促進(jìn)暴露于脂多糖的DPSCs的增殖、遷移和分化，可能是由于CGF處理的DPSCs分泌TNF-α和IL-8促進(jìn)了DPSCs遷移。TIAN等[30]研究發(fā)現(xiàn)，CGF以劑量依賴的方式促進(jìn)DPSCs的增殖和遷移，CGF通過(guò)上調(diào)RUNX2轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)DPSCs成牙或成骨分化，且骨形成蛋白2(BMP-2)/Smad5/Runx2信號(hào)通路與CGF介導(dǎo)的DPSCs礦化有關(guān)。LI等[31]研究了CGF滲出液(CGFe)和TGF-β1的協(xié)同作用，結(jié)果表明CGFe和TGF-β1增強(qiáng)了hDPSCs活力，并通過(guò)激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路促進(jìn)hDPSCs的活力和成骨分化。

3.3 CGF促進(jìn)BMSCs增殖及成骨分化

BMSCs是骨組織工程中常用的一種多能干細(xì)胞，能夠多向分化。HONDA等[32]報(bào)道了CGF促進(jìn)BMSCs的增殖及成骨分化，且這種作用呈劑量依賴性。CHEN等[33]進(jìn)一步證實(shí)CGF聯(lián)合BMSCs修復(fù)骨缺損具有獨(dú)特的天然優(yōu)勢(shì)，研究結(jié)果表明CGF與BMSCs結(jié)合可以形成纖維蛋白支架，這種支架對(duì)成骨有強(qiáng)大的作用，同時(shí)還具有血管生成的輔助作用，而且CGF與BMSCs聯(lián)合具有良好的骨誘導(dǎo)活性，是一種優(yōu)秀的骨再生生物材料。近期，張?jiān)碌萚34]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CGF能有效促進(jìn)BMSCs在礦化膠原材料上的黏附、增殖和成骨分化，其中10% CGF滲出液效果最顯著，而且與礦化膠原材料聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)骨形成。

3.4 CGF促進(jìn)脂肪干細(xì)胞(adipose derived pulp stem cells，ADSCs)增殖及成骨分化

與其他來(lái)源的干細(xì)胞相比，ADSCs具有供應(yīng)豐富、制備簡(jiǎn)單、再生能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，正在成為組織工程中種子細(xì)胞的重要來(lái)源[35-36]。馬翔宇等[37]探討CGF對(duì)ADSCs成骨作用的影響，證實(shí)了比格犬ADSCs在體外礦化環(huán)境誘導(dǎo)下可出現(xiàn)骨向分化，CGF可通過(guò)釋放生長(zhǎng)因子顯著加強(qiáng)ADSCs的增殖及成骨效應(yīng)。近來(lái)HU等[38]探究了不同含量CGF(0、5%、10%、20%)對(duì)ADSCs增殖分化的影響，發(fā)現(xiàn)在體外促進(jìn)ADSCs增殖和分化的最佳含量為20%，將CGF與ADSCs相結(jié)合的復(fù)合物植入骨缺損處在大鼠體內(nèi)顯示出良好的成骨作用，證明CGF/ADSCs復(fù)合物可以促進(jìn)大鼠頜面部骨缺損修復(fù)。

3.5 CGF促進(jìn)牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingiva-derived mesenchymal stem cells，GMSCs)增殖及成骨分化

與BMSCs相比，GMSCs來(lái)源于臨床廢棄物，且易獲得、可自我修復(fù)，具有更高的增殖率。但就臨床骨再生而言，GMSCs的成骨分化能力較差。CHEN等[39]用不同含量CGF培養(yǎng)GMSCs，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示10% CGF對(duì)GMSCs增殖的促進(jìn)作用最為顯著，且CGF通過(guò)調(diào)控牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(DMP1)、牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)、BMP-2和RUNX2的表達(dá)誘導(dǎo)GMSCs成骨分化。QI等[40]采用不同濃度的CGF處理GMSCs，觀察CGF對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響，發(fā)現(xiàn)CGF培養(yǎng)的GMSCs細(xì)胞增殖能力和遷移能力明顯增強(qiáng)。此外，CGF提高了纖維連接蛋白(FN)、Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)、VEGF和血管生成素-1(Ang-1)的表達(dá)水平。CGF的這些作用是由蛋白激酶B(AKT)/Wnt和Yes相關(guān)蛋白(YAP)通路介導(dǎo)，而AKT可能在Wnt/β-catenin和YAP通路的上游發(fā)揮作用。在體內(nèi)模型中也顯示YAP過(guò)表達(dá)。因此，CGF具有促進(jìn)牙齦再生的作用，而YAP轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核可能是其中的關(guān)鍵因素，這為牙齦再生提供了新的視角，進(jìn)一步促進(jìn)了CGF的臨床應(yīng)用。

4 小結(jié)及展望

CGF可通過(guò)專業(yè)的設(shè)備、規(guī)范的程序從自體靜脈血離心而得，來(lái)源豐富、制取方便快捷。相比一些外源性生長(zhǎng)因子，CGF排除了臨床應(yīng)用中可能存在的交叉感染、毒性和免疫原性等風(fēng)險(xiǎn)，具有良好的生物相容性及較高的經(jīng)濟(jì)性。CGF柔軟致密的纖維蛋白支架中包裹多種生長(zhǎng)因子，纖維蛋白支架作為一種臨時(shí)基質(zhì)，有助于延長(zhǎng)生長(zhǎng)因子的釋放時(shí)間。但CGF的生物活性不持久，在生物物理和生物化學(xué)環(huán)境中，生長(zhǎng)因子的釋放動(dòng)力學(xué)將直接影響其生物活性模式。隨著纖維蛋白支架降解，血小板團(tuán)逐漸分解，生長(zhǎng)因子緩慢釋放到局部微環(huán)境中，延長(zhǎng)生長(zhǎng)因子的釋放時(shí)間可能符合再生重建的長(zhǎng)期過(guò)程。CGF通過(guò)與其他生物材料結(jié)合，可以建立一個(gè)連續(xù)的藥物傳遞系統(tǒng)，這可能有助于延長(zhǎng)CGF的生物活性持續(xù)時(shí)間。而且CGF中生長(zhǎng)因子的具體組成及含量至今還在探究中，已知的生長(zhǎng)因子的作用途徑也極其有限?；贑GF的再生治療的關(guān)鍵是通過(guò)引入連續(xù)的藥物傳遞系統(tǒng)來(lái)增加生長(zhǎng)因子的數(shù)量和釋放時(shí)間，因此，探究CGF中生長(zhǎng)因子的組成和含量有利于支持其臨床應(yīng)用。

以上研究探討了CGF對(duì)多種干細(xì)胞增殖及成骨分化的作用，然而仍有一些干細(xì)胞未進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，如牙囊干細(xì)胞、人脫落乳牙干細(xì)胞等，CGF對(duì)這些干細(xì)胞的作用仍待進(jìn)一步探究和驗(yàn)證，以選出最合適的干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)相關(guān)基因轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞也應(yīng)在考慮范圍內(nèi)。目前CGF對(duì)干細(xì)胞的最佳作用濃度仍存在一定爭(zhēng)議。大部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CGF促進(jìn)干細(xì)胞增殖的作用呈現(xiàn)劑量依賴性，但也有部分研究顯示在低濃度下CGF提取物對(duì)細(xì)胞增殖和分化的正向作用呈劑量依賴性，而高濃度CGF對(duì)細(xì)胞增殖和分化有抑制作用。分析原因可能與CGF中血小板計(jì)數(shù)及制備、儲(chǔ)存等有關(guān)，還需要進(jìn)一步探究。此外，近幾年支架材料發(fā)展迅速，不同支架的運(yùn)用可改善干細(xì)胞的附著，延長(zhǎng)生長(zhǎng)因子的釋放時(shí)間并提高活性。因此也需要考慮將CGF、干細(xì)胞與新型支架材料聯(lián)合運(yùn)用，以期發(fā)揮出CGF的最大生物活性優(yōu)勢(shì)。