杜靜冰，崔銀江，孔耀

（新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 口腔科，河南 新鄉(xiāng)453000）

頭頸部是惡性腫瘤常發(fā)部位之一,頭頸部惡性腫瘤的發(fā)病率居于所有惡性腫瘤的第六位,其中口腔鱗狀細(xì)胞癌是其主要類型,全球每年新增口腔鱗狀細(xì)胞癌也在45萬[1]。口腔鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后不良，且在過去50年內(nèi)其臨床治療預(yù)后并未得到明顯的改善。對于口腔鱗狀細(xì)胞癌這種實(shí)體腫瘤而言，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種免疫應(yīng)答逃逸機(jī)制,如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫聚集就是其中最常見的一種[2]。最新研究顯示，程序性死亡分子-L1(PD-1)可表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜表面,其配體如PD-L1可表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞、活化的T細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中，PD-L1可調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫聚集來激活腫瘤細(xì)胞的炎性破壞，因此,阻斷PD-1/PD-L1通路可逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制，從而達(dá)到抗腫瘤治療的目的[3,4]。但PD-L1與口腔鱗狀細(xì)胞癌病情發(fā)展標(biāo)志物的關(guān)系尚未見報(bào)道,鑒于此，本研究以本院近期收集到的口腔鱗狀細(xì)胞癌組織蠟塊為研究標(biāo)本,觀察口腔鱗狀細(xì)胞癌中PD-L1的表達(dá)與乳頭瘤病毒-16(P16)、人乳頭瘤病毒(HPV)感染以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并初步探討PD-L1在口腔鱗狀細(xì)胞癌病情發(fā)展中的作用，為口腔鱗狀細(xì)胞癌免疫療法提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院于2017年6月至2018年6月期間手術(shù)治療的口腔鱗狀細(xì)胞癌51例，所有患者均經(jīng)臨床組織學(xué)病理證實(shí)為口腔鱗狀細(xì)胞癌，且臨床病理資料完整。51例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者：性別比：男27例，女24例；平均年齡53.81±5.74周歲(年齡跨度36～64周歲)；美國癌癥聯(lián)合會(huì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移臨床分期：Ⅰ期17例、Ⅱ期14例、Ⅲ期14例、Ⅳ期6例。

1.2 研究方法 所有患者手術(shù)病灶組織蠟塊標(biāo)本均采用磷酸緩沖液配置的甲醛固定液固定,并采用乙醇梯度脫水,以石蠟包埋,于本院病理中心作4μm連續(xù)切片。采用免疫組化染色法檢測口腔鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本PD-L1、P16及HPV表達(dá)情況，染色過程中兔抗人PD-L1單克隆抗體、兔抗人P16單克隆抗體、兔抗人HPV單克隆抗體均采用PBS溶液1：150稀釋，然后進(jìn)行SP免疫組化染色。采用雙盲法由2名研究人員判定染色結(jié)果,每份染色結(jié)果觀察(×200)。染色結(jié)果判定方法為[8]：首先對染色結(jié)果的強(qiáng)度進(jìn)行評價(jià)，并按顏色深淺度分為無著色(計(jì) 0 分)、淡黃色(計(jì) 1 分)、棕黃色(計(jì) 2 分)、棕褐色(計(jì)3分);然后按照每個(gè)視野陽性細(xì)胞占比進(jìn)行計(jì)分,即占比≦5%計(jì)0分、占比5%～25%計(jì)1分、占比25%～50%計(jì)2分、占比50%～75%計(jì)3分、占比≧75%計(jì)4分;最后將兩種計(jì)分相加,所得分?jǐn)?shù)0～4分為陰性,5～6分為弱陽性，7分為強(qiáng)陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析。陰性率、陽性率等分類資料采用頻率(%)表示，年齡等計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Spearman等級相關(guān)性分析法分析口腔鱗狀細(xì)胞癌中PD-L1的表達(dá)與P16、HPV感染以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系的相關(guān)性,P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意見義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1及P16在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)情況分析 51例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中，PD-L1呈陽性表達(dá)44例 (86.27%)，PD-L1呈陰性表達(dá)7例 (13.72%),其中PD-L1強(qiáng)陽性表達(dá)31例(60.78%),PD-L1弱陽性表達(dá) 11例(21.57%)，見圖1。51例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中，P16呈陽性表達(dá)22例(43.14%)，P16 呈陰性表達(dá) 29 例(56.86%)，其中 P16強(qiáng)陽性表達(dá)9例 (17.65%)，P16弱陽性表達(dá)13例(25.49%)，見圖 2。

圖1 PD-L1在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)(×200)

圖2 P16在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)(×200)

2.2 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1與P16的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析顯示,口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的PD-L1表達(dá)與P16表達(dá)呈負(fù)相關(guān) (rs=-0.819，P=0.000)，即口腔鱗狀細(xì)胞癌組織PD-L1陽性表達(dá)44例中，29例P16表達(dá)呈陰性，而口腔鱗狀細(xì)胞癌組織PD-L1陰性表達(dá)7例中，全部P16表達(dá)呈陽性。見表1。

表1 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1及P16之間的相關(guān)性分析表

2.3 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析顯示:口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的PD-L1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期之間呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.736，P=0.000），即口腔鱗狀細(xì)胞癌組織PD-L1陽性表達(dá)44例中，17例為NO分期0期，14例為NO分期1期，13例為NO分期2期,而口腔鱗狀細(xì)胞癌組織PD-L1陰性表達(dá)7例中，1例為NO分期2期，6例為NO分期3期。見表2。

表2 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期之間的相關(guān)性分析表

2.4 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1與HPV感染的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析顯示：口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的PD-L1表達(dá)與HPV感染呈正相關(guān)(rs=0.653，P=0.000)，即口腔鱗狀細(xì)胞癌組織PD-L1陽性表達(dá)44例中，39例為HPV表達(dá)陽性，5例為HPV表達(dá)陰性，而口腔鱗狀細(xì)胞癌組織PD-L1陰性表達(dá)7例中，1例為HPV表達(dá)陽性，6例為HPV表達(dá)陰性。見表3。

表3 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1與HPV感染之間的相關(guān)性分析表

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌被認(rèn)為是一種免疫性疾病，其病情發(fā)展與高度的免疫抑制密切相關(guān)[5]。而最新研究顯示細(xì)胞表面PD-L1的高表達(dá)是口腔鱗狀細(xì)胞癌潛在的發(fā)病機(jī)制,其通過PD-L1與PD-1結(jié)合觸發(fā)抑制性信號,從而抑制T細(xì)胞免疫效益或消弱其腫瘤細(xì)胞殺傷能力[6]。當(dāng)前,以PD-L1與PD-1信號通路為靶向的免疫治療在臨床試驗(yàn)中已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,同時(shí)也有研究顯示這種免疫治療的臨床取決于腫瘤細(xì)胞膜中PD-L1的表達(dá)情況，表明PD-L1的有效控制在口腔鱗狀細(xì)胞癌免疫治療中起到重要作用[7,8]。但PD-L1與口腔鱗狀細(xì)胞癌病情進(jìn)展的關(guān)系尚未見報(bào)道,對此進(jìn)行研究可為抑制性分子PD-L1來介導(dǎo)免疫抑制提供理論參考。

本研究采用免疫組化染色法檢測了51例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者組織中PD-L1表達(dá)情況,結(jié)果顯示：51例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中，PD-L1呈陽性表達(dá)44例(86.27%)，這與既往研究報(bào)道[9,10]基本吻合（76.4～91.0%）。對于PD-L1在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)的機(jī)制,有如下推測：PD-1/PD-L1通路可在惡性腫瘤進(jìn)展期間對免疫功能具有一定的抑制作用,但是由于主要淋巴器官能激發(fā)強(qiáng)烈免疫應(yīng)答的外源性抗原,因此導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的反向應(yīng)力作用，導(dǎo)致特異性的調(diào)高PD-L1表達(dá)[11]。P16是一種HPV感染而形成的替代性指標(biāo),在許多實(shí)體腫瘤研究已經(jīng)證實(shí)于口腔鱗狀細(xì)胞癌病情進(jìn)展有關(guān)，其低表達(dá)可導(dǎo)致HPV感染加重[12]。本研究51例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中，P16呈陽性表達(dá)22例(43.14%)，P16 呈陰性表達(dá) 29 例(56.86%)，而在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織PD-L1陽性表達(dá)44例中，29例P16表達(dá)呈陰性,而口腔鱗狀細(xì)胞癌組織PD-L1陰性表達(dá)7例中，全部P16表達(dá)呈陽性，可見口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的PD-L1表達(dá)與P16表達(dá)存在一定的相關(guān)性，這一研究結(jié)果與Farrow[13]研究結(jié)果相符。同時(shí)本研究還顯示，口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的PD-L1表達(dá)與P16表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.819，P=0.000),提示PD-L1高表達(dá)在一定程度上可促進(jìn)P1 6低表達(dá)，從而促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌病情進(jìn)展。

在口腔鱗狀細(xì)胞癌臨床危險(xiǎn)因素研究中，除吸煙和酗酒外，HPV感染也是口腔鱗狀細(xì)胞癌的重要的危險(xiǎn)因素[14]。在美國，口咽鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病有40%～80%是由于HPV感染所引起，其機(jī)制被認(rèn)為是長期HPV感染所引起的免疫功能下降所導(dǎo)致的癌變[15]。有研究指出，HPV感染也是導(dǎo)致口腔鱗狀細(xì)胞癌患者趨于年輕化的重要原因,且HPV陽性的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者臨床治療預(yù)后明顯差于HPV陰性的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者[16]。本研究結(jié)果顯示,口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的PD-L1表達(dá)與HPV感染呈正相關(guān)(rs=0.653，P=0.000)，即口腔鱗狀細(xì)胞癌組織PD-L1陽性表達(dá) 44例中，39例為HPV表達(dá)陽性，5例為HPV表達(dá)陰性，而口腔鱗狀細(xì)胞癌組織PD-L1陰性表達(dá)7例中，1例為HPV表達(dá)陽性，6例為HPV表達(dá)陰性。這研究結(jié)果表明，PD-L1高表達(dá)與HPV感染有一定的關(guān)系，其可能機(jī)制為口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的HPV感染起源于扁桃體,即通過扁桃體感染來調(diào)節(jié)口腔中的主要淋巴器官,導(dǎo)致HPV感染的扁桃體隱窩深部淋巴組織細(xì)胞長期與高濃度的外來免疫抗原接觸，從而導(dǎo)致扁桃體隱窩處高表達(dá)的HPV并對下調(diào)T細(xì)胞的功能，最終促進(jìn)PD-L1的高表達(dá)，從而形成HPV病毒感染后的口腔鱗狀細(xì)胞癌免疫逃避機(jī)制和惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制[17]?？梢奌PV感染可促進(jìn)PD-L1高表達(dá),從而促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌病情進(jìn)展。本研究進(jìn)一步研究還顯示口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的PD-L1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期之間呈負(fù)相關(guān) (rs=-0.736，P=0.000)，即口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的PDL1高度表達(dá),在一定程度上可促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在國內(nèi)外文獻(xiàn)中對此缺乏統(tǒng)一結(jié)論，多數(shù)研究認(rèn)為口咽鱗狀細(xì)胞癌PD-L1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期有關(guān)[18,19]，另有研究報(bào)道認(rèn)為口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1高表達(dá)僅與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,其作用機(jī)制也與長期HPV感染所導(dǎo)致的口腔鱗狀細(xì)胞癌免疫逃避機(jī)制和惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制有關(guān)[20]，因此PD-L1的高表達(dá)也可促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,也與口腔鱗狀細(xì)胞癌病情進(jìn)展密切相關(guān)。

綜上所述，本文結(jié)果顯示，PD-L1在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中呈高度表達(dá)，且與P16低表達(dá)、HPV感染以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),與P16低表達(dá)、HPV感染以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移共同促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌病情進(jìn)展。盡管PD-L1可通過P16、HPV感染及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移來抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌患者免疫功能，在臨床免疫靶向治療中也得到了重視，但由于PD-L1生物學(xué)特征及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚未完全明確,因此仍然需要以更大的前瞻性研究來證實(shí)PD-L1在口腔鱗狀細(xì)胞癌病情發(fā)展的作用,才能真正有助于口腔鱗狀細(xì)胞癌免疫療法的完善。