曹思源，李保祥，何悅，劉敏，吳習宇,2，任丹,2，徐丹,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400700)2(西南大學 食品貯藏與物流研究中心，重慶，400700)

柑橘是世界上產量最大也是最受消費者歡迎的水果之一，味道甜美且營養(yǎng)價值高[1]。但柑橘果實的成熟期較為集中，在采后貯藏和運輸過程中失水率高且容易腐爛，造成了較大的經濟損失和資源浪費[2-3]。據(jù)國家統(tǒng)計局調查數(shù)據(jù)顯示，2019年我國的柑橘產量為4 584.54萬t。但我國的柑橘果實采后貯藏與保鮮技術與發(fā)達國家相比還較為落后，果實的采后損失率高達20%～30%[4]。控制采后果實的貯藏溫度，以降低果實的采后呼吸和蒸騰速率，可顯著延緩果實的衰老，是目前果實采后保鮮最常用的技術手段。但柑橘果實在低溫下貯藏容易遭受冷害，且運輸和銷售過程中的環(huán)境溫度波動較大，僅依靠環(huán)境溫度的調節(jié)難以達到最佳的保鮮效果。

近年來，可食性涂膜技術作為一種易于操作、效果顯著且安全無毒的保鮮方式受到了廣泛關注。涂覆在果實表面的半透性可食性薄膜，作為果實與環(huán)境之間的屏障，具有調控果實的呼吸作用、降低水分散失和抵御病菌侵染等作用，進而延長果實的貨架期[5]。研究表明，涂膜還可維持柑橘果實細胞膜氧化酶活性以及細胞膜結構的穩(wěn)定性，從而有效提高果實對低溫的耐受性，減少冷害的發(fā)生[6-8]。因此，將涂膜保鮮技術與溫控技術聯(lián)用，有望進一步減少柑橘果實在貯運過程中的損失。但果實的呼吸強度隨貯藏溫度的降低而下降，因此涂膜對果實呼吸的調節(jié)作用也受溫度的影響。同時，本項目組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在果實的呼吸和蒸騰作用下，親水性的殼聚糖(chitosan，CS)涂膜在貯藏期間會出現(xiàn)微孔，導致涂膜的致密結構被破壞而削弱其對果實的屏障作用，降低涂膜保鮮效果。在涂膜中添加納米晶纖維素(nanocrystal cellulose，NCC)可提高涂膜結構的穩(wěn)定性，延緩微孔的出現(xiàn)，進而提高其保鮮效果[9]。同時，果實的呼吸速率越快，涂膜中的微孔出現(xiàn)得越早。由此可見，貯藏溫度不僅會影響涂膜對果實的呼吸調控作用，也會影響涂膜結構的變化，進而影響其保鮮效果。但目前鮮有文獻對不同貯藏溫度下的涂膜保鮮效果進行研究。因此，本文在前期的研究基礎上，采用NCC質量分數(shù)為6%的殼聚糖復合涂膜液對紅桔果實進行涂膜處理后，將其與未處理的對照組在不同溫度(4、8、12 ℃)下貯藏，對果實的營養(yǎng)物質含量、抗氧化酶活性等進行監(jiān)測，并定期觀察涂膜的表面微觀形貌，以探究溫度對涂膜保鮮效果的影響及機理。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

紅桔(CitrustangerineHort.ex Tanaka)，采于重慶市北碚區(qū)果園。殼聚糖，脫乙酰度為90%，分子質量為180 kDa，濰坊海之源生物制品有限公司；NCC 分散液，質量分數(shù)為1.15%，天津市木精靈生物科技有限公司，采用2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物(2,2,6,6-tetramethylpiperidine oxide，TEMPO)氧化法制備；其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

L530R型臺式低速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Epoch2型酶標儀光度計，BioTek Instruments, Inc；ProX型臺式掃描電鏡能譜一體機，PhenomWorld, Inc。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗樣品處理

將一定量的NCC懸浮液(NCC干重為殼聚糖干重的6%)添加至1%(體積分數(shù))的乙酸水溶液中，磁力攪拌30 min。在均勻混合的NCC溶液中加入一定量殼聚糖，使殼聚糖質量濃度達到15 g/L，并持續(xù)攪拌24 h得到均勻NCC/CS復合膜液備用。

在當天采摘的紅桔中選取成熟度、質量和大小一致的果實。清水洗凈后，在質量分數(shù)為2%的NaClO溶液中浸泡2 min消毒。常溫晾干水分后將其隨機分為6組，每組約80個果實。對照組不再進行任何處理，共3組，分別置于溫度為(4±1)、(8±1)和(12±1)℃，濕度為(60±10)%的環(huán)境中貯藏，分別記為4 ℃對照、8 ℃對照和12 ℃對照。涂膜組用NCC質量分數(shù)為6%的NCC/CS 復合膜液通過刷子均勻涂覆桔皮，自然風干，分別置于溫度為(4±1)、(8±1)、(12±1)℃，濕度為(60±10)%的環(huán)境中貯藏，分別記為4 ℃涂膜、8 ℃涂膜和12 ℃涂膜。每組中隨機選取30個果實用于失重率和腐爛率的檢測，從1～30進行標號并記錄其初始質量m0。每2 d從各組其余果實中隨機取出5個無損鮮果，將鮮果果肉榨汁，并用4層紗布過濾，采用過濾后的果汁測定其品質指標。

1.2.2 檢測指標與方法

1.2.2.1 腐爛率

每2 d觀察果實表面是否有病斑、腐爛、軟化等現(xiàn)象，如有則記為爛果，記錄從第0天至測量當天每組的累計爛果數(shù)，腐爛率計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.2.2 失重率

初始果實質量為m0,每2 d對1～30號果實進行單果稱重，記當天質量為mt，失重率按公式(2)計算：

(2)

1.2.2.3 可滴定酸含量

參考文獻[10]的方法測定，結果用%表示。

1.2.2.4 可溶性固形物含量

采用阿貝折射儀測定，用%表示。

1.2.2.5 可溶性蛋白質含量

參考文獻[10]的方法測定，結果用μg/g表示。

1.2.2.6 丙二醛含量

參考文獻[10]的方法測定，結果用μmol/kg表示。

1.2.2.7 抗壞血酸含量

參考GB 5009.86—2016《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》，采用2，6—二氯丁酚滴定法進行測定，結果用mg/100 g表示。

1.2.2.8 總酚含量

參考文獻[10]的方法測定，結果以每克樣品含有微克沒食子酸表示，μg/g。

1.2.2.9 過氧化物酶(peroxidase, POD)活性

用愈創(chuàng)木酚法測定，具體步驟參考文獻[10]的方法進行，以每克紅桔汁樣品每分鐘吸光度變化值增加1作為1個POD活性單位，用U/g表示。

1.2.2.10 過氧化氫酶(catalase, CAT)活性

采用Solarbio過氧化氫酶活性檢測試劑盒測定，測試過程參照試劑盒說明書，結果用U/g表示。

1.2.2.11 DPPH自由基清除率

用無水乙醇配制1 mmoL/L DPPH溶液。用5 mL無水乙醇提取0.5 g紅桔樣品，在4 ℃下以4 500 r/min離心30 min，吸取2 mL上清液加入2 mL 1 mmol/L的DPPH溶液在室溫下反應1 h，以無水乙醇做參比液在518 nm處測量樣品液吸光度值，DPPH自由基清除率計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0，無水乙醇在518 nm處的吸光度值；A1，樣品液在518 nm處的吸光度值。

1.2.2.12 掃描電子顯微鏡分析

首先將桔皮樣品在液氮中脆斷，然后將干燥的膜樣品切成方形小塊(10 mm×10 mm)，用導電膠將其固定在樣品臺上進行噴金處理，最后用掃描電鏡觀察桔皮表面結構與形貌，加速電壓設置為10 kV。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品進行3次重復，結果以“均值±標準偏差”表示，進行單因素方差分析，若數(shù)據(jù)有顯著性差異，再進行Duncan法多重比較，顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 腐爛率

各組紅桔果實在貯藏期間的腐爛情況如圖1所示。對照組中，貯藏于4、12 ℃果實的腐爛率上升較快，尤其是12 ℃對照組，至第12天時其腐爛率高達53.3%；而8 ℃對照組的腐爛率則顯著低于以上2組。涂膜組中，12 ℃貯藏的果實同樣具有較高的腐爛率，而4、8 ℃貯藏的涂膜組則在貯藏第6天才出現(xiàn)腐爛，并在整個貯藏期間均維持了較低的腐爛率，尤其是8 ℃涂膜組，至第12天時其腐爛率僅為12 ℃對照組的50%。紅桔的最適貯藏溫度一般為8～10 ℃，實驗結果也表明8 ℃貯藏的對照組和涂膜組均具有較低的腐爛率。貯藏溫度過低(4 ℃)，果實容易發(fā)生冷害，腐爛程度加重[11]；貯藏溫度過高(12 ℃)，則果實的呼吸速率高，且病原菌繁殖速度快，其衰老和腐爛速率加快。同時，與相同貯藏溫度的對照組相比，涂膜組的腐爛速率均明顯降低。貯藏12 d時，12、8和4 ℃涂膜組的腐爛率相較于相同溫度下的對照組分別降低了37.5%、12.5%和27.3%。由此可看出，12 ℃時，涂膜處理對紅桔腐爛的抑制效果最好，其次為4 ℃，而8 ℃時，涂膜抑制果實腐爛的效果不顯著。

涂膜主要通過其半透性來減少果實內部與外界的氣體交換，降低果實的呼吸強度。因此，在較高溫度下(12 ℃)，果實具有較高呼吸強度時，涂膜可更好地發(fā)揮其抑制果實呼吸的作用，延緩其衰老；在較低溫度下(4 ℃)，涂膜可提高果實的低溫耐受能力，降低其腐爛率。而8 ℃時，果實的呼吸作用已減緩，各項生理活動也隨之減弱，因此涂膜對果實呼吸的調控作用較為有限。

2.2 失重率

紅桔果實在貯藏期間的失重情況如圖2所示，可以看出貯藏溫度對果實的失重率具有顯著影響(P<0.05)。各組果實在4 ℃下的失重率最低，并隨貯藏溫度的升高而逐漸增加。同時，相同溫度下對照組和涂膜組果實失重率之間的差異也隨溫度上升而增加。貯藏在4、8 ℃下的對照組和涂膜組果實的失重率在貯藏期間均無顯著差異(P>0.05)，而12 ℃涂膜組的失重率在貯藏第8天后顯著低于對照組(P<0.05)。果實在貯藏期間的質量下降主要源于蒸騰作用導致果實內部水分散失[12]，而失水不僅影響果實的口感，且可造成細胞膨壓降低，引起組織萎蔫，果品光澤消失。低溫下，果實的蒸騰速率降低，且果皮蠟質層較為穩(wěn)定[13]，可較好地保持其結構穩(wěn)定，防止果實失水[14]。因此，果實的失重率隨溫度降低明顯下降。但涂膜僅在果實失重率較高時起到抑制果實失重的作用，這可能是由于殼聚糖/納米纖維素復合涂膜的阻濕性較差，主要通過其對果實呼吸作用和生理活動的抑制來起到降低果實失重的作用。

2.3 果肉中營養(yǎng)物質的含量變化

由圖3-a可知，各組果實中抗壞血酸含量在貯藏期間均呈波動變化狀態(tài)?？箟难崾枪咧蟹敲割惪寡趸瘎?，貯藏過程中在抗壞血酸氧化酶的作用下被氧化，其脫下的氫離子與活性氧結合，減少自由基的累積?？箟难嵩诳寡趸^程中被消耗造成含量降低[15]；而果實在貯藏過程中發(fā)生的采后成熟、生物合成、氧化和再循環(huán)等過程則會造成抗壞血酸含量的上升[16]。以上2種作用造成了果實中抗壞血酸含量的波動。12 ℃對照組果實中的抗壞血酸含量在貯藏前6 d波動幅度較大，可能是由于貯藏溫度較高，果實的生理活動較強導致，但12 ℃涂膜組的抗壞血酸含量與4、8 ℃貯藏果實較為接近，說明涂膜抑制了果實的生理活動，有利于穩(wěn)定果實中營養(yǎng)物質的含量。

由圖3-b可知，各組果實的總酚含量隨貯藏時間均呈先下降后上升的趨勢，與冉皓杰等[17]研究結果一致。酚類化合物是果實的次生代謝產物，具有防御功能，其含量變化反應了果實成熟度及對環(huán)境脅迫產生的應激反應[18]。貯藏前期，果實生理活動劇烈，酚類物質被氧化、消耗，導致其含量降低。此時各溫度下涂膜組果實總酚含量降低速率低于其相同溫度下的對照組。貯藏后期，細胞氧化受損，果實合成總酚作為防御物質，因此總酚含量也反映了細胞的受損情況[19]。各組果實中，其中12 ℃對照組果實總酚含量上升最為明顯，其余組的總酚含量較為接近，說明貯藏溫度越高，果實細胞受損衰老越嚴重，但涂膜可緩解這一現(xiàn)象。

由圖3-c可知，各組果實可溶性固形物含量總體先下降后上升。糖分是可溶性固形物的主要組成成分，在貯藏初期被消耗轉化為CO2和O2，含量下降。而隨著果實的失水和衰老，細胞壁水解產生的多糖和部分淀粉的相繼水解又會造成可溶性固形物含量的逐漸上升至相對穩(wěn)定[20]。相同溫度下對照組與涂膜組變化趨勢較為一致。貯藏中期(第6～8天)，貯藏于4、8 ℃下的對照組果實中的可溶性固形物含量高于相同溫度下的涂膜組，但貯藏后期差異減小，說明在這2個溫度下涂膜可減少果實中糖分的消耗。

可溶性蛋白是構成果蔬中酶的重要組成部分，參與了多種生理生化反應的調控，同時也是重要的營養(yǎng)物質和滲透調節(jié)物質[21]。由圖3-d可知，在貯藏初期，呼吸作用較強，可溶性蛋白快速水解，導致各組果實內其含量銳減。但在貯藏2 d后，可溶性蛋白的含量較為穩(wěn)定，且各組之間無顯著差異(P>0.05)，說明涂膜和貯藏溫度對貯藏后期果實的可溶性蛋白含量無顯著影響。

a-抗壞血酸；b-總酚；c-可溶性固形物；d-可溶性蛋白質圖3 紅桔果實在不同貯藏溫度下的營養(yǎng)物質含量變化Fig.3 Changes of nutrient contents of red tangerines fruits under different storage temperatures

2.4 丙二醛含量變化

如圖4所示，貯藏期間所有實驗組果實的丙二醛含量均隨貯藏時間延長而上升。丙二醛作為脂質過氧化作用的次要終產物，常被用作膜完整性喪失的代謝指標[22]，反映膜受損的情況。從圖4可看出，4、8 ℃貯藏的果實中丙二醛含量增速相對緩慢，且各組的含量在貯藏期間除第10天外均無顯著性差異(P>0.05)。12 ℃貯藏果實的丙二醛含量則隨貯藏期的延長而迅速增加，尤其是12 ℃對照組。由此進一步說明，貯藏在較高溫度(12 ℃)下的果實細胞膜脂氧化較快，衰老加快，與陳小紅[23]的研究結果一致。但NCC/CS涂膜可抑制果實呼吸，從而降低果實的過氧化程度，延緩果實衰老。

圖4 紅桔果實在不同貯藏溫度下的丙二醛含量變化Fig.4 Changes of MDA content in red tangerines fruits under different storage temperatures

2.5 DPPH自由基清除率與抗氧化酶活性變化

由表1可知，隨貯藏時間的延長，紅桔果實的DPPH自由基清除率總體呈下降趨勢，即其抗氧化能力下降。果實貯藏第12天時，各組果實中DPPH自由基清除率最低的為8 ℃對照組，最高的為12 ℃涂膜組。果實的DPPH自由基清除率取決于其抗氧化物質的含量，從2.3節(jié)可看出，果實中的抗壞血酸和總酚等營養(yǎng)物質含量均呈先下降后上升的趨勢，與表中各組果實的DPPH自由基清除率變化趨勢較為一致。同時，除4 ℃貯藏的果實外，其余貯藏溫度下的涂膜組果實的DPPH自由基清除率在貯藏后期均顯著高于對照組(P<0.05)，說明NCC/CS涂膜可有效延緩果實抗氧化能力的降低，有助于增強其防御能力。

表1 貯藏溫度和NCC/CS涂膜對紅桔貯藏期DPPH自由基清除率的影響Table 1 Effect of storage temperature and NCC/CS coating on DPPH free radical scavenging rate of tangerine during storage

POD作為果蔬內重要的氧化還原酶之一，在降低活性氧積累、延緩膜脂過氧化進程以及維持細胞膜完整性中都承擔著重要作用。它能夠清除植物組織中的活性氧自由基，保護細胞膜脂，但是它也可以產生酚自由基，促進果蔬采后衰老[24-25]。由圖5-a可知，貯藏前2 d果實POD活性有所上升，可能是果實的環(huán)境應激反應。此后，12 ℃對照組果實的POD活性持續(xù)下降，說明果實的衰老較快，與陳超等[26]的研究結果一致，而4 ℃對照組則保持穩(wěn)定的活性直至第12天時迅速下降，可能是由于果實遭受冷害導致細胞損傷。但12和4 ℃貯藏的涂膜組果實的POD活性變化趨勢則與8 ℃貯藏的對照組和涂膜組一致，均在第8天達到峰值而后下降。由此說明，涂膜可在貯藏溫度較高時維持抗氧化酶活性，延緩果實的衰老，且在溫度較低時保護果實細胞免受損傷。

a-POD活性;b-CAT活性圖5 紅桔果實在不同貯藏溫度下的抗氧化酶活性變化Fig.5 Changes of antioxidant enzyme activity in red tangerines fruits under different storage temperatures

CAT是植物生長系統(tǒng)防御的關鍵酶之一，它在氧化應激條件下對清除活性氧起著必不可少的作用[27]。圖5-b所示，8和12 ℃貯藏的對照組果實的CAT活性在第4天達到峰值，而貯藏在相同溫度下的涂膜組果實CAT活性則在貯藏第8天才開始顯著上升(P<0.05)，說明涂膜減少了自由基的積累，推遲了CAT啟動防御的時間。果實如出現(xiàn)冷害，會造成細胞超微結構變化，例如質體降解和過氧化物酶體的消失等[28-30]，使得抗氧化酶活力下降[27]。圖5-b中可看出4 ℃對照組果實的CAT在整個貯藏期間均維持較低的活性，但涂膜組果實的CAT活性從第8天開始上升且在第10天達峰值，與POD活性變化較為一致。由此說明，4 ℃貯藏的對照組果實出現(xiàn)了冷害，而涂膜處理能有效提高CAT參與活性氧代謝程度，減輕冷害癥狀。

2.6 紅桔果皮形貌變化

圖6所示為各組紅桔表皮的微觀形貌隨貯藏時間的變化。對照組果皮上的蠟質層結構隨貯藏時間的延長而逐漸被破壞，尤其是貯藏于12 ℃的果實，在第12天時蠟質層出現(xiàn)了明顯的破裂和剝離。經涂膜處理后，果實表面被致密的NCC/CS涂膜所覆蓋，氣孔消失。隨著貯藏時間的延長，在果實氣孔處的呼吸和蒸騰作用下，親水性的NCC/CS涂膜的結構被破壞，果實氣孔位置處出現(xiàn)微孔，與前期研究結果一致[9]。且該微孔的出現(xiàn)時間隨著貯藏溫度的升高而提早，貯藏第6天時，4 ℃貯藏果實表面的涂膜未觀察到微孔，8 ℃貯藏果實的涂膜開始形成微孔；而12 ℃貯藏果實的涂膜則早在第2天便觀察到了微孔，且在第6天時涂膜出現(xiàn)了局部脫落的現(xiàn)象。由此說明，NCC/CS涂膜的穩(wěn)定性確實與貯藏溫度有關，貯藏溫度越低，果實的呼吸與蒸騰作用速率降低，涂膜出現(xiàn)微孔的時間也越晚。貯藏于12 ℃的果實雖然在后期涂膜結構被破壞，但由于涂膜前期的保護作用，例如顯著降低果實的過氧化程度，因此涂膜組果實的腐爛率在貯藏后期仍然顯著低于對照組。

圖6 各組紅桔果實在不同貯藏溫度下的果皮形貌變化Fig.6 Changes of peel morphology of red tangerines fruits in each group under different temperatures

3 結論

本研究考察了NCC/CS涂膜組與對照組紅桔果實在4、8、12 ℃下貯藏時的品質與酶活性變化。結果表明，在最佳貯藏溫度8 ℃下，紅桔果實能維持較低的呼吸強度且不會出現(xiàn)冷害，此時NCC/CS涂膜對果實的貯藏品質無顯著提高。貯藏于12 ℃的紅桔果實，呼吸作用較強，衰老加快導致其在貯藏后期迅速腐爛，但涂膜組果實具有顯著降低的腐爛率、失重率和丙二醛含量，且保持了較為穩(wěn)定的可溶性固形物、可溶性蛋白質含量以及POD和CAT的活性。同時，貯藏在4 ℃的紅桔果實易發(fā)生冷害而腐爛，但涂膜處理可顯著(P<0.05)降低其腐爛率和丙二醛含量，并推遲POD和CAT活性高峰，增強了果實的耐冷害能力。果實表面的涂膜隨貯藏時間的延長而出現(xiàn)微孔，但其穩(wěn)定性隨貯藏溫度降低而提高。因此，NCC/CS涂膜在貯藏溫度較高時可適當抑制果實呼吸，在貯藏溫度較低時可減少冷害的發(fā)生，有助于提高果實在貯運過程中對溫度波動的耐受度，起到減損保鮮的效果。