高 萍，王巖松，郭龍秀，李保平

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095）

昆蟲腸道中存在大量的微生物[1]，這些微生物群落對宿主昆蟲有重要作用，主要包括抵御外來病原菌侵襲、參與多重營養(yǎng)關(guān)系、引起昆蟲免疫反應(yīng)等[2-4]。共生菌可為宿主昆蟲提供多種必需的營養(yǎng)物質(zhì)，包括一些常見維生素、特殊的固醇和大多數(shù)氨基酸等[5-7]。此外，腸道共生菌也能增強昆蟲種間和種內(nèi)交流[8,9]。環(huán)境因素特別是食物資源對昆蟲腸道微生物組成發(fā)揮著重要作用[10,11]。目前，關(guān)于宿主的食物對微生物群落組成的影響有三個假說：（1）微生物具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，取食后不會影響腸道菌群結(jié)構(gòu)[12]；（2）獵物體內(nèi)的微生物被取食后在捕食者腸道中定殖[13]；（3）取食獵物后宿主腸道的物理化學(xué)條件改變可能導(dǎo)致環(huán)境衍生微生物類群重構(gòu)，這類微生物可能是來自于獵物或是原本存在于宿主體內(nèi)且含量較低[14]。迄今，雖有這些假說得到某些實證研究支持，但尚需更多證據(jù)。

異色瓢蟲Harmonia axyridis(Pallas)（鞘翅目Coleoptera：瓢蟲科Coccinellidae）對蚜蟲、葉螨、介殼蟲、粉蚧等重要害蟲具有很強的捕食能力，作為一種重要的生防天敵, 不僅在原產(chǎn)地東亞的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，而且被引入北美和歐洲防治蚜蟲[15,16]。近年來，異色瓢蟲腸道微生物菌群開始得到關(guān)注。Dudek等[17]研究發(fā)現(xiàn)，異色瓢蟲體內(nèi)細(xì)菌菌群以共生菌為主，且這類共生菌在環(huán)境中廣泛分布。Schmidtberg等[18]研究發(fā)現(xiàn)，異色瓢蟲消化道中的沙雷氏菌屬Serratia和乳酸菌屬Lactococcus能夠調(diào)節(jié)反射性出血中的信息化學(xué)物質(zhì)合成。目前，尚不清楚長時間取食單一獵物對異色瓢蟲腸道菌群有何影響。

本研究旨在探明，當(dāng)異色瓢蟲轉(zhuǎn)向取食非本土的扶桑綿粉蚧后，其腸道菌群是否隨之發(fā)生變化。該研究不僅可檢驗上述幾個假說，而且可為認(rèn)識異色瓢蟲與共生菌群互作關(guān)系提供基本依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

豌豆修尾蚜于2020年4月采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南京試驗地邊的野豌豆Vicia gigantea植株上，采回后在養(yǎng)蟲室內(nèi)用盆栽蠶豆苗Vicia faba上的豌豆修尾蚜繼代飼養(yǎng)。扶桑綿粉蚧于2018年8月采自浙江省杭州市臨安區(qū)，采回后在養(yǎng)蟲室內(nèi)用馬鈴薯Solanum tuberosum苗繼代飼養(yǎng)。異色瓢蟲于2020年5月采自南京市南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬試驗基地內(nèi)的野豌豆上，在養(yǎng)蟲室內(nèi)用豌豆修尾蚜繼代飼養(yǎng)1代后用于試驗。養(yǎng)蟲室環(huán)境溫度（26±1）℃，相對濕度（60±10）%，光周期16L:8D。

1.2 方法

養(yǎng)蟲籠（邊長40 cm的正方形）中放置4～5株有豌豆修尾蚜的蠶豆苗，釋放20頭異色瓢蟲成蟲，每2～3 d更換1次蠶豆苗，每天收集卵并放入培養(yǎng)皿（直徑6 cm，高1.5 cm）中待幼蟲孵化。將剛孵化的1齡幼蟲隨機分為兩個飼喂處理組：“食蚜蟲組”用豌豆修尾蚜飼喂；“食粉蚧組”用扶桑綿粉蚧飼喂。當(dāng)其生長發(fā)育至成蟲20 d后，取單頭瓢蟲饑餓24 h后浸泡于75%酒精1 min，隨后用無菌水清洗蟲體表面2～3次，再放置于無菌的PBS緩沖液中用滅菌的解剖工具在體視鏡下解剖獲得腸道組織，放于體積1.5 mL的離心管中保存于- 80 ℃冰箱中。每個處理組重復(fù)6頭雌和6頭雄成蟲。

1.3 DNA提取及PCR擴增

根據(jù)DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒（QIAGEN，Hilden，Germany）說明書進(jìn)行總DNA提取，DNA濃度和純度利用紫外分光光度計（Nanodrop one，Theromo Scientific）進(jìn)行檢測，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 提取質(zhì)量；用 338F 和 806R（338F：3′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-5′；806R：3′-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-5′）引物對V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴增，擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，32個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s），最后72 ℃延伸5 min（PCR儀：TC-96/G/H(b)C型）。擴增體系為50 μL，25 μL聚合酶，19 μL無菌水，4 μL引物，2 μL DNA模板。

用2%瓊脂糖凝膠回收 PCR 產(chǎn)物，利用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用Synergy2（BioTek，USA）進(jìn)行檢測定量。根據(jù) Illumina MiSeq 平臺（Illumina，SanDiego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進(jìn)行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

鑒于異色瓢蟲雌、雄蟲腸道菌群組成近似，將雌、雄蟲的測序數(shù)據(jù)合并后分析。原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用 FLASH 軟件進(jìn)行拼接：（1）設(shè)置 50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列；（2）barcode 需精確匹配，引物允許2個堿基的錯配，去除模糊堿基；（3）根據(jù)重疊堿基 overlap 將兩端序列進(jìn)行拼接，overlap 需大于10 bp。去除無法拼接的序列。使用的UPARSE 軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），根據(jù) 97%的相似度對序列進(jìn)行 OTU聚類；使用 UCHIME軟件剔除嵌合體。利用 RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫，設(shè)置比對閾值為70%。

采用RDP classifier軟件（version 2.2）的貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，與Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并分別在各分類階元上統(tǒng)計物種組成，默認(rèn)置信度閾值為0.7。采用mothur 軟件（version 1.30.1）在OUT水平上計算食粉蚧組和食蚜蟲組的菌群豐富度實際觀測值（Sobs 指數(shù)）、菌群豐富度（Chao指數(shù)）和菌群多樣性（Shannon指數(shù)），此外還根據(jù)Sobs指數(shù)繪制稀釋曲線。用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗比較Sobs、Chao和Shannon指數(shù)在兩處理組之間的差異，用非參數(shù)Wilcoxon秩和測驗比較兩處理組間的物種差異。基于Bray-Curtis距離算法，用主坐標(biāo)分析（PCoA）比較兩處理間群落組成的相似性，并用Adonis分析（置換999次）對兩處理進(jìn)行差異性檢驗。采用PICRUSt中的KEGG數(shù)據(jù)庫推測腸道菌群功能，采用Welch’st測驗比較兩處理間腸道菌群功能的差異。作圖用STAMP軟件（version 2.0.6），數(shù)據(jù)分析用R軟件[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU數(shù)量比較

從取食不同獵物的異色瓢蟲24個腸道樣本中，經(jīng)過質(zhì)量過濾和去除嵌合體后，得到848129條高質(zhì)量序列，每條序列平均長度為427 bp。按照最小樣本數(shù)序列19390進(jìn)行抽平，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的747個OTUs（圖1C）。其中，食粉蚧組異色瓢蟲腸道菌群OTU為673個，食蚜蟲組異色瓢蟲腸道菌群為297個；兩個獵物處理組共有OTU為223個，占29.85%；食粉蚧組異色瓢蟲特有OTU為450個，占60.24%；食蚜蟲組瓢蟲特有OTU為74個，占9.91%。

圖1 飼喂不同獵物處理下異色瓢蟲成蟲的腸道菌群組成Fig. 1 Microbiota composition in the gut of adults feeding on different prey species in H. axyridis

2.2 群落組成比較

總共注釋到23個門、54個綱、138個目、229個科、414個屬和595個種。在注釋到的23個門中，兩處理組共有 16個門，豐度較高的依次為變形菌門 Proteobacteria、厚壁菌門 Firmicutes、放線菌門Actinobacteria、異常球菌門Deinococcota和擬桿菌門Bacteroidetes；變形菌門在兩組瓢蟲腸道內(nèi)最為豐盛，在食粉蚧組占比73.15%，在食蚜蟲組占比88.75%（圖1A）。食粉蚧組瓢蟲有7個特有門，食蚜蟲組瓢蟲沒有特有門。

在屬階元水平，兩個處理組異色瓢蟲的腸道菌群出現(xiàn)較大的差異（圖1B）。在共注釋到的414個屬中，兩處理組共有169個屬；食粉蚧組有210個特有屬，食蚜蟲組有35個特有屬；食粉蚧組瓢蟲腸道菌群中豐度最高的屬依次為騰沖菌屬Vulcaniibacterium、腸桿菌屬Enterobater、貪銅菌屬Cupriavidus、短芽孢桿菌屬Brevibacillus和葡萄球菌屬Staphylococcus，食蚜蟲組中依次是腸桿菌屬、沙雷氏菌屬Serratia、騰沖菌屬、葡萄球菌屬和地芽孢桿菌屬Geobacillus。兩組瓢蟲在14個屬上存在顯著差異（圖1D）。

2.3 菌群多樣性

每個分析樣品的稀釋曲線都趨于平緩（圖2A），說明檢測到了樣本中絕大多數(shù)微生物類群。Sobs豐富度指數(shù)在兩處理組之間存在顯著差異（P＜0.01）：食粉蚧組Sobs指數(shù)（171.20）比食蚜蟲組的（112.60）高52%（圖2C）。Chao豐富度指數(shù)在兩處理間有顯著差異（P＜0.01）：食粉蚧組的Chao指數(shù)（188.69）比食蚜組的（135.20）高 40%（圖2D）；Shannon多樣性指數(shù)在兩處理間有顯著性差異（P＜0.01），食粉蚧組的Shannon指數(shù)（2.63）比食蚜蟲組的（1.51）高74%（圖2E）。兩處理組異色瓢蟲腸道菌群組成表現(xiàn)出明顯的聚類（R2＝0.49，P＜0.01）（圖2B）。

圖2 飼喂不同獵物的異色瓢蟲腸道菌群的Alpha和Beta多樣性比較Fig. 2 Alpha and Beta diversity of microbiota in the gut of adults feeding on different prey species in H. axyridis

2.4 功能預(yù)測

食粉蚧組和食蚜蟲組異色瓢蟲的腸道菌群的功能相似，主要為代謝、環(huán)境信息處理和基因信息處理等，代謝功能主要包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝和能量代謝，其中碳水化合物代謝和氨基酸代謝功能豐度遠(yuǎn)高于其他代謝功能（圖3A，3B）。食粉蚧組和食蚜蟲組腸道代謝通路在功能豐度上具有一定差異性，食粉蚧組的代謝功能比食蚜蟲組豐度更高，但環(huán)境信息處理功能豐度更低。在代謝功能里，食粉蚧組的氨基酸代謝和能量代謝功能比食蚜蟲組豐度更高，但碳水化合物代謝功能豐度更低（圖3A，3B）。

圖3 不同飼喂獵物的異色瓢蟲腸道菌群的KEGG功能豐度統(tǒng)計Fig. 3 Statistics of functional abundances based on the KEGG pathway for gut microbiota of adults feeding on different prey species in H. axyridis

3 討論

本研究總共注釋到23個門、54個綱、138個目、229個科、414個屬和595個種。取食扶桑綿粉蚧后的異色瓢蟲腸道菌群中檢測出23個門、379個屬、673個OTU；取食豌豆修尾蚜后的異色瓢蟲腸道菌群中檢測出16個門、204個屬、297個OTU。比較兩飼喂食物處理的宿主瓢蟲菌系組成后發(fā)現(xiàn)，取食扶桑綿粉蚧后出現(xiàn)了新的細(xì)菌階元：7個門、210個屬，并多出2.3倍的OTU。

本研究發(fā)現(xiàn)，異色瓢蟲取食扶桑綿粉蚧后腸道菌群在豐富度和多樣性指數(shù)上遠(yuǎn)高于取食豌豆修尾蚜，PCoA聚類表明不同處理下的菌群明顯分化，在豐度位居前15的屬中除沙雷氏菌屬外，其余屬的物種差異在兩處理間均有明顯不同，說明異色瓢蟲取食不同獵物后腸道菌群組成受到了影響。在其他類昆蟲的研究中也有同樣發(fā)現(xiàn)，例如，植食性茄二十八星瓢蟲Epilachna vigintioctopunctata在取食不同植物后，腸道菌群組成發(fā)生明顯變化[20]；食譜可影響德國小蠊Blattella germanica的腸道菌群組成[21]；灰屋蜘蛛Badumna longinqua腸道菌群在取食果蠅Drosophila hydei和取食灶馬蟋Gryllodes sigillatus后明顯不同[22]。進(jìn)一步對獵物的菌群分析發(fā)現(xiàn)（未發(fā)表），扶桑綿粉蚧的菌群的豐富度和多樣性指數(shù)顯著高于豌豆修尾蚜，與取食不同獵物后異色瓢蟲腸道菌群多樣性的結(jié)果類似。豌豆修尾蚜的原生共生菌Buchnera占優(yōu)，這和其他蚜蟲類似[23-26]。而扶桑綿粉蚧的優(yōu)勢屬為Candidatus tremblaya，這和其他學(xué)者對扶桑綿粉蚧的研究一致[27-29]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，從異色瓢蟲腸道組織中并沒有檢測到在扶桑綿粉蚧和豌豆修尾蚜體內(nèi)占優(yōu)勢的微生物類群，這說明扶桑綿粉蚧和豌豆修尾蚜能夠塑造異色瓢蟲的腸道菌群，但獵物菌群并沒有水平傳播定殖到異色瓢蟲體內(nèi)。推測異色瓢蟲腸道菌群不同的原因，可能與取食扶桑綿粉蚧和豌豆修尾蚜后引起自身生理代謝的變化致使腸道菌群組成發(fā)生變化所致。但這一推測仍需進(jìn)一步驗證。

腸道菌群參與宿主生理代謝活動，包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝和環(huán)境信息處理等。本研究發(fā)現(xiàn)，食粉蚧組瓢蟲菌群的氨基酸代謝和能量代謝功能比食蚜蟲瓢蟲的豐度更高，而行使碳水化合物代謝功能的豐度較低。昆蟲在遇到食物缺乏、營養(yǎng)匱乏以及某些食物不能消化等問題時，昆蟲體內(nèi)的共生菌則可以直接或間接地為宿主昆蟲的生存提供必需氮源、氨基酸、甾醇類和B族維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[30]。在橘臀紋粉蚧Planococcus citri(Risso)體內(nèi)氨基酸代謝功能是由嵌套菌Candidatus moranella endobia和C.tremblaya princeps共同參與[31,32]。厚壁菌門參與能量吸收，該類微生物的增加能夠影響捕食者從獵物中獲取能量[33]。而環(huán)境信息功能很大程度是由寄主提供，因為內(nèi)共生菌生存環(huán)境相對穩(wěn)定[34]。異色瓢蟲腸道菌群的具體功能有待進(jìn)一步解析。

本研究結(jié)果說明，腸道菌群可能在其宿主異色瓢蟲的營養(yǎng)生態(tài)學(xué)中發(fā)揮著重要的作用。這意味著瓢蟲腸道菌群可快速響應(yīng)食物的變化，從而賦予該瓢蟲對環(huán)境表現(xiàn)出很強的適應(yīng)性，不僅在原產(chǎn)地廣泛分布且在群落中占優(yōu)勢地位，而且成功入侵北美洲和歐洲。對此，有必要開展進(jìn)一步深入研究。