范樂樂，郭 妍，趙 雪，孫漫紅，李世東

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinum（異名：淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus）是一種重要的生防真菌，可寄生根結(jié)線蟲Meloidogynespp.、胞囊線蟲Heteroderaspp.和腎狀線蟲Rotylenchulusspp.等多種植物線蟲[1-3]，同時(shí)對(duì)番茄灰霉病、辣椒炭疽病等多種植物病害具有良好的防控效果[4,5]。研究表明，淡紫紫孢菌發(fā)酵過程中可產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，其中幾丁質(zhì)酶、絲氨酸蛋白酶、丁酸和脂肪酸等對(duì)根結(jié)線蟲具有強(qiáng)烈的抑殺作用[6-8]。Seo等[9]對(duì)淡紫紫孢菌發(fā)酵液提純分析發(fā)現(xiàn)，殺線蟲活性組分主要為乙酸。淡紫紫孢菌還可以產(chǎn)生白灰質(zhì)菌素、Acremonidin E和擬青霉酰胺等具有廣譜抗真菌和細(xì)菌活性的化合物，能夠明顯抑制立枯絲核菌Rhizoctonia solani、水稻惡苗病菌Fusarium moniliforme和辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici等病原菌的生長及產(chǎn)孢[10-13]。此外，代謝物中還有一些組分能夠促進(jìn)植物生長，提高植株苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶和過氧化物酶的活性[14,15]。

淡紫紫孢菌培養(yǎng)過程中產(chǎn)生大量的菌絲和分生孢子，而在特定條件下也可以誘導(dǎo)形成一種抗逆結(jié)構(gòu)—微菌核（Microsclerotia，MS）[16]。微菌核由大量菌絲纏繞特化而成[17,18]，可顯著提高絲狀真菌對(duì)高溫、干旱等不良環(huán)境的耐受力[16,19]，同時(shí)也可以從根本上解決生防真菌貨架期短、穩(wěn)定性差等問題[20,21]。目前，一些生防真菌已成功培養(yǎng)出微菌核，如金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae、球孢白僵菌Beauveria.bassiana、布氏白僵菌B. brongniartii和哈茨木霉Trichoderma harzianum[22-24]，但微菌核培養(yǎng)過程中濾液的生防活性及其相關(guān)的活性物質(zhì)尚不明確。

淡紫紫孢菌 YES-2-14是本實(shí)驗(yàn)室分離到的一株生防菌，對(duì)根結(jié)線蟲病具有較好的防治效果[25,26]。前期研究發(fā)現(xiàn)，YES-2-14微菌核發(fā)酵的pH曲線顯著低于分生孢子發(fā)酵液，推測在此過程中可能激活了不同的代謝途徑，生成不同的代謝產(chǎn)物。本研究通過室內(nèi)生測和溫室盆栽試驗(yàn)，測定淡紫紫孢菌微菌核培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)物的生防活性，同時(shí)基于 LC-MS構(gòu)建代謝組，分析代謝組分的變化，以期為揭示淡紫紫孢菌生防機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為微菌核制劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

淡紫紫孢菌YES-2-14，分離自云南煙草根結(jié)線蟲；立枯絲核菌Rhizoctonia solani和核盤菌Sclerotinia sclerotiorum，分離自黑龍江省大豆病株；大麗輪枝菌Verticillium dahlia，分離自新疆棉花黃萎病病株。以上菌株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所土傳病害生防實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。

分生孢子培養(yǎng)基：玉米粉8 g、蔗糖20 g、酵母浸粉15 g、K2HPO4·3H2O 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 1 g、無水CaCl22 g，加蒸餾水至1 L。121 ℃滅菌25 min。

微菌核培養(yǎng)基：蔗糖40 g，酵母浸粉15 g，KH2PO44 g，MgSO40.6 g，CaCl20.8 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 15 mg，MnSO415 mg，蒸餾水 1 L，調(diào)節(jié) pH 5.5。121 ℃滅菌 25 min。

黃瓜：中農(nóng)6號(hào)，購買于北京市海淀區(qū)中蔬種業(yè)公司。

1.2 淡紫紫孢菌微菌核與分生孢子發(fā)酵濾液的制備

將淡紫紫孢菌YES-2-14接種于PDA平板上培養(yǎng)7 d，加入10 mL 0.05%的吐溫80溶液洗脫孢子，制備孢子懸浮液（濃度為3×108孢子/mL）。吸取2 mL分別接種于微菌核培養(yǎng)基和分生孢子培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，微菌核培養(yǎng)120 h，分生孢子培養(yǎng)72 h。將發(fā)酵液5000 r/min離心15 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜去除菌體，制備微菌核發(fā)酵濾液和分生孢子發(fā)酵濾液。

1.3 根結(jié)線蟲二齡幼蟲的制備

采集根結(jié)線蟲病株，自來水沖洗去除土塊，用解剖針挑取卵囊，放入0.5% NaClO溶液中，攪拌使線蟲卵全部釋放。將線蟲懸液依次通過滅菌的200目和500目篩網(wǎng)，無菌水反復(fù)沖洗，收集500目篩網(wǎng)上的線蟲卵，置于支起的無菌濾紙上，培養(yǎng)皿中加水保濕，25 ℃孵化3 d。收集二齡幼蟲（J2），制備200 J2/mL懸浮液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)根結(jié)線蟲二齡幼蟲的作用

12孔組織培養(yǎng)板中加入1 mL線蟲幼蟲懸液，然后分別加入等體積的淡紫紫孢菌微菌核和分生孢子發(fā)酵濾液及5倍稀釋液，輕輕晃動(dòng)混合，25 ℃培養(yǎng)2 d，倒置顯微鏡（CK2，Olympus，日本）下記錄存活和死亡的線蟲數(shù)量，計(jì)算校正死亡率?；钴S、彎曲蠕動(dòng)的幼蟲為活線蟲，蟲體僵直且加入NaOH溶液刺激后仍然不動(dòng)的為死線蟲。以無菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.5 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)植物病原真菌的抑制作用

將PDA培養(yǎng)基冷卻至50 ℃，分別加入微菌核濾液和孢子濾液（4:1，v/v），充分混勻，倒板。將立枯絲核菌、核盤菌和大麗輪枝菌在PDA平板上培養(yǎng)7 d，用打孔器打取直徑為0.5 cm的菌餅，接種于含有發(fā)酵濾液的平板中央，28 ℃培養(yǎng)。7 d后刮取菌絲，烘干至恒重，測量生物量。核盤菌培養(yǎng)15 d后，觀察菌核數(shù)量的變化。以添加無菌水的培養(yǎng)基為對(duì)照。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.6 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜幼苗生長的影響

選取飽滿且大小一致的黃瓜種子，1% NaClO溶液消毒3 min，自來水沖洗。在培養(yǎng)皿中放置直徑9 cm的滅菌濾紙，分別加入4 mL稀釋10倍的微菌核濾液和孢子濾液，然后均勻擺放15粒黃瓜種子，26 ℃培養(yǎng)，并適時(shí)補(bǔ)充無菌水。種子發(fā)芽后3 d測定根長、莖長和幼苗鮮重。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.7 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液防治黃瓜根結(jié)線蟲病溫室試驗(yàn)

從河北廊坊試驗(yàn)基地根結(jié)線蟲發(fā)病嚴(yán)重的地塊取土，充分混合均勻，密度梯度離心法測定線蟲含量為56條/100 g土。將病土分裝到直徑為12 cm的花盆中，600 g/盆。

將黃瓜種子用1%的NaClO消毒3 min，無菌水沖洗3次，28 ℃催芽至露白，播種于病土中，每盆2株，出苗后保留1株。待長出2～3片真葉后，分別加入10 mL微菌核濾液和孢子濾液。每個(gè)處理10株苗，隨機(jī)排列。溫室溫度控制在22 ℃～28 ℃，常規(guī)方式管理。45 d后，統(tǒng)計(jì)株高、莖粗、根長和病情指數(shù)，計(jì)算防效。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

采用5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查黃瓜根部線蟲發(fā)病情況。0級(jí)：根系健康，無根結(jié)；1級(jí)：根結(jié)長度為根系總長度的1%～15%；2級(jí)：根結(jié)長度為根系總長度的16%～25%；3級(jí)：根結(jié)長度為根系總長度的26%～50%；4級(jí)：根結(jié)長度為根系總長度的51%～75%；5級(jí)：根結(jié)長度達(dá)到75%以上。

1.8 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析

1.8.1 微菌核發(fā)酵濾液的制備 將淡紫紫孢菌YES-2-14接種于PDA平板上培養(yǎng)至產(chǎn)孢，0.05%的吐溫80洗脫孢子，制備孢子懸浮液，接種于產(chǎn)微菌核培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。分別于0、72、120 h取樣，獲得微菌核發(fā)酵液。將上述發(fā)酵液4 ℃、5000 r/min離心15 min，取上清液，過0.22 μm孔徑濾膜去除菌體，制備MS 0 h、MS 72 h、MS 120 h發(fā)酵濾液，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.8.2 樣品預(yù)處理 參照Dunn等[27]方法對(duì)發(fā)酵濾液進(jìn)行預(yù)處理。分別取1.5 mL MS 0 h、MS 72 h、MS 120 h發(fā)酵濾液至2 mL離心管中，真空濃縮至無液體，加入500 μL甲醇（-20 ℃）復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，4 ℃、12000 r/min離心10 min，取上清液至2 mL離心管中，真空濃縮至盡干。加入150 μL 80%甲醇配置的2-氯苯丙氨酸溶液（4 mg/L）（-20 ℃保存）復(fù)溶樣品，過0.22 μm濾膜后加入到檢測瓶中進(jìn)行LC-MS檢測。

1.8.3 LC-MS檢測 參照Zelena等[28]方法，對(duì)發(fā)酵濾液進(jìn)行LC-MS分析。自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為8 ℃，柱溫為40 ℃，流速為0.25 mL/min。正離子模式流動(dòng)相采用0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸，甲酸乙腈的洗脫梯度為：0～1 min，2%；1～9 min，2%～50%；9～12 min，50%～98%；12～13.5 min，98%；13.5～14 min，98%降至2%；14～20 min，2%。負(fù)離子模式流動(dòng)相為乙腈和5 mM甲酸銨溶液，乙腈的洗脫梯度程序同上述甲酸乙腈溶液。質(zhì)譜檢測毛細(xì)管溫度325 ℃，離子掃描范圍m/z 81～1000，二級(jí)分辨率為17500[29]。

1.8.4 數(shù)據(jù)處理 采用R XCMS軟件包進(jìn)行峰檢測、峰過濾、峰對(duì)齊處理[30]，采用MassBank等數(shù)據(jù)庫對(duì)發(fā)酵液中檢測到的物質(zhì)進(jìn)行鑒定[31]。采用R Ropls軟件包對(duì)鑒定到的物質(zhì)進(jìn)行PCA、OPLS-DA分析[32]。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算P值和VIP值（變量投影重要度）篩選微菌核形成過程中的差異代謝物，篩選條件為P＜0.05，且VIP＞1。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用IBM SPSS Statistics 23和Excel 2019對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素ANOVA檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，Duncan新復(fù)極差法比較差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 淡紫紫孢菌微菌核濾液對(duì)根結(jié)線蟲二齡幼蟲的觸殺作用

微菌核發(fā)酵濾液對(duì)根結(jié)線蟲二齡幼蟲具有強(qiáng)烈的抑殺作用（圖1），稀釋2倍時(shí)殺線活性為93.1%；稀釋10倍后，線蟲校正死亡率可達(dá)到50%以上，顯著高于分生孢子濾液（P＜0.05）。

圖1 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)根結(jié)線蟲二齡幼蟲的致死作用Fig. 1 Effect of P. lilacinum MS fermentation filtrate on the second-stage juveniles of root knot nematode

2.2 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液的抑菌活性

淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)多種植物病原真菌均具有明顯的抑制作用（P＜0.05），處理后大麗輪枝菌菌絲稀疏，生長減慢，生物量減少62.6%。微菌核濾液對(duì)立枯絲核菌和核盤菌的抑制率分別為53.5%和70.5%，并可有效抑制菌核的形成。其抑菌活性與孢子濾液存在一定差異，對(duì)核盤菌的抑制率比孢子濾液提高1.3倍，但孢子濾液對(duì)立枯絲核菌的拮抗作用顯著高于微菌核濾液（圖2）。

圖2 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)3種植物病原真菌的抑制作用Fig. 2 Inhibition of MS fermentation filtrate of P. lilacinum to three plant fungal pathogens

2.3 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜幼苗生長的影響

微菌核發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜幼苗具有明顯的促生作用（P＜0.05）。采用10倍稀釋液處理種子，幼苗根長和莖長分別增加了16.8%和21.3%，苗重增加13.0%，作用效果與孢子濾液一致（表1）。

表1 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜幼苗生長的影響Table 1 Effects of P. lilacinum MS fermentation filtrates on growth of cucumber seedlings

2.4 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液防治根結(jié)線蟲病溫室試驗(yàn)效果

微菌核發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲病具有較好的防治效果（圖3）。當(dāng)用量為10 mL/株時(shí)，防效達(dá)到44.9%，并且濾液可以明顯促進(jìn)黃瓜生長（P＜0.05），株高和莖粗比對(duì)照分別增加了21.6%和38.4%。與分生孢子發(fā)酵濾液相比，微菌核濾液處理后黃瓜莖粗提高24.4%（表2）。

圖3 淡紫紫孢菌發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜生長及根結(jié)線蟲的作用Fig. 3 Effects of P. lilacinum fermentation filtrates on plant growth and control efficacy on root-knot nematode in cucumber

表2 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜生長的影響及對(duì)根結(jié)線蟲病的防治效果Table 2 Effect of P. lilacinum MS fermentation filtrate on plant growth and its control efficacy on root-knot nematode in cucumber

2.5 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析

2.5.1 主成分分析（PCA） PCA得分圖顯示，淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液在不同階段（0、72、120 h）的平行樣本基本聚集在一起。第一主成分PC1和第二主成分PC2累計(jì)貢獻(xiàn)率75.1%，表明微菌核發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物具有明顯差異，且所有檢測分析穩(wěn)定性和試驗(yàn)重現(xiàn)性良好（圖4A），該模型可用于代謝物組分分析。

圖4 淡紫紫孢菌微菌核濾液PCA和OPLS-DA得分圖及OPLS-DA置換檢驗(yàn)圖Fig 4 PCA and OPLS-DA score plots and OPLS-DA permutation test chart of MS fermentation filtrate of P. lilacinum

2.5.2 正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA） 將不同發(fā)酵時(shí)間濾液中的化合物進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到OPLS-DA得分圖（圖4B，C）。圖中不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵濾液中代謝產(chǎn)物明顯分離，且全部樣品組都位于置信區(qū)間內(nèi)，表明各組間存在顯著差異。計(jì)算得到參數(shù) R2Y＝0.999、Q2＝0.992，截距 Q2回歸線的截距為-0.11＜0，說明模型穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。

2.5.3 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵代謝產(chǎn)物種類及含量分析 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液中共鑒定出588種化合物，其中氨基酸、肽和類似物（71種），醇和多元醇（50種），碳水化合物和碳水化合物結(jié)合物（39種），胺類（28種）和脂肪酸類（28種）。發(fā)酵過程中一些與生命活動(dòng)密切相關(guān)的物質(zhì)，如氨基酸、肽、碳水化合物、嘌呤和嘧啶等含量無明顯變化。隨著微菌核的大量形成（72～120 h），羰基化合物、胺類、醛類等物質(zhì)含量顯著下降；而一些代謝活性物質(zhì)，如醇及多元醇、酚類、吡啶羧酸及其衍生物、苯甲酸及其衍生物、二羧酸及其衍生物、咪唑類含量均顯著增加。此外，脂肪酸類物質(zhì)在72 h時(shí)含量顯著高于0和120 h，推測菌株培養(yǎng)后期隨著培養(yǎng)基中蔗糖、酵母浸粉等營養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗，淡紫紫孢菌有可能利用前期代謝產(chǎn)生的脂肪酸類物質(zhì)（表3）。

表3 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液中代謝產(chǎn)物種類及含量Table 3 Types and contents of metabolites in MS fermentation filtrate of P. lilacinum

2.5.4 淡紫紫孢菌微菌核形成過程中差異代謝物及相對(duì)含量分析 對(duì)不同取樣點(diǎn)（0、72、120 h）代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選（P＜0.05，且VIP＞1），共得到216種差異代謝物。其中，116種化合物在微菌核形成過程中含量顯著增加，主要為醇類（16種）、碳水化合物類（9種）、脂肪酸類（8種）等；另有100種含量顯著下降，以氨基酸類（14種）、嘌呤類物質(zhì)（7種）、胺類物質(zhì)（5種）為主；也有一些化合物前期含量明顯增加，隨后呈下降趨勢（圖5）。對(duì)其中含量增加的組分分析，得到芥酸、高香草酸、胡椒酚和泛酸等具有抑菌活性以及胍基丙酸、丁酸和咪唑乙酸等具有殺線蟲活性的化合物（表4）。

圖5 淡紫紫孢菌微菌核形成過程中差異代謝物聚類熱圖Fig. 5 Heat diagram of differential metabolites secreted during P. lilacinum microsclerotia production

表4 淡紫紫孢菌微菌核濾液中差異代謝物質(zhì)及相對(duì)含量Table 4 Relative contents of differential metabolites in conidia and MS fermentation filtrate of P. lilacinum

3 討論

培養(yǎng)條件對(duì)生防真菌發(fā)酵產(chǎn)物的積累及其活性具有重要影響。營養(yǎng)和環(huán)境的改變直接影響生防微生物的生長繁殖與代謝，進(jìn)而影響其生防作用[33-35]。我們發(fā)現(xiàn)，通過環(huán)境脅迫和營養(yǎng)的改變，淡紫紫孢菌從菌絲和孢子發(fā)酵轉(zhuǎn)換為微菌核的大量生成，這期間發(fā)酵液pH曲線隨之發(fā)生改變，推測對(duì)微菌核的誘導(dǎo)可能激活了不同的代謝途徑，從而引起發(fā)酵和代謝產(chǎn)物，以及生防作用發(fā)生變化。本試驗(yàn)中，淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液同孢子濾液都表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺線蟲、抑菌和促生活性，但對(duì)不同病原菌的抑制作用存在較大差異，微菌核濾液對(duì)核盤菌菌絲生長和菌核形成的抑制作用明顯強(qiáng)于孢子濾液，但對(duì)立枯絲核菌的抑制作用則相對(duì)較差（P＜0.05）。此外，稀釋10倍的微菌核濾液對(duì)根結(jié)線蟲二齡幼蟲的致死率顯著高于孢子濾液，推測淡紫紫孢菌在形成微菌核過程中，產(chǎn)生了更多的具有殺線蟲活性的代謝物。

目前已報(bào)導(dǎo)的殺線蟲真菌活性代謝物主要有生物堿類、萜類、醌類、大環(huán)內(nèi)酯類、肽類和萘類等[36]，淡紫紫孢菌發(fā)酵液中含有乙酸、脂肪酸、酚酸、倍半萜和幾丁質(zhì)酶等活性物質(zhì)[8,37,38]。我們從淡紫紫孢菌微菌核培養(yǎng)代謝組中鑒定到的代謝物以羧酸、苯類和酯類化合物為主，包括氨基酸和糖類等與生長和能量代謝相關(guān)的物質(zhì)，以及生物堿和脂肪酸等具有殺線抑菌作用的組分。在分生孢子形成過程中，芳香烴、酯類和雜環(huán)類物質(zhì)種類和相對(duì)含量較多[39]，與淡紫紫孢菌微菌核形成過程中的代謝產(chǎn)物存在一定差異。目前，我們僅通過 LC-MS對(duì)微菌核發(fā)酵代謝物的種類及相對(duì)含量進(jìn)行分析，此外還有一些化合物，如吡啶類、唑類，相對(duì)峰面積較大，但是否具有生防作用仍然未知，接下來可以從中選取含量較高的組分進(jìn)行定量分析，并檢測其活性。

迄今，市場上的淡紫紫孢菌產(chǎn)品均為分生孢子和菌絲制劑，貨架期短，受環(huán)境影響較大，嚴(yán)重限制了其大面積應(yīng)用。微菌核制劑作為一種新型生防真菌產(chǎn)品，具有耐熱性強(qiáng)、抗干燥，貨架期長，作用穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn)。蟲生真菌中，白僵菌、綠僵菌微菌核制劑已成功用于寄主害蟲的防治[40,41]。我們發(fā)現(xiàn)，較低劑量的淡紫紫孢菌微菌核對(duì)根結(jié)線蟲病防效可達(dá)到50%以上（未發(fā)表），同時(shí)，微菌核發(fā)酵濾液具有良好的殺線、防病和促生效果。生產(chǎn)中采用硅藻土、高嶺土等載體對(duì)微菌核發(fā)酵液直接進(jìn)行吸附，制備微菌核粉劑或顆粒劑，同時(shí)結(jié)合其他有機(jī)添加物，既可保護(hù)微菌核，又能充分利用發(fā)酵液中的活性代謝物，提高菌劑的生防效果。通過微菌核制劑的研發(fā)可有效解決目前淡紫紫孢菌生產(chǎn)和應(yīng)用中的問題，促進(jìn)此類生防微生物的推廣應(yīng)用。