王嘉豪，洪雨欣，李聰聰，吳波明

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，北京 100193）

由核盤菌Sclerotinia sclerotiorum引起的菌核病可在油菜、向日葵、大豆、胡蘿卜等多種作物上造成嚴重的產(chǎn)量損失[1-5]。解決菌核病防治問題對我國經(jīng)濟作物生產(chǎn)和糧油食品穩(wěn)定供給具有重大意義和經(jīng)濟價值。菌核病的田間侵染源主要是土壤中存活的菌核。在較長時間持續(xù)濕潤條件下，存活的菌核可萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤[6]，釋放數(shù)量巨大的子囊孢子，侵染周邊植株的地上部分，造成常見的頂枯、倒伏等癥狀[7,8]。菌核也可直接萌發(fā)產(chǎn)生菌絲侵染作物的根及地下塊莖等組織，田間菌核數(shù)量高時，菌絲侵染可導(dǎo)致植株在苗期大量猝倒死亡[9]。由于抗菌核病品種培育難度較大，菌核病的防治主要依賴施用藥劑保護植物的易感器官（花），同時減少土壤中存活的菌核數(shù)量。與非寄主植物輪作已經(jīng)被證明可有效減少菌核數(shù)量。例如，稻油輪作早已在我國長江流域廣泛推廣，在油菜菌核病防控中起到了重要作用[10-12]。但是，在水資源缺乏地區(qū)或不適合種植水稻的山地，由于核盤菌的寄主范圍十分廣泛[5]，可用于輪作的作物非常少，而且與旱作物輪作需要間隔多年才能有效地控制菌核病[10-13]，輪作在實際生產(chǎn)中很難推行。在探索輪作替代方案過程中研究者發(fā)現(xiàn)，在實驗室高溫、高濕和低氧條件下核盤菌存活率可在短時間內(nèi)迅速降低[14]，夏季田間淹水2～3周可以顯著減少土壤中存活的菌核數(shù)量，從而減輕菌核病的發(fā)生[15,16]。盡管已知芽胞桿菌[3,17-21]、假單胞桿菌[20]、鏈霉菌[3]、盾殼霉[3,22]、木霉[3,7,21,23]、鐮孢菌[24]、粘帚霉[25]等多種微生物對核盤菌引起的菌核病具有一定生物防治效果，但是，高溫、高濕和低氧條件下土壤中菌核快速死亡的原因和具體機制尚不明確。本研究的目的就是探索高溫、高濕、低氧條件對菌核存活率的影響，分析這一過程中土壤微生物結(jié)構(gòu)的變化，以期為通過調(diào)節(jié)土壤微環(huán)境和微生物組成，在短時間內(nèi)降低土壤存活菌核數(shù)量，從而實現(xiàn)防控作物菌核病目標提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣本及供試菌株

所用土壤包括采集于安徽省黃山市徽州區(qū)油菜田表土（0～10 cm）和池塘淤泥。采集后先自然風(fēng)干，然后粉碎并過 10目篩除去植物殘體等大塊雜質(zhì)。所用菌株采集自江西婺源的油菜菌核病受害植株，經(jīng)分離純化得到核盤菌菌核。在錐形瓶中滅菌馬鈴薯塊上擴大培養(yǎng)4周左右得到大量高質(zhì)量菌核，洗凈風(fēng)干后，選取飽滿、顏色深黑、大小一致且外表無損傷的菌核用于實驗。

1.2 菌核處理

試驗采用多因素隨機區(qū)組設(shè)計，試驗1包括土壤（池塘淤泥和油菜田土）、水分（風(fēng)干和加水10 mL/50 g土）、溫度（15 ℃和35 ℃）、氧氣（正常氧和低氧）和時間（1、2、4周）5個因素， 48個處理；試驗2包括滅菌（滅菌和不滅菌）、水分（加水5、10和15 mL/50 g土）、氧氣（低氧和正常氧）和溫度（15 ℃和25 ℃）4因素，24個處理（時間均為4周）；試驗3包括滅菌（滅菌和不滅菌），水分（風(fēng)干和加水10 mL/50 g土）、溫度（15 ℃、25 ℃和35 ℃）、氧氣（正常氧和低氧）和時間（2、4周）5因素，48個處理。每個處理包含一個直徑90 mm培養(yǎng)皿，其中加入50 g風(fēng)干土壤及50顆挑選好的菌核，盡量將菌核完全用土壤覆蓋。加水處理組用移液槍均勻加入10 mL無菌水，低氧處理將培養(yǎng)皿（不加蓋）放入12 cm×17 cm 的真空袋中，用真空包裝機抽凈袋中空氣并封口。抽真空時間為30 s，封口時間為3 s，真空度約為0.098 MPa。將各處理置于相應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有試驗均重復(fù)3次。

1.3 土壤采樣及菌核萌發(fā)率檢測

分別在處理1（試驗1特有）、2、4周后進行采樣檢測。首先，每個處理收集菌核周圍附著的土壤約10 g，裝入50 mL離心管中，保存于-20 ℃冰箱中用于土壤微生物多樣性分析。然后，在流動自來水下篩洗收集菌核，沖洗菌核表面土壤，再經(jīng)過3%含氯消毒水處理3 min，75%酒精消毒1 min，無菌水漂洗3次后置于超凈臺中風(fēng)干菌核表面水分，隨后將菌核轉(zhuǎn)移至含50 mg/L硫酸鏈霉素的PDA平板上，于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，每天統(tǒng)計菌核萌發(fā)情況。運用SAS軟件（Rev. 9.4，SAS Institute Inc.，Cary，NC USA）對菌核萌發(fā)數(shù)據(jù)進行分析，首先進行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗，因萌發(fā)率（x）數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布和方差齊性要求，數(shù)據(jù)經(jīng)邏輯斯蒂轉(zhuǎn)換（y= ln[（x+0.1）/（1.01-x）]）后，再運用GLM過程進行方差分析。針對效應(yīng)顯著的因子，采用LSD法對不同處理的平均值進行多重比較。

1.4 土壤樣本DNA提取與高通量測序

選取試驗1的16個土壤樣本和試驗2的6個和試驗3的8個樣本作為代表，其中3-2-1與3-2-2、3-4-1和3-4-2、3-10-1和3-10-2、 3-12-1和3-12-2為重復(fù)（表1）。每個樣本混勻后取0.5 g土壤用試劑盒（FastDNA?Spin Kit for Soil，安諾倫（北京MP Biomedicals）生物科技有限公司）提取每個樣本的總DNA。借助NanoDrop 2000檢測DNA的純度和濃度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。對合格DNA首先使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit擴增細菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)（引物為338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和 806R 5′-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3′）以及真菌的 ITS1 區(qū)（引物為 ITS1F 5′-CTTGGTCATTTAG AGGAAGTAA-3′和 ITS2 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），進行 Miseq 文庫構(gòu)建。然后，采用 Illumina Miseq PE300平臺進行測序。測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

表1 試驗1和2中高通量測序樣本編號及處理信息Table 1 Information of samples selected from experiments 1 and 2 for sequencing of bacterial 16S rDNA and fungal ITS region

1.5 測序數(shù)據(jù)分析

對測序獲得的原始數(shù)據(jù)（reads），采用FASTQ軟件移除適配序列、引物序列以及低質(zhì)量序列，利用FLASH軟件對優(yōu)化后成對序列進行拼接，拼接時overlap最小值設(shè)為10 bp，最大配錯率設(shè)為20%[26]。拼接后先利用UPARSE軟件去除嵌合體，得到OTU（Operational Taxonomic Units）代表序列[27,28]；利用RDP classifier平臺的Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫和UNITE數(shù)據(jù)庫分別對細菌16S rDNA和真菌ITS2序列進行分類注釋，其中比對最小閾值設(shè)為 0.7并去除與線粒體和葉綠體序列及無法與數(shù)據(jù)庫匹配的序列；純凈后的OTUs序列利用UPARSE按照97%相似水平進行聚類劃分[29]；然后對16S rDNA和ITS2序列分別進行抽樣分析，評價不同樣本數(shù)的覆蓋率并制作稀釋曲線；分析OTU豐富度（sobs）、Shannon多樣性指數(shù)以及處理對不同真菌和細菌群落相對豐度的影響；最后，對OTUs根據(jù)bray-curtis算法獲得不同樣本的距離矩陣，再對矩陣進行層級聚類，對不同樣本的細菌群落和真菌群落分別進行PCoA分析（principal co-ordinates analysis），并將結(jié)果可視化展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對菌核存活的影響

少部分 15 ℃加水處理組中菌核在實驗過程中萌發(fā)產(chǎn)生白色菌絲，但菌核基本保持完好充實（硬度較高）。與此相對照，高溫加水條件處理一周后，菌核未見萌發(fā)產(chǎn)生菌絲或子囊盤，但其質(zhì)地彈性和硬度降低，黑色表皮剝離露出淡黃色髓質(zhì)，繼續(xù)培養(yǎng)至第4周，部分菌核髓質(zhì)被完全分解，剩下片狀黑色表皮殘骸。方差分析發(fā)現(xiàn)土壤類型以及其與其他因素的互作對菌核存活沒有顯著影響（試驗1結(jié)果未展示），所以后續(xù)分析中不再考慮土壤類型差別，3個試驗的結(jié)果都表明高溫、高濕和低氧可加快菌核死亡。以試驗3結(jié)果為例，滅菌土壤中各處理的菌核萌發(fā)率都高于未滅菌土壤的相應(yīng)處理（滅菌土壤中數(shù)據(jù)未展示），說明土壤中的生物因素可能會影響菌核萌發(fā)率。對未滅菌土壤方差分析發(fā)現(xiàn)，風(fēng)干土壤中，菌核萌發(fā)率顯著高于加水土壤（P＜0.05），不加水處理2周后菌核平均萌發(fā)率為69.08%，而加水各處理菌核平均萌發(fā)率為34.33%；在加水的土壤中，15 ℃處理的菌核萌發(fā)率（平均51.67%）與25 ℃處理（平均42.17%）差異不顯著，但都顯著（P＜0.05）高于 35 ℃處理（0）；因試驗中抽真空后密封未能達到完全厭氧條件，僅實現(xiàn)了低氧，在加水土壤中低氧處理的菌核萌發(fā)率在15 ℃和25 ℃（49.33%和37.67%）都低于正常氧的相應(yīng)值（54%和46.67%），但是差異未達到顯著水平，部分原因可能是在低氧處理中重復(fù)之間波動比較大，低氧處理不穩(wěn)定；在風(fēng)干土壤中，菌核萌發(fā)率在4周內(nèi)基本沒有明顯變化，但在加水土壤中菌核的萌發(fā)率都隨時間推移而顯著（P＜0.05）下降，在高溫條件下，這種下降速度更快；高溫和水分之間的互作顯著（P＜0.05），高溫有水低氧組合菌核萌發(fā)率下降最快，2周內(nèi)下降到 0%（圖1，第 4周數(shù)據(jù)未展示）。

圖1 不同條件下處理2周后不滅菌田間土壤中核盤菌菌核萌發(fā)率Fig. 1 Germination rate of S. sclerotiorum sclerotia after treatments under different conditions for 2 weeks in unautoclaved soil collected from rapeseed fields

2.2 測序結(jié)果及OTUs聚類分析

本研究3個試驗得到的結(jié)果類似，重復(fù)測序的結(jié)果高度一致（2和3的結(jié)果未展示）。以試驗1中16個樣本結(jié)果為例，經(jīng)對測序所得的reads進行質(zhì)控過濾，獲得有效的細菌16S rDNA序列堿基總數(shù)目為554704446 bp，序列平均長度為415 bp。有效的真菌ITS2序列總堿基數(shù)為348636327 bp，序列平均長度為239 bp。有效序列按97%相似水平聚類到6299個OTUs中。OTUs抽樣分析得到的稀釋曲線圖（圖2）表明，隨著樣本數(shù)量增加sobs指數(shù)開始時快速上升，但隨后其上升速度隨著抽樣數(shù)量增加逐漸趨緩，并最終形成平臺。這說明對樣本微生物群落的檢測比率接近飽和，本研究的測序量足夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。結(jié)果也顯示，淤泥樣本中細菌和真菌OUT數(shù)目都低于油菜土。

圖2 油菜土和淤泥樣品的細菌稀釋曲線和真菌稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves of for bacteria and fungi in soils from rapeseed fields and a pond

細菌16S rDNA序列的多樣性分析結(jié)果（表2）顯示，第1周和第4周相比，正常氧氣水平處理組的香農(nóng)指數(shù)在15 ℃（5.63，4.38）和35 ℃（4.39，4.71）均有差異，但差異都不顯著；而低氧處理的香農(nóng)指數(shù)在15 ℃（3.17，4.47）和35 ℃（3.37，4.37）都顯著升高（表2，t-檢驗箱線圖未展示）。類似地，試驗2樣本測序結(jié)果也顯示土壤含水量上升可增加細菌香農(nóng)指數(shù)（數(shù)據(jù)未顯示）。綜合兩個試驗的結(jié)果表明，高溫、低氧（含水）處理可增加土壤細菌多樣性。

表2 不同處理油菜田土壤樣本中細菌和真菌多樣性（Shannon）指數(shù)Table 2 Bacterial and fungal alpha diversity index in moist soil samples after different treatments

真菌ITS2序列多樣性分析顯示，試驗1中高溫低氧條件下油菜土真菌群落的香農(nóng)指數(shù)從第1周（4.20）到第 4周明顯下降（1.49），其他處理的香農(nóng)指數(shù)從第1到第4周變化不大（表2）。類似地淤泥樣本中，高溫和低氧處理中細菌多樣性上升，但是真菌的多樣性沒有規(guī)律（表2）。試驗 2結(jié)果也表明，加水土壤培育4周后25 ℃條件下的真菌香農(nóng)指數(shù)低于 15 ℃（結(jié)果未顯示）。綜合兩個試驗結(jié)果表明，高溫、低氧條件可降低土壤中真菌的多樣性。

OTU聚類結(jié)果表明，低氧和正常氧處理的細菌群落分在2個不同類群中（圖3A，試驗2結(jié)果相似未顯示）。PCoA分析顯示，低氧和正常氧處理的細菌群落在第一維度上各自聚在一起，但第二維度上高溫低氧的池塘淤泥細菌群落與其他低氧處理距離則較遠（圖4A）。

圖3 基于OTUs序列的土壤樣本（A-細菌, B-真菌）聚類分析結(jié)果Fig. 3 Cluster analysis based on OTUs sequences of soil bacteria (A) and fungi (B)

圖4 基于OTUs序列的土壤樣本本（A-細菌, B-真菌）PCoA分析結(jié)果Fig. 4 PCoA analysis based on OTUs sequences of bacteria (A) and fungi (B) in the rapeseed field and pond soil

真菌群落的聚類結(jié)果沒有明顯規(guī)律。4個高溫正常氧樣本（AB1和AB1-1、AB4和AB4-1）內(nèi)部差別較小，但與其他樣本差別較大，單獨構(gòu)成了一個分支（圖3B）。PCoA分析顯示，這4個樣本距離很近，AA4-1和AA4，BB1和BA4, BA1-1、BB4、BB4-1、BB1-1和BA4-1距離非常近，其他樣品則更加分散（圖4B）。

2.3 不同微生物群落的相對豐度

土壤OTUs共檢出18個門，包括細菌12個門、真菌6個門和一些未能分類的真菌。正常氧和低氧處理的細菌組成在門水平明顯不同（圖5）。低氧的4個處理中，厚壁菌門Firmicutes以71.81%-88.19 %的相對豐度都占據(jù)絕對優(yōu)勢；而在正常氧組中放線菌門（Actinobacteriota，22.87%～53.42%）和變形菌門Proteobacteria（21.95%～36.50%）豐度最高，正常氧15 ℃處理中擬桿菌門Bacteroidota也占有相對比重（圖5）。油菜圖樣本和池塘淤泥樣本間這些主要門所占比重雖有差別，但總體趨勢相似（圖5）。

圖5 不同處理土壤樣本中細菌物種（A-油菜土，B-池塘淤泥）門水平分布柱狀圖Fig. 5 Relative abundances of bacterial phylum categories in soil samples from rapeseed fields (A) and a pond (B)

在屬水平，土壤樣本中共檢出68個屬的細菌，其中狹義梭菌（Clostridiumsensu-stricto 1，10，11，12）是低氧處理下特有的屬且占據(jù)較高豐度（圖6）；而 35 ℃正常氧處理 4周的樣本中放線菌Streptomyces豐度（27.13%）明顯高于其他樣本（圖6）。而淤泥樣本中放線菌Streptomyces豐度在35 ℃正常氧處理中（7.12%～7,85%）也高于其他處理（0.1%～4.40%），但是因為總體占比較低并未排進前9大屬（數(shù)據(jù)未展示）。

圖6 不同處理土壤樣本細菌物種（A-油菜土，B-池塘淤泥）屬水平分布柱狀圖Fig. 6 Relative abundances of bacterial genera in soil samples in soil samples from rapeseed fields (A) and a pond (B)

在門水平，真菌中子囊菌門Ascomycota在所有樣本中均有分布，且其相對豐度（57.27%～99.92%）在油菜土和池塘淤泥各處理樣本中均占據(jù)絕對優(yōu)勢（圖7）。需要注意的是，在池塘土（最高26.95%）中檢出比油菜土中（最高15.04%）更多的無法分類真菌（unclassified fungi，圖7B）。在屬水平，各處理組共檢出37個真菌屬。其中相對豐度最高的屬是籃狀菌屬Talaromyces，在高溫正常氧氣處理樣品中相對豐度占比達到了62.18%～77.83%（圖8）；木霉屬Trichoderma在正常氧15 ℃處理4周的油菜土（54.23%）和池塘土（91.17%）樣本中相對豐度明顯高于其他樣本（圖8）。值得注意的是低氧35 ℃下培養(yǎng)4周后核盤菌屬Sclerotinia在油菜土中的相對豐度高達72.80%，顯示此時已有大量菌核組織分解散布到土壤樣本中（圖8A），但比重在同樣處理的池塘土中要低得多（圖8B）。

圖7 不同處理土壤樣本真菌物種（A-油菜土，B-池塘淤泥）門水平分布柱狀圖Fig. 7 Relative abundances of fungal phylum categories in soil samples from rapeseed fields (A) and a pond (B)

圖8 不同處理土壤樣本真菌物種（A-油菜土，B-池塘淤泥）屬水平分布柱狀圖Fig. 8 Relative abundances of fungal genera in soil samples from rapeseed fields (A) and a pond (B)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)高溫、高濕和低氧水平，任一單因素處理均能夠顯著影響核盤菌菌核的萌發(fā)率，而在3個因素共同作用下，35 ℃低氧高濕條件下處理4周可造成菌核完全喪失活性。這一結(jié)果與汪國森等[30]得到的升高溫度可以加快菌核死亡和Wu等[14]得到的低氧加速菌核死亡的研究結(jié)果相符合。水分是微生物活性所需，核盤菌菌核的兩種萌發(fā)方式都需要一定的土壤濕度（低于飽和濕度）[14,31]。然而，這一結(jié)果表明如果高濕（飽和濕度常常伴隨低氧）和高溫條件配合，則核盤菌菌核不僅不能萌發(fā)產(chǎn)生菌絲或者子囊盤，其存活率還迅速下降。這個發(fā)現(xiàn)也解釋了前人利用夏天水淹（高溫、高濕、低氧）防治菌核病取得較好結(jié)果的原因[15,16]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，兩茬作物之間往往只有相對較短的休耕期，不足以種植一茬輪作作物。本研究的結(jié)果表明，利用這一間隔期創(chuàng)造高溫、高濕和低氧條件可以在短時間內(nèi)殺死土壤中的核盤菌菌核，從而實現(xiàn)防控菌核病的目標，尤其是如果這一間隔期發(fā)生在日光資源豐富的夏天時，高溫條件更是為此提供了便利。

為探索高溫、高濕、低氧條件下菌核快速死亡的原因，本研究通過對土壤中細菌16SrDNA和真菌ITS測序，分析了不同處理對細菌和真菌種群組成和豐度的影響。此前鏈霉菌屬和木霉屬在菌核病的生物防治中受到廣泛關(guān)注，鏈霉菌屬廣泛存在于土壤中，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對包括核盤菌在內(nèi)的多種植物病原真菌表現(xiàn)出很強的抗真菌活性[32]，木霉屬具有較強的幾丁質(zhì)分解能力，可寄生核盤菌菌絲和菌核促進菌核死亡[33]。但本研究結(jié)果表明，鏈霉菌和木霉菌都只適合有氧環(huán)境，在低氧條件下他們的豐度都大幅降低。這就基本確定不是高溫、高濕、低氧條件下核盤菌菌核快速死亡的直接原因。本研究明確了高溫低氧高濕處理使得細菌多樣性水平上升，更具體地，高溫低氧（高濕）處理可顯著提高狹義梭菌的相對豐度，這類細菌幾乎只在低氧處理土壤中才檢測到，而且不同來源土壤中的結(jié)果相同，這暗指這類細菌在自然界中非常普遍。核盤菌菌核的快速死亡是否與這一類細菌相關(guān)，以及如何利用它們更好地防控菌核病還有待進一步研究明確。除此之外，我們在高溫低氧處理油菜土樣本中還檢測到大量的核盤菌 DNA，這表明要么菌核在此條件下萌發(fā)產(chǎn)生了菌絲（因試驗中未觀察到白色絲狀物，所以基本可以否定這一可能），要么菌核結(jié)構(gòu)崩潰（自身或者其他微生物造成），菌核殘渣散落到了周圍土壤中。因此，后續(xù)研究也有必要進一步明確高溫、低氧（高濕）處理對核盤菌菌核本身生理生化過程的影響。

綜上所述，本研究明確了高溫高濕低氧處理可以在短時間內(nèi)殺死核盤菌菌核，初步明確了高溫、高濕、低氧條件下狹義梭菌相對豐度上升最為明顯，這為進一步明確其機制更好地利用這一現(xiàn)象防控作物菌核病打下了基礎(chǔ)。