王 翠，王 妍，戴蓬博，梁曉飛，張 榮，孫廣宇*

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院，楊凌 712100；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，保定 071000）

隨著我國農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展，作物病害對產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的不良影響日益凸顯[1]。解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens是具有促生、保鮮等作用的有益微生物[2,3]，具有高效廣譜的抑菌活性，因而受到人們越來越多的關(guān)注，一些優(yōu)良菌株被作為生物農(nóng)藥及生物肥料開發(fā)利用[4]。王奕文等[5]從甜瓜果實表面分離到解淀粉芽胞桿菌，對灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、鏈格孢等病原真菌生長具有顯著的抑制作用。彭研[6]從300株芽胞桿菌中篩選出NCPSJ7，該菌對西瓜枯萎病菌與桃根霉病菌有拮抗作用。大量的研究證明解淀粉芽胞桿菌抑菌活性主要是產(chǎn)生抗菌蛋白、脂肽類、聚酮類化合物等抗菌物質(zhì)，如張迎等[7]從番茄根際分離出解淀粉芽胞桿菌W10，其分泌的抗菌蛋白可以有效控制番茄灰霉病和桃褐腐病發(fā)生；郭繼平等[8]研究顯示解淀粉芽胞桿菌N22發(fā)酵液中的蛋白成分可以有效控制葡萄霜霉病。Chen等[9]和Koumoutsi等[10]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌 FZB42 產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)可抑制病原真菌的生長，產(chǎn)生的聚酮化合物對由歐文氏菌Erwinia amylovora引起的梨火疫病具有防治效果；桑建偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌BEB17產(chǎn)生的脂肽類和聚酮類化合物通過破壞香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporumf. sp.cubenserace 4細胞膜起生防作用；Abdallah等[12]證明解淀粉芽胞桿菌 32a通過產(chǎn)生脂肽類抑制根癌土壤桿菌的生長達到防治番茄冠癭病的目的。除此之外，Tan等[13]發(fā)現(xiàn)T5可以刺激番茄根際分泌有機酸，而有機酸募集更多有抑制枯萎病活性的生防菌。Siahmoshteh等[14]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌可以降解黃曲霉毒素。因此，解淀粉芽胞桿菌在植物病害防治中具有重要的應(yīng)用潛力。

研究高效、低成本的生產(chǎn)工藝是實現(xiàn)生防菌應(yīng)用的前提[15,16]。信珊珊等[17]對解淀粉芽胞桿菌WH1發(fā)酵條件優(yōu)化后，其抗菌脂肽的含量大幅上升，對油茶炭疽菌的防效顯著提高。洪鵬等[18]對解淀粉芽胞桿菌HF01發(fā)酵條件優(yōu)化后，抑菌能力提高 37.3%。劉京蘭等[19]研究表明優(yōu)化后抗菌脂肽的產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了4倍。這些研究表明，解淀粉芽胞桿菌的數(shù)量、代謝物成分等與培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件有關(guān)。解淀粉芽胞桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化主要包括正交法、單因素篩選、響應(yīng)面法、中心設(shè)計法、均勻設(shè)計發(fā)法等[20,21]。本研究室前期在蘋果心室內(nèi)分離并篩選出一株生防細菌解淀粉芽胞桿菌DP03-4，該菌株在室內(nèi)對蘋果腐爛病菌、霉心病原菌等多種蘋果病原表現(xiàn)顯著拮抗作用（未發(fā)表）。本文報道其優(yōu)化后的培養(yǎng)和發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciensDP03-4，粉紅聚端孢Trichothecium roseum均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院真菌實驗室分離鑒定保存。

試劑：葡萄糖、蔗糖、氯化銨、硝酸鉀、碳酸鈣、氯化鈉、磷酸氫鉀等試劑為國產(chǎn)分析純，麥芽糖、乳糖、淀粉、糊精、甘露醇、果糖、胰蛋白、酵母浸膏、蛋白胨、酪蛋白等為國產(chǎn)化學(xué)純試劑。

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂粉15 g；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，自來水1000 mL。

1.2 試驗方法

菌株活化及種子液制備：將保存的DP03-4菌株在LB平板上劃線培養(yǎng)后，用牙簽蘸取適量菌體接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，于28 ℃、180 r/min 的搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)24 h。

解淀粉芽胞桿菌DP03-4生長曲線測定：將1% DP03-4種子液接種于LB培養(yǎng)液中，每隔2 h用紫外分光光度計測量菌體培養(yǎng)液的OD600值，待菌體生長量平穩(wěn)無明顯變化時停止測量，重復(fù)3次，制作DP03-4的生長曲線[21]。

抑菌活性測定：取200 μL濃度為1×106分生孢子/mL的粉紅聚端孢孢子懸浮液涂布PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)6 h后，每皿中央各放置一個牛津杯，加入20 μL DP03-4發(fā)酵液，培養(yǎng)48 h后，測量抑菌圈直徑。

最適培養(yǎng)基碳源、氮源和無機鹽篩選：以酵母浸粉（氮源）10 g，氯化鈉（無機鹽）5 g，去離子水1000 mL的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)成分，后分別添加10 g葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精、甘露醇、果糖等不同碳源，制成不同碳源培養(yǎng)基；以最適碳源10 g，氯化鈉（無機鹽）5 g，蒸餾水1000 mL，分別添加10 g牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨、酸水解酪蛋白、胰蛋白、氯化銨、硝酸鉀等制成不同氮源培養(yǎng)液；碳源、氮源確定后，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基里分別添加5 g碳酸鈣、氯化鈉、磷酸氫鉀、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂等制成無機鹽培養(yǎng)基。確定不同培養(yǎng)基組分的最適添加量范圍后，對碳源、氮源和無機鹽等進行三因素三水平的正交試驗[16]。正交試驗的培養(yǎng)條件為接種量1%，溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，裝液量100 mL/250 mL，培養(yǎng)時間20 h。

培養(yǎng)條件篩選：以接種量、初始 pH、裝液量、溫度、轉(zhuǎn)速等單因素為變量，固定其他因素，分別確定單因素最適條件。各因素水平設(shè)置如表1[22]。

表1 發(fā)酵條件單因素水平實驗Table 1 Single factor experimental design of fermentation conditions

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel、SPSS26軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Origin進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽胞桿菌DP03-4生長曲線的測定

將保存的DP03-4菌株在LB平板培養(yǎng)活化，用牙簽蘸取適量菌體接種于LB液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，將1% DP03-4培養(yǎng)液接種于LB培養(yǎng)液中，間隔2 h測量菌體生長量的OD值，制作生長曲線。結(jié)果顯示，在接種后0～4 h 內(nèi)細菌生長緩慢，4 h后細菌數(shù)量開始增加；6 h后進入快速增長階段，到達16 h后增長速度減慢，18 h后趨于平穩(wěn)，21 h后菌體開始減退（圖1）。上述結(jié)果表明，8～12 h為解淀粉芽胞桿菌DP03-4的對數(shù)生長期，適合做種子液，本研究選取10 h的發(fā)酵液為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液。

圖1 解淀粉芽胞桿菌DP03-4在LB培養(yǎng)基中的生長曲線Fig. 1 Growth curve of Bacillus amyloliquefaciens DP03-4 in LB medium

2.2 解淀粉芽胞桿菌DP03-4發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 解淀粉芽胞桿菌 DP03-4發(fā)酵培養(yǎng)基篩選分別在氮源、無機鹽固定、碳源不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)DP03-4，通過菌體生長量和發(fā)酵液對粉紅聚端孢的抑菌效果篩選最適碳源。結(jié)果顯示，不同碳源對菌株生長及對粉紅聚端孢抑菌效果均不同，其中以葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)液中菌體生長量最多，OD600值為 2.27。麥芽糖對應(yīng)的 OD600值與葡萄糖無顯著差異，但發(fā)酵液的抑菌效果較葡萄糖弱，其他碳源包括蔗糖、淀粉、果糖、乳糖、糊精和甘露醇等所對應(yīng)的 OD600值與抑菌活性均小于葡萄糖（圖2），因此選擇葡萄糖作為最適碳源。

圖2 不同碳源對DP03-4發(fā)酵的影響及發(fā)酵液抑菌活性測定Fig. 2 Effects of different carbon sources on the fermentation of DP03-4 and inhibitory activities of fermentation solution

分別在葡萄糖含量分別為 0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株DP03-4結(jié)果顯示，菌體的生長量在0.5%葡萄糖時OD600值達到最大值3.43，后隨葡萄糖含量的增加而逐漸降低，抑菌活性在葡萄糖含量為1.0%時最高，對應(yīng)的抑菌圈直徑60.1 mm（結(jié)果未顯示）。因此，選取葡萄糖水平為0.5%、1.0%、1.5 %進行正交試驗。

在碳源、無機鹽固定，氮源不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)DP03-4篩選最適氮源結(jié)果顯示，在酵母浸粉作為氮源的培養(yǎng)液中菌體生長量最多，OD600為2.84；牛肉膏和酪蛋白對應(yīng)的OD600值與酵母浸粉無顯著差異，但二者對應(yīng)的抑菌圈直徑均小于酵母浸粉；胰蛋白和蛋白胨的 OD600值及抑菌活性都明顯低于酵母粉；氯化銨和硝酸鉀對DP03-4毒性較大，嚴重影響其生長（圖3）；綜合考慮以酵母浸粉為最適氮源。在酵母浸粉含量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的培養(yǎng)液中，菌體的生長量隨酵母浸粉含量的增加而逐漸增加，到1.5%后逐漸降低，其中在含量為1.5%時菌體量最多，OD600值為2.65時抑菌活性較強，抑菌直徑為55.0 mm（結(jié)果未顯示）?；谶@些結(jié)果，將酵母浸粉水平設(shè)置為1.0%、1.5%、2.0%進行正交試驗。

圖3 不同氮源對DP03-4發(fā)酵的影響及發(fā)酵液抑菌活性測定Fig. 3 Effects of different nitrogen sources on the fermentation of DP03-4 and fermentation solution inhibition activity

在碳源、氮源固定，無機鹽不同的培養(yǎng)液中培養(yǎng)篩選最適無機鹽，結(jié)果顯示（圖4）菌體生長量在磷酸氫鉀與氯化鈉培養(yǎng)條件下OD值最高為2.49，但相比磷酸氫鉀，氯化鈉的抑菌圈直徑較高為48.3 mm，所以最佳無機鹽選擇氯化鈉。解淀粉芽胞桿菌DP03-4在碳源、氮源固定，氯化鈉含量0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的培養(yǎng)基中，菌體的生長量隨氯化鈉含量的增加逐漸增加，后逐漸降低，在氯化鈉含量達到0.5%左右時菌體量最多且抑菌活性較強（結(jié)果未顯示），所以將氯化鈉設(shè)置為0.25%、0.50%、0.75%進行正交試驗。

圖4 不同無機鹽對DP03-4發(fā)酵的影響及發(fā)酵液抑菌活性測定Fig. 4 Effects of different inorganic salt on the fermentation of DP03-4 and inhibitory activities of fermentation solution

在碳源、氮源、無機鹽的單因素水平試驗基礎(chǔ)上進行3因素3水平的正交試驗，按正交表進行試驗并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析（表2），據(jù)極差R的大小，酵母浸粉對解淀粉芽胞桿菌DP03-4的菌體生長量、抑菌圈直徑影響最大，葡萄糖次之，氯化鈉對其影響最小，各因素主次順序為BAC，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10 g，酵母浸粉15 g，NaCl 2.5 g，H2O 1000 mL。

表2 菌株DP03-4培養(yǎng)基的篩選正交試驗結(jié)果Table 2 Design and results of single factor experiments on medium composition of the strain DP03-4

2.2.2 解淀粉芽胞桿菌DP03-4發(fā)酵條件篩選 培養(yǎng)液的初始pH值對菌體生長量的影響較大，酸性培養(yǎng)條件明顯抑制DP03-4的生長，在pH為4時，菌體幾乎不生長，在pH 5～7時菌體生長量最多，偏堿性培養(yǎng)條件下抑制其生長（圖5）。因此，選擇DP03-4的發(fā)酵初始pH值范圍為6。

圖5 不同pH對解淀粉芽胞桿菌DP03-4發(fā)酵的影響Fig. 5 Effects of different pH on the fermentation of B.amyloliquefaciens DP03-4

搖瓶裝液量主要影響菌體的溶氧量，隨著裝液量的增多，溶氧量降低，菌體生長量也降低；但裝液量太少會因培養(yǎng)液蒸發(fā)而影響菌體生長。解淀粉芽胞桿菌DP03-4在75 mL/250 mL時菌體生長量最多（圖6），因此裝液量選為75 mL/250 mL。

圖6 不同裝液量對解淀粉芽胞桿菌DP03-4發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of different medium volume on the population of B.amyloliquefaciens DP03-4 in shake culture

菌體生長量受搖床轉(zhuǎn)速的影響較小，在120～240 r/min呈先增加后降低的趨勢，在轉(zhuǎn)速為210 r/min時菌體生長量達到最大OD值2.34（圖7），所以選擇最適的搖床轉(zhuǎn)速為210 r/min。

圖7 DP03-4在不同搖床轉(zhuǎn)速下菌體生長的OD值Fig. 7 Effects of different rotation speeds on the population of B.amyloliquefaciens DP03-4 in shake culture

溫度對解淀粉芽胞桿菌DP03-4的影響較明顯，隨著溫度的增加，菌體生長量呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)溫度處于30 ℃～35 ℃ 時菌體生長量最多，此時OD值為1.5左右（圖8），所以溫度控制在30 ℃～35 ℃。

圖8 不同溫度對解淀粉芽胞桿菌DP03-4發(fā)酵的影響Fig. 8 Effects of different temperature on the population of B.amyloliquefaciens DP03-4 in shake culture

解淀粉芽胞桿菌DP03-4菌體生長量隨菌種接種量的增多先增加后降低，接種量在4%時菌體生長量最多，OD值為2.19，隨后緩慢降低，接種量在2%～5%之間菌體生長量無顯著差異（圖9），綜合考慮最適的接種量為4%。

圖9 不同接種量對解淀粉芽胞桿菌DP03-4發(fā)酵的影響Fig. 9 Effects of different inoculum on the fermentation of B.amyloliquefaciens DP03-4

3 討論

培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件會對菌株的生長量和抑菌物質(zhì)的分泌影響明顯[19]。本研究通過培養(yǎng)基組分單因子試驗和正交試驗確定了培養(yǎng)解淀粉芽胞桿菌 DP03-4的最適碳源、氮源和無機鹽及最適培養(yǎng)基配方。通過單因子水平試驗確定了該菌株發(fā)酵條件的最適培養(yǎng)條件。與優(yōu)化前相比，發(fā)酵液菌體量提高 43.7%，抑菌活性提高51.4%。為該菌株的后續(xù)發(fā)酵利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，牛肉膏、酪蛋白、酵母粉、胰蛋白和蛋白胨等不同氮源的發(fā)酵液對抑菌活性差異不大，但是對解淀粉芽胞桿菌的菌體產(chǎn)量影響較大。如以酪蛋白為氮源，菌體產(chǎn)率僅為酵母粉的三分之一，說明氮源種類顯著影響解淀粉芽胞桿菌DP03-4菌體生長，其機理有待進一步解析。洪鵬等[18]研究顯示以氯化銨為氮源不利于解淀粉芽胞桿菌生長，推測銨態(tài)氮源難以被利用，且對菌體生長有一定的抑制作用。在本研究中，以無機氮氯化銨為氮源，該菌株幾乎不生長，表現(xiàn)出對其生長的“毒性”，可能與氯離子的存在有關(guān)。