顧學(xué)虎，鄭麗寧，黃 鑫，翟乾行，張 義，張 浩，梁 爽*

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，長春 130118）

脂肽由于其獨(dú)特的合成機(jī)制和廣泛的生物活性受到國內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注[1]。脂肽一般是由酵母菌、真菌、細(xì)菌等微生物發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物，由脂肪鏈和肽鏈組成，具有兩親結(jié)構(gòu)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，脂肽對(duì)多種致病真菌、細(xì)菌、支原體、病毒都具有抑制作用[3,4]。同時(shí)，脂肽具有穩(wěn)定性好、不易產(chǎn)生耐藥性、毒性低等特點(diǎn)。目前，脂肽類化合物已被廣泛應(yīng)用于植物病害防治[5]。

迄今為止，芽胞桿菌是被報(bào)道產(chǎn)生抗菌脂肽最多的細(xì)菌屬。吳彩蘭[6]篩選出一株能夠抑制多種病原真菌的莫海威芽胞桿菌TEB-01，并通過PCR檢測脂肽合成相關(guān)基因、結(jié)合RP-HPLC和MALDI-TOF-MS鑒定分析，確定了該菌株能產(chǎn)生Surfactin和Fengycin兩類抗菌脂肽。楊秀文[7]從海洋中篩選出一株對(duì)霉變海魚干優(yōu)勢真菌具有拮抗作用的解淀粉芽胞桿菌HY-5，經(jīng)鑒定其抗菌物質(zhì)為脂肽Surfactin和Iturin。馬興等[8]從兩株拮抗黃瓜枯萎病的萎縮芽胞桿菌中提取出脂肽粗提物，其對(duì)黃瓜枯萎病具有較好的抑菌效果。季冠寧等[9]從一株拮抗黃瓜枯萎病的枯草芽胞桿菌中檢測到脂肽相關(guān)合成基因fenB。冀倩倩等[10]采用酸沉淀法從一株貝萊斯芽胞桿菌的發(fā)酵液中分離并純化出 3種脂肽類化合物，并通過質(zhì)譜分析確定它們分別為Iturin、Fengycin和Bacillomycin。本課題組篩選出一株能夠高效拮抗番茄灰霉病、大豆菌核病、大豆疫霉病等病菌的廣譜生防菌株B. mojavensisD50，前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生抑制植物病原真菌的抗菌脂肽，然而其抗菌脂肽產(chǎn)量較低，導(dǎo)致難以應(yīng)用。響應(yīng)面法是采用多元二次方程來擬合變量和響應(yīng)值之間的關(guān)系，通過分析回歸方程來尋求最優(yōu)條件的一種有效方法[11]。該法具有周期短、試驗(yàn)次數(shù)少、預(yù)測準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)培養(yǎng)基的優(yōu)化[12-15]。

本研究旨在分析培養(yǎng)基中不同成分對(duì)抗菌脂肽產(chǎn)量影響的基礎(chǔ)上，采用 Plackett-Burman和 Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化B. mojavensisD50產(chǎn)抗菌脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組合，提高抗菌脂肽的產(chǎn)量，為D50菌株的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，對(duì)所提取的抗菌脂肽在不同條件下的抑菌活性進(jìn)行測定，評(píng)價(jià)其在不同環(huán)境中的生防潛力，為其后續(xù)的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：生防細(xì)菌Bacillus mojavensisD50和番茄灰霉病菌Botrytis cinerea均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥生測實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

供試培養(yǎng)基：菌株D50的活化和種子液的制備采用LB培養(yǎng)基[9]；番茄灰霉病菌的活化和培養(yǎng)采用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）[15]；脂肽初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、牛肉膏2 g、酵母浸粉2 g、硫酸錳0.2 g、氯化鈣0.2 g、硫酸銨2 g、硫酸鎂0.2 g、磷酸二氫鉀1 g、磷酸氫二鈉2 g、蒸餾水1000 mL、pH 7.2（115 ℃滅菌15 min）。

試驗(yàn)儀器：HWS-250恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱（上海新諾儀器集團(tuán)有限公司）；BS-2E振蕩培養(yǎng)箱（常州金壇良友儀器有限公司）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)（上海滬凈醫(yī)療器械有限公司）；SHZ-88型水浴恒溫震蕩機(jī)（上海亞榮生化儀器廠）；PB-10酸度計(jì)（Sartorius）。

1.2 種子液的制備及抗菌脂肽的提取

菌株D50在?80 ℃下保存，在冰上融化后，將其接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min過夜培養(yǎng)12 h，蘸取少量菌液，劃線接種到LB固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)36 h。挑取活化好的D50單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min過夜培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)得到的菌液用LB液體培養(yǎng)基稀釋至濃度為OD600=0.5，作為種子液。

將種子液以1%的接種量接種于脂肽初始發(fā)酵培養(yǎng)液中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液于6000 r/min離心15 min，取上清液，用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)其pH至2.0，4 ℃過夜放置12 h后，10000 r/min離心10 min，收集沉淀，自然干燥后稱重，將收集的淡黃色晶體用無菌水進(jìn)行溶解，配置成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶解液，溶解液經(jīng)0.22 μm過濾器過濾3次后即為脂肽粗提液[12]。

1.3 脂肽粗提液抑菌穩(wěn)定性測定

將1.2得到的脂肽粗提液每5 mL分裝于滅過菌的試管中，分別置于20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴鍋中水浴30 min后，采用抑菌圈法評(píng)價(jià)脂肽粗提液抑菌作用的熱穩(wěn)定性；用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液分別將脂肽粗提液pH值調(diào)為3、5、7、9和11，放置2 h后調(diào)回中性，采用抑菌圈法評(píng)價(jià)脂肽粗提液抑菌的酸堿穩(wěn)定性；分別在紫外燈下照射2、4、6、8、10 h后，采用抑菌圈法評(píng)價(jià)脂肽粗提液抑菌的紫外輻射穩(wěn)定性。每個(gè)處理3次重復(fù)，試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

抑菌作用測定具體步驟如下：將番茄灰霉病菌接種于 PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌絲長滿 3/4時(shí)，用直徑為5 mm的打孔器打取4個(gè)外圍的番茄灰霉病菌菌塊，與10 mL無菌水共同放入50 mL錐形瓶中充分振蕩混勻，將混合液用無菌紗布過濾得到孢子懸浮液[16]。將PDA培養(yǎng)基加熱后倒入培養(yǎng)皿中冷卻凝固30 min，然后將150 μL的番茄灰霉病孢子懸浮液均勻涂布于平板中，晾干后在培養(yǎng)皿中央打孔并加入100 μL脂肽粗提液。密封后放在25 ℃恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察抑菌圈并測量直徑，另外以加入100 μL無菌水為對(duì)照。每個(gè)處理3次重復(fù)，試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)脂肽初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的9個(gè)培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察，篩選影響抗菌脂肽產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。選擇試驗(yàn)次數(shù)n=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)從葡萄糖（A）、牛肉膏（B）、酵母浸粉（C）、硫酸錳（D）、氯化鈣（E）、硫酸銨（F）、硫酸鎂（G）、磷酸二氫鉀（H）、磷酸氫二鈉（J）等9個(gè)因素中篩選關(guān)鍵因素，每個(gè)因素設(shè)2個(gè)濃度水平（低水平：初始濃度，高水平：低水平的1.5倍）。試驗(yàn)設(shè)計(jì)2個(gè)虛擬變量：K、L。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，以脂肽產(chǎn)量平均值為響應(yīng)值進(jìn)行主效應(yīng)分析，根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，T值決定因素的正負(fù)效應(yīng)。P值決定影響因素的大小。

1.5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果中脂肽產(chǎn)量最高的試驗(yàn)組為基礎(chǔ)，選擇硫酸鎂、葡萄糖和酵母浸粉3個(gè)影響顯著的因素設(shè)計(jì)6個(gè)濃度進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，根據(jù)脂肽產(chǎn)量平均值確定顯著因素的中心點(diǎn)。其中，硫酸鎂和葡萄糖為負(fù)效應(yīng)因素，向低濃度進(jìn)行爬坡；酵母浸粉為正效應(yīng)因素，向高濃度進(jìn)行爬坡。其余負(fù)效應(yīng)因素取低水平濃度，正效應(yīng)因素取高水平濃度。

1.6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)1.4和1.5結(jié)果，對(duì)3個(gè)最顯著影響因素的中心點(diǎn)進(jìn)行編碼，采用3因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。以脂肽產(chǎn)量為響應(yīng)值，對(duì) Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸分析，從而預(yù)測最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基成分濃度。采用Design Expert 11軟件繪制響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，曲線圖存在凸起說明響應(yīng)值存在較為穩(wěn)定的極大值，反之，則不存在較為穩(wěn)定的極大值。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Box-Behnken design factors and levels

1.7 Box-Behnken模型驗(yàn)證試驗(yàn)

使用1.6優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行3次平行發(fā)酵試驗(yàn)，取平均值，使用Design Expert 11軟件繪制脂肽產(chǎn)量實(shí)際值和預(yù)測值相關(guān)性的奇偶圖，以驗(yàn)證Box-Behnken模型的可靠性。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Minitab 17和Design Expert 11軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用DPS 7.05軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肽粗提液的抑菌穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（圖1A）表明，20 ℃～80 ℃處理對(duì)菌株D50脂肽粗提液的抑菌活性無顯著影響（p＞0.05），100 ℃處理使脂肽粗提液的抑菌活性下降了 14.72%，但仍具有較高的抑菌活性。酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（圖1B）表明，脂肽粗提液在pH 5～9環(huán)境下處理后，其抑菌活性無顯著影響（p＞0.05）。而pH為3和11時(shí)，相比于pH 5～9抑菌活性分別下降了15.32%和17.77%。紫外輻射穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1C）表明，經(jīng)過紫外燈照射2～10 h后，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的脂肽粗提液抑菌活性沒有顯著性差異（p＞0.05）。

圖1 不同溫度（A）、pH（B）和紫外輻射時(shí)間（C）對(duì)脂肽粗提取液抑菌活性的影響Fig. 1 Effects of different temperatures (A), pH (B) and UV irradiation time (C) on the antifungal activity of crude lipopeptide extract

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果表明，第7組試驗(yàn)的脂肽產(chǎn)量最高，為1.20 g/L（表2）。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，所得各因子的回歸方程為Y=0.5633-0.1383A+0.0517B+0.0983C+0.0717D+0.0017E-0.0350F-0.1417G+0.0250H-0.0483J，校正系數(shù)R2=0.9208，式中Y為脂肽產(chǎn)量的預(yù)測值。Plackett-Burman試驗(yàn)中各因素水平及效應(yīng)評(píng)價(jià)見表3。根據(jù)T值，確定牛肉膏、酵母浸粉、硫酸錳、氯化鈣和磷酸二氫鉀5個(gè)成分對(duì)脂肽產(chǎn)量呈正效應(yīng)，葡萄糖、硫酸銨、硫酸鎂和磷酸二氫鈉4個(gè)成分對(duì)脂肽產(chǎn)量呈負(fù)效應(yīng)。根據(jù)P值對(duì)影響脂肽產(chǎn)量的9個(gè)因素按重要性進(jìn)行排序：硫酸鎂＞葡萄糖＞酵母浸粉＞硫酸錳＞牛肉膏＞磷酸氫二鈉＞硫酸銨＞磷酸二氫鉀＞氯化鈣。

表2 培養(yǎng)基成分部分因子Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Plackett-Burman design and the experimental result of part medium composition

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及效應(yīng)評(píng)價(jià)Table 3 The factor level of the medium components in Plackett-Burman design and evaluation of their influence

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)硫酸鎂、葡萄糖和酵母浸粉濃度分別為0.15、15和6 g/L時(shí)，脂肽產(chǎn)量最大，為1.72 g/L（表4）。因此選擇這三個(gè)濃度為Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表4 培養(yǎng)基顯著影響因子最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 The experimental design and results of steepest ascent experiment for the significant influencing factors of medium composition

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

對(duì)Box-behnken試驗(yàn)結(jié)果（表5）進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程Y=1.76+0.1075A+0.0413B+0.0062C+0.1075AB-0.0275AC-0.0550BC-0.3055A2-0.3480B2-0.3680C2。模型相關(guān)系數(shù)R2為0.9683，校正后的決定系數(shù)R2Adj為0.9275，表明擬合模型能闡明92.75%的響應(yīng)值的改變，可用于預(yù)測和分析影響脂肽產(chǎn)量的因素。采用Design Expert 11軟件繪制響應(yīng)面曲線圖和等高線圖（圖2）。三幅曲線圖呈凸起，說明響應(yīng)值存在較為穩(wěn)定的極大值。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 5 The scheme and experimental results of the Box-Behnken design

圖2 不同條件對(duì)脂肽產(chǎn)量影響的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖Fig. 2 Response surface graph and contour map of the influence of different conditions on lipopeptide yield

由響應(yīng)面二次模型的方差分析表（表6）可知響應(yīng)面二次模型為顯著型（p＜0.05），且失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），說明回歸方程擬合度高。F值反應(yīng)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響量，A（10.90）＞B（1.61）＞C（0.04），說明各因素對(duì)脂肽產(chǎn)量影響強(qiáng)度為：硫酸鎂＞葡萄糖＞酵母浸粉。

表6 響應(yīng)面二次模型的方差分析Table 6 ANOVA for response surface reduced quadratic model

模擬因素A顯著（p＜0.05），說明硫酸鎂對(duì)脂肽產(chǎn)量的提高有顯著影響，B、C不顯著（p＞0.05），說明葡萄糖、酵母浸粉對(duì)脂肽產(chǎn)量的提高沒有顯著影響，各影響因素對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響并非是線性的。AB、AC、BC不顯著（p＞0.05），說明各因素之間交互作用不顯著。

通過回歸方程分析，得到脂肽產(chǎn)量最大時(shí)，3個(gè)主要影響因素的濃度為：硫酸鎂0.16 g/L、葡萄糖15.45 g/L、酵母浸粉5.99 g/L，在此條件下脂肽產(chǎn)量預(yù)測值為1.77 g/L。

2.5 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的可靠性，選擇優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分（葡萄糖15.45 g/L、牛肉膏3.00 g/L、酵母浸粉5.99 g/L、硫酸錳0.30 g/L、氯化鈣0.30 g/L、硫酸銨2.00 g/L、硫酸鎂0.16 g/L、磷酸二氫鉀1.50 g/L、磷酸氫二鈉2.00 g/L）進(jìn)行3次模型驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示，3次脂肽產(chǎn)量平均值為1.74 g/L，與預(yù)測值十分接近，相比于優(yōu)化前的脂肽產(chǎn)量（0.65 g/L）提高了167.70%。

脂肽產(chǎn)量實(shí)際值和預(yù)測值相關(guān)性的奇偶圖（圖3）顯示了不同條件下脂肽預(yù)測產(chǎn)量和實(shí)際產(chǎn)量的分布，模型的預(yù)測數(shù)據(jù)與實(shí)際數(shù)據(jù)幾乎一致，表明多項(xiàng)式模型的準(zhǔn)確性和通用性良好，使用該模型分析相應(yīng)趨勢是合理的。

圖3 脂肽產(chǎn)量實(shí)際值和預(yù)測值相關(guān)性的奇偶圖Fig. 3 Parity plot of correlation between actual value and predicted value of lipopeptide yield

3 討論

脂肽的抑菌穩(wěn)定性是影響其應(yīng)用的重要因素。本研究表明，D50菌株所產(chǎn)脂肽粗提物抑菌活性在20 ℃～80 ℃環(huán)境下幾乎沒有變化，在 100 ℃時(shí)稍微有所下降，這與李靜[17]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌 Q7產(chǎn)抗菌脂肽抑菌活性在4 ℃～100 ℃之間較為穩(wěn)定的結(jié)果相似。D50菌株所產(chǎn)脂肽粗提物抑菌活性在pH 5～9環(huán)境下幾乎沒有變化，但在過酸或過堿條件下稍微有所下降。高兆建等[18]發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽胞桿菌XZQ-16產(chǎn)抗菌脂肽在pH 4～12環(huán)境下抑菌活性最強(qiáng)。李玥[19]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌HD-322-2產(chǎn)脂肽類表面活性劑在pH 6～9環(huán)境下最穩(wěn)定，說明不同菌株產(chǎn)生的脂肽在不同pH環(huán)境下穩(wěn)定性不同，這可能與不同菌株所產(chǎn)脂肽的成分和含量不同有關(guān)。D50菌株所產(chǎn)脂肽粗提物抑菌活性在紫外燈照射2～10 h后，不會(huì)隨時(shí)間變化而改變，這與黃華毅等[20]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌STO-12所產(chǎn)脂肽類化合物在紫外線輻射處理后活性沒有減弱一致。D50菌株所產(chǎn)脂肽對(duì)不利環(huán)境條件具有良好抑菌穩(wěn)定性，說明其有非常好的應(yīng)用潛力。

芽胞桿菌產(chǎn)生脂肽是通過非核糖體途徑合成的，通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中的成分能夠大幅度提高抗菌脂肽的產(chǎn)量[21-24]。不同碳、氮源及金屬離子對(duì)脂肽類物質(zhì)的產(chǎn)生量有很大影響。黃翔峰等[25]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入Fe2+能夠顯著提高脂肽的產(chǎn)量；陳杰等[26]發(fā)現(xiàn)蔗糖有利于抗菌脂肽的合成；方傳記等[27]發(fā)現(xiàn)L-谷氨酸鈉是產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的關(guān)鍵因子。本研究充分考慮了糖類碳源、有機(jī)氮源、無機(jī)氮源和無機(jī)鹽對(duì)D50菌株產(chǎn)抗菌脂肽的影響，設(shè)計(jì)了脂肽基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基并通過Plackett-Burman試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，確定了最優(yōu)培養(yǎng)基配方，同時(shí)發(fā)現(xiàn)葡萄糖、酵母浸粉、硫酸鎂是影響脂肽產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，結(jié)果為D50菌株產(chǎn)抗菌脂肽的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

綜上，本研究明確了莫海威芽胞桿菌D50產(chǎn)生的脂肽的抑菌穩(wěn)定性，優(yōu)化了其產(chǎn)脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基，顯著提高了脂肽的產(chǎn)量，為后續(xù)利用其防治多種真菌病害奠定了基礎(chǔ)。