肖姬玲，熊 毅，梁志懷，楊 科

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，長(zhǎng)沙 410125）

由灰葡萄孢菌B. cinereaPers.引起的草莓灰霉病，是草莓生殖生長(zhǎng)期間和采后主要真菌性病害，嚴(yán)重影響草莓品質(zhì)，縮短草莓銷售貨架期[1]。目前，化學(xué)防治是防治灰霉病的最有效方法，隨著人們對(duì)食品安全和環(huán)境保護(hù)問題關(guān)注程度的增加，尋求安全、高效、環(huán)境友好的生物防治方法已成為趨勢(shì)[2,3]。用于灰霉病防治研究和應(yīng)用的生防菌株主要包括細(xì)菌類的芽胞桿菌Bacillusspp.、假單胞桿菌Pseudomonasspp.和洋蔥伯克氏菌Burkholderiacepacia等[4-6]，以及真菌類的酵母菌Saccharomycetes和木霉菌Trichodermaspp.等[7-10]。哈茨木霉菌能夠產(chǎn)生抗生素，并通過寄生來控制灰霉菌的生長(zhǎng)，具有抗?fàn)幮浴⒓纳?、抗生性等特性，?duì)草莓灰霉病表現(xiàn)出較好的防治效果[11]。非致病性尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum菌株在枯萎病類防控上表型出優(yōu)異效果，并已有較多的研究報(bào)道，但利用非致病性尖孢鐮刀菌防控灰霉病相關(guān)研究較少[12]。水楊酸（salicylicacid，SA）是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的酚類激素，具有誘導(dǎo)抗病作用，適宜濃度的SA處理可以延緩貯藏期間草莓果實(shí)品質(zhì)下降并抵御灰霉病的發(fā)生[13]。本試驗(yàn)以SA為對(duì)照，對(duì)比了哈茨木霉和兩株非致病性尖孢鐮刀菌菌株對(duì)草莓灰霉病的防控作用，發(fā)現(xiàn)菌株F-1對(duì)灰霉病具有較好的防效，繼而以化學(xué)藥劑嘧霉胺懸浮劑和清水為對(duì)照，測(cè)定了F-1對(duì)草莓灰霉病的田間防效。并從拮抗抑菌和誘導(dǎo)抗病兩個(gè)方面對(duì)該菌防控灰霉病的機(jī)制進(jìn)行探究，旨在明確尖孢鐮刀菌F-1對(duì)草莓灰霉病的生防效果和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料和儀器

試驗(yàn)用草莓品種為“紅顏”，果實(shí)大小均勻，成熟度一致，無物理損傷；供試菌株：灰葡萄孢B. cinerea菌株ACCC37712來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，哈茨木霉Trichoderma harzianumT2-16、尖孢鐮刀菌F. oxysporum菌株F-1和F-2 均由本實(shí)驗(yàn)室從長(zhǎng)沙縣高橋鎮(zhèn)非耕作休閑地分離。接種試驗(yàn)表明，菌株F-1和F-2對(duì)草莓、番茄、甘藍(lán)、白菜和瓜類等十余種常見作物不致??；其他供試試劑包括CheKineTMPeroxidase（POD）Activity Colorimetric Assay Kit、CheKineTMPhenylalanine Ammonia Lyase（PAL）Activity Colorimetric Assay Kit和CuZn/Mn-SOD活性檢測(cè)試劑盒（WST-8法）等。供試儀器包括JXFSTPRP-64 樣品快速研磨儀、Centrifuge 5424R 高速冷凍離心機(jī)、HP300G 智能光照培養(yǎng)箱、CX31 OLYMPUS生物顯微鏡、SW-CJ-1D 單人單面垂直凈化工作臺(tái)、Thermo Scientific Multiskan FC 酶標(biāo)儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SA、尖孢鐮刀菌 F-1、尖孢鐮刀菌 F-2、哈茨木霉對(duì)草莓果實(shí)灰霉病的防控效果測(cè)定 配制濃度為100 μg/mL的SA溶液備用。將尖孢鐮刀菌菌株F-1、F-2、哈茨木霉在PDA平板上活化；4 d后用5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，轉(zhuǎn)接到 PDB 培養(yǎng)基中28 ℃、150 r/min搖培5 d。四層滅菌擦鏡紙過濾獲得各菌株的孢子發(fā)酵混液，將孢子濃度調(diào)節(jié)到1×106孢子/mL。分別取大小均勻、果質(zhì)硬實(shí)、果表微紅的4個(gè)草莓放入上述3個(gè)菌株孢子發(fā)酵混液、SA溶液及2份雙蒸水中浸泡20 min，然后放入相應(yīng)的消毒好的發(fā)芽盒中。其中一份雙蒸水處理的4個(gè)草莓均接種5 mm的空白瓊脂塊，作為空白對(duì)照CK1，另一份接種5 mm的灰霉病菌菌餅作為CK2，其余的各處理每個(gè)草莓上接種直徑為5 mm的灰霉病菌菌餅，置于20 ℃、光照12 h/黑暗12 h條件下培養(yǎng)。每天觀察草莓灰霉病病情發(fā)展情況，并拍照。

1.2.2 尖孢鐮刀菌F-1與灰葡萄孢的平板對(duì)峙試驗(yàn) 在同一PDA 平板上接種尖孢鐮刀菌及灰葡萄孢菌菌餅（Φ=5 mm），兩菌餅之間間隔20 mm，設(shè)3個(gè)重復(fù)，于20 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)。每天觀察各菌株生長(zhǎng)情況，并適時(shí)拍照。

1.2.3 尖孢鐮刀菌發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響 利用2 μm細(xì)菌過濾器去除尖孢鐮刀菌發(fā)酵濾液中的孢子，45 ℃水浴，向50 ℃左右待凝固的2×PDA培養(yǎng)基中按體積比1:1加入尖孢鐮刀菌發(fā)酵濾液，混勻倒入9 cm培養(yǎng)皿中凝固后備用，以加等量無菌水的 PDA 培養(yǎng)基作對(duì)照。在各平板中央點(diǎn)種灰葡萄孢菌餅（Φ=5 mm），20 ℃保濕培養(yǎng)，每隔24 h測(cè)量并記錄菌落直徑，重復(fù)3次。

準(zhǔn)備2個(gè)滅菌的2.0 mm離心管中，分別加入499 μL去除孢子的尖孢鐮刀菌發(fā)酵液和ddH2O2，再分別加入 1 μL濃度為 5×105孢子/mL的灰葡萄孢，混勻后置于20 ℃恒溫培養(yǎng)，24 h后分別統(tǒng)計(jì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)率，重復(fù)3次。孢子萌發(fā)率（%）=萌發(fā)的孢子數(shù)/視野內(nèi)觀察的孢子總數(shù)×100。

1.2.4 F-1對(duì)草莓過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性的影響 以過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性作為植物抗病性反應(yīng)的指標(biāo)，以SA為陽性對(duì)照，雙蒸水為陰性對(duì)照，測(cè)定F-1孢子和發(fā)酵混液及純發(fā)酵液誘導(dǎo)草莓抗性反應(yīng)的能力。分別取4顆洗凈后的草莓在SA、尖孢鐮刀菌和雙蒸水溶液中浸泡20 min，轉(zhuǎn)至底部鋪上兩層雙蒸水浸濕濾紙的發(fā)芽盒中，20 ℃、光照12 h/黑暗12 h條件下培養(yǎng)。分別于處理后24、48和72 h取樣；POD活性的測(cè)定以0.5% H2O2為底物，室溫反應(yīng)3 min，測(cè)定460 nm處OD 值，以每分鐘使OD減少0.01所需酶量為1個(gè)酶活性單位（U），CAT活性的測(cè)定以甲醇為底物，以25 ℃條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol甲醛的所需酶量為1個(gè)酶活性單位(U)；SOD酶活性測(cè)定采用 WST-8法。按照各酶活測(cè)定說明書測(cè)定草莓過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性，重復(fù)3次。

1.2.5 尖孢鐮刀菌F-1對(duì)灰霉病的田間防控效果測(cè)定 2021年于湖南省長(zhǎng)沙市長(zhǎng)沙縣星沙田間大棚內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，供試草莓品種為紅顏。草莓苗于 10月14日進(jìn)行移栽，高壟栽培，壟上雙行。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，400 g/L嘧霉胺懸浮劑1000倍液，孢子濃度為1×106孢子/mL的尖孢鐮刀菌F-1發(fā)酵液孢子液，及清水對(duì)照，隨機(jī)分區(qū)，每個(gè)小區(qū) 80株苗。發(fā)病初期開始施藥，在草莓的花、果和葉片的正面和反面均勻噴施，以葉尖滴藥為度。12月29日第一次施藥，7 d后再施藥1次，共施藥3次。草莓灰霉病田間侵染點(diǎn)以花和果實(shí)為主，第1次施藥前及每次施藥后7 d，摘除全部成熟果實(shí)，分別記錄病果數(shù)和健果數(shù)，計(jì)算病果率和防效，病果率（%）=病果數(shù)/總結(jié)果數(shù)×l00，防效（%）=[（對(duì)照區(qū)病果率—處理區(qū)病果率）/對(duì)照區(qū)病果率]×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用DPS 7.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌F-1等不同處理對(duì)草莓果實(shí)灰霉病的防治效果

所有草莓均隨著時(shí)間的推移逐漸成熟。接種后第3 d，空白對(duì)照CK1和尖孢鐮刀菌F-1處理的草莓無任何發(fā)病癥狀，CK2和其他處理的草莓均開始出現(xiàn)典型的灰霉病癥狀。接種后第6 d（圖1），空白對(duì)照CK1仍無發(fā)病癥狀；對(duì)照處理CK2的草莓均布滿灰霉，被灰霉病菌大量侵染；SA和尖孢鐮刀菌F-2處理的大部分草莓受到灰霉病侵染；哈茨木霉處理的草莓灰霉病病斑較少，但生長(zhǎng)出大量木霉菌菌落，嚴(yán)重影響果實(shí)品質(zhì)；F-1處理的草莓灰霉病病斑最少，且病斑處的病原菌菌絲緊密，菌落生長(zhǎng)受到抑制。結(jié)果表明：尖孢鐮刀菌F-1對(duì)草莓灰霉病的發(fā)生具有較好的防治效果，SA次之，哈茨木霉菌能有效防控灰霉病，但自身能侵染草莓果實(shí)，不適用于草莓結(jié)果期灰霉病的防治。

圖1 接菌后第6 d各條件處理下草莓灰霉病發(fā)病情況Fig. 1 Incidence of gray mold of strawberry under various treatments 6 d after inoculation

2.2 尖孢鐮刀菌F-1與灰霉病的對(duì)峙試驗(yàn)

結(jié)果顯示在PDA平板上灰葡萄孢菌的生長(zhǎng)速度快于F-1，兩菌落之間并未形成抑菌圈（圖2），無拮抗作用。

圖2 接種后第7 d尖孢鐮刀菌與灰葡萄孢在的PDA平板上的對(duì)峙情況Fig. 2 Antagonism between F. oxysporum F-1 and B. cinerea on PDA plate 7 days after inoculation

2.3 尖孢鐮刀菌 F-1發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響.

灰葡萄孢在加有50% F-1發(fā)酵液PDA平板上的生長(zhǎng)速度與CK無顯著差異（表1），表明F-1發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢沒有抑制作用。孢子萌發(fā)測(cè)定結(jié)果顯示24 h后灰葡萄孢孢子在加有發(fā)酵液的培養(yǎng)液中的孢子萌發(fā)率為66.2%（表1），在對(duì)照培養(yǎng)液中的萌發(fā)率為82.5%，說明F-1對(duì)孢子萌發(fā)有一定的抑制效果。此外，在靜置培養(yǎng)時(shí)，對(duì)照處理中灰葡萄孢萌發(fā)的菌絲聚集在液體表層，形成了一層粘附膜，而F-1發(fā)酵液中未形成可見菌膜，說明該菌發(fā)酵液有效抑制了灰葡萄孢菌絲的交錯(cuò)融合和對(duì)管壁的附著能力，F(xiàn)-1發(fā)酵液可能會(huì)降低灰葡萄孢菌絲對(duì)草莓的附著，從而降低草莓灰霉病的發(fā)生。

表1 尖孢鐮刀菌F-1菌株發(fā)酵液對(duì)灰葡萄孢菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)率的影響Table 1 Effects of F. oxysporum F-1 fermentation broth on colony growth and spore germination rate of B. cinerea

2.4 尖孢鐮刀菌F-1對(duì)草莓防御酶CAT、POD、SOD活性的影響

F-1的活性孢子處理草莓后，對(duì)草莓POD的活性無顯著影響，但能有效提高草莓內(nèi)CAT和SOD酶的活性，其活性在處理后的第2 d的達(dá)到峰值，進(jìn)而開始下降，在處理后第4 d，活性與對(duì)照處理相當(dāng)。F-1的發(fā)酵液處理可提高草莓POD的活性，在處理后第2 d達(dá)到峰值，第3 d恢復(fù)到對(duì)照水平，對(duì)CAT和SOD的活性無影響。陽性對(duì)照SA對(duì)POD的誘導(dǎo)效果最好，最高值達(dá)到241 U/g，對(duì)SOD的活性也有提高作用，但對(duì)CAT的活性具有抑制效果。F-1發(fā)酵混液對(duì)以上3種防御酶均具誘導(dǎo)效果，誘導(dǎo)SOD和CAT酶的能力最強(qiáng)，最高值分別達(dá)到269和13.6 U/g。對(duì)POD的活性也有一定的提高作用，最高值為158.9 U/g，僅次于SA處理（圖3）。由上述結(jié)果可知，F(xiàn)-1可以通過活性孢子和發(fā)酵液來調(diào)節(jié)草莓防御酶活力，進(jìn)而提升草莓自身抗性，最終表現(xiàn)為抑制草莓灰霉病的發(fā)生。

圖3 各處理對(duì)草莓CAT、POD、SOD酶活性的影響Fig. 3 Changes of CAT, POD, SOD activity in strawberry under different treatment

2.5 尖孢鐮刀菌F-1對(duì)灰霉病的田間防控效果

由表2可以看到，尖孢鐮刀菌F-1對(duì)草莓灰霉病的防效，隨著處理次數(shù)的增多，防治效果逐漸增強(qiáng)，經(jīng)過3次施藥后，尖孢鐮刀菌F-1對(duì)草莓灰霉病的防效達(dá)到了70.06%，略低于化學(xué)藥劑嘧霉胺的3次用藥效果。

表2 尖孢鐮刀菌F-1對(duì)草莓灰霉病的田間防效Table 2 Field control effect of Fusarium oxysporum F-1 on gray mold of strawberry

3 討論

微生物可以通過各種作用方式防治果蔬病害的發(fā)生，作用機(jī)制主要包括營(yíng)養(yǎng)與空間重寄生作用、分泌次生代謝產(chǎn)物抑制病原菌生長(zhǎng)和誘導(dǎo)寄主抗性[14]等。哈茨木霉T2-16生長(zhǎng)迅速，對(duì)灰霉病菌和尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，并對(duì)草莓、水稻、花生和西瓜等作物具促生誘抗作用，表現(xiàn)出優(yōu)秀的生防效果[15,16]。本研究中，經(jīng)哈茨木霉孢液處理的草莓上灰霉病菌的生長(zhǎng)確實(shí)受到了抑制，但成熟期間草莓果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，導(dǎo)致哈茨木霉自身在草莓上大量繁殖，嚴(yán)重影響了草莓的品質(zhì)。因此，哈茨木霉T2-16不適用于草莓結(jié)果期對(duì)灰霉病的防治。而非致病性尖孢鐮刀菌F-1不論在離體接種試驗(yàn)中，還是在大田防控中，均對(duì)灰霉病的發(fā)生展示出良好的防治作用。

尖孢鐮刀菌是一類即可營(yíng)養(yǎng)寄生，又可在土壤中腐生的真菌。非致病性尖孢鐮刀菌已被證實(shí)對(duì)枯萎病、黃萎病和菌核病等多種病害具有生物防治作用[17-19]，其中研究較深入且應(yīng)用較多的是對(duì)枯萎病的防治，在番茄、西瓜、黃瓜、胡麻、蘆筍等作物的枯萎病防治方面均有相關(guān)報(bào)道[20-22]。非致病尖孢鐮刀菌的生防作用主要是基于其碳源競(jìng)爭(zhēng)、侵染點(diǎn)占領(lǐng)和誘導(dǎo)抗性作用[23,24]。已有研究表明，非致病性尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性的機(jī)制是復(fù)雜和多樣的。非致病性尖孢鐮刀菌Fo47處理后的辣椒和番茄，均發(fā)生了乙烯（ET）生物合成基因的上調(diào)[18]。在辣椒中，F(xiàn)o47處理后56 h，提高了辣椒根系SA的含量，也增加了與JA信號(hào)途徑有關(guān)的兩種化合物（12-氧-植物二烯酸和茉莉-異亮氨酸）的水平[25]。此外，對(duì)ET、SA和JA信號(hào)通路受損的番茄突變體進(jìn)行Fo47處理后，對(duì)枯萎病的防御作用并沒有減弱，說明除以上3個(gè)信號(hào)途徑外，非致病性尖孢鐮刀菌還可通過其他途徑增加植株的系統(tǒng)抗性[26]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，非致病性尖孢鐮刀菌菌株F-1對(duì)灰霉病的生防機(jī)制，主要是通過抑制灰葡萄孢孢子萌發(fā)、降低灰葡萄孢菌絲的粘附能力和誘導(dǎo)寄主抗性3個(gè)方面實(shí)現(xiàn)的。

雖然尖孢鐮刀菌F-1 在防治草莓灰霉病生物方面表現(xiàn)出較好的效果，但要作為重要生防資源和登記為產(chǎn)品，仍需在其寄主?；院蛯?duì)草莓品質(zhì)的影響多方面開展進(jìn)一步的研究與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。