肖姬玲，熊 毅，梁志懷，楊 科

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，長沙 410125）

由灰葡萄孢菌B. cinereaPers.引起的草莓灰霉病，是草莓生殖生長期間和采后主要真菌性病害，嚴(yán)重影響草莓品質(zhì)，縮短草莓銷售貨架期[1]。目前，化學(xué)防治是防治灰霉病的最有效方法，隨著人們對食品安全和環(huán)境保護(hù)問題關(guān)注程度的增加，尋求安全、高效、環(huán)境友好的生物防治方法已成為趨勢[2,3]。用于灰霉病防治研究和應(yīng)用的生防菌株主要包括細(xì)菌類的芽胞桿菌Bacillusspp.、假單胞桿菌Pseudomonasspp.和洋蔥伯克氏菌Burkholderiacepacia等[4-6]，以及真菌類的酵母菌Saccharomycetes和木霉菌Trichodermaspp.等[7-10]。哈茨木霉菌能夠產(chǎn)生抗生素，并通過寄生來控制灰霉菌的生長，具有抗?fàn)幮浴⒓纳?、抗生性等特性，對草莓灰霉病表現(xiàn)出較好的防治效果[11]。非致病性尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum菌株在枯萎病類防控上表型出優(yōu)異效果，并已有較多的研究報(bào)道，但利用非致病性尖孢鐮刀菌防控灰霉病相關(guān)研究較少[12]。水楊酸（salicylicacid，SA）是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的酚類激素，具有誘導(dǎo)抗病作用，適宜濃度的SA處理可以延緩貯藏期間草莓果實(shí)品質(zhì)下降并抵御灰霉病的發(fā)生[13]。本試驗(yàn)以SA為對照，對比了哈茨木霉和兩株非致病性尖孢鐮刀菌菌株對草莓灰霉病的防控作用，發(fā)現(xiàn)菌株F-1對灰霉病具有較好的防效，繼而以化學(xué)藥劑嘧霉胺懸浮劑和清水為對照，測定了F-1對草莓灰霉病的田間防效。并從拮抗抑菌和誘導(dǎo)抗病兩個方面對該菌防控灰霉病的機(jī)制進(jìn)行探究，旨在明確尖孢鐮刀菌F-1對草莓灰霉病的生防效果和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料和儀器

試驗(yàn)用草莓品種為“紅顏”，果實(shí)大小均勻，成熟度一致，無物理損傷；供試菌株：灰葡萄孢B. cinerea菌株ACCC37712來源于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，哈茨木霉Trichoderma harzianumT2-16、尖孢鐮刀菌F. oxysporum菌株F-1和F-2 均由本實(shí)驗(yàn)室從長沙縣高橋鎮(zhèn)非耕作休閑地分離。接種試驗(yàn)表明，菌株F-1和F-2對草莓、番茄、甘藍(lán)、白菜和瓜類等十余種常見作物不致病；其他供試試劑包括CheKineTMPeroxidase（POD）Activity Colorimetric Assay Kit、CheKineTMPhenylalanine Ammonia Lyase（PAL）Activity Colorimetric Assay Kit和CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒（WST-8法）等。供試儀器包括JXFSTPRP-64 樣品快速研磨儀、Centrifuge 5424R 高速冷凍離心機(jī)、HP300G 智能光照培養(yǎng)箱、CX31 OLYMPUS生物顯微鏡、SW-CJ-1D 單人單面垂直凈化工作臺、Thermo Scientific Multiskan FC 酶標(biāo)儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SA、尖孢鐮刀菌 F-1、尖孢鐮刀菌 F-2、哈茨木霉對草莓果實(shí)灰霉病的防控效果測定 配制濃度為100 μg/mL的SA溶液備用。將尖孢鐮刀菌菌株F-1、F-2、哈茨木霉在PDA平板上活化；4 d后用5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，轉(zhuǎn)接到 PDB 培養(yǎng)基中28 ℃、150 r/min搖培5 d。四層滅菌擦鏡紙過濾獲得各菌株的孢子發(fā)酵混液，將孢子濃度調(diào)節(jié)到1×106孢子/mL。分別取大小均勻、果質(zhì)硬實(shí)、果表微紅的4個草莓放入上述3個菌株孢子發(fā)酵混液、SA溶液及2份雙蒸水中浸泡20 min，然后放入相應(yīng)的消毒好的發(fā)芽盒中。其中一份雙蒸水處理的4個草莓均接種5 mm的空白瓊脂塊，作為空白對照CK1，另一份接種5 mm的灰霉病菌菌餅作為CK2，其余的各處理每個草莓上接種直徑為5 mm的灰霉病菌菌餅，置于20 ℃、光照12 h/黑暗12 h條件下培養(yǎng)。每天觀察草莓灰霉病病情發(fā)展情況，并拍照。

1.2.2 尖孢鐮刀菌F-1與灰葡萄孢的平板對峙試驗(yàn) 在同一PDA 平板上接種尖孢鐮刀菌及灰葡萄孢菌菌餅（Φ=5 mm），兩菌餅之間間隔20 mm，設(shè)3個重復(fù)，于20 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)。每天觀察各菌株生長情況，并適時(shí)拍照。

1.2.3 尖孢鐮刀菌發(fā)酵液對灰葡萄孢菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響 利用2 μm細(xì)菌過濾器去除尖孢鐮刀菌發(fā)酵濾液中的孢子，45 ℃水浴，向50 ℃左右待凝固的2×PDA培養(yǎng)基中按體積比1:1加入尖孢鐮刀菌發(fā)酵濾液，混勻倒入9 cm培養(yǎng)皿中凝固后備用，以加等量無菌水的 PDA 培養(yǎng)基作對照。在各平板中央點(diǎn)種灰葡萄孢菌餅（Φ=5 mm），20 ℃保濕培養(yǎng)，每隔24 h測量并記錄菌落直徑，重復(fù)3次。

準(zhǔn)備2個滅菌的2.0 mm離心管中，分別加入499 μL去除孢子的尖孢鐮刀菌發(fā)酵液和ddH2O2，再分別加入 1 μL濃度為 5×105孢子/mL的灰葡萄孢，混勻后置于20 ℃恒溫培養(yǎng)，24 h后分別統(tǒng)計(jì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)率，重復(fù)3次。孢子萌發(fā)率（%）=萌發(fā)的孢子數(shù)/視野內(nèi)觀察的孢子總數(shù)×100。

1.2.4 F-1對草莓過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性的影響 以過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性作為植物抗病性反應(yīng)的指標(biāo)，以SA為陽性對照，雙蒸水為陰性對照，測定F-1孢子和發(fā)酵混液及純發(fā)酵液誘導(dǎo)草莓抗性反應(yīng)的能力。分別取4顆洗凈后的草莓在SA、尖孢鐮刀菌和雙蒸水溶液中浸泡20 min，轉(zhuǎn)至底部鋪上兩層雙蒸水浸濕濾紙的發(fā)芽盒中，20 ℃、光照12 h/黑暗12 h條件下培養(yǎng)。分別于處理后24、48和72 h取樣；POD活性的測定以0.5% H2O2為底物，室溫反應(yīng)3 min，測定460 nm處OD 值，以每分鐘使OD減少0.01所需酶量為1個酶活性單位（U），CAT活性的測定以甲醇為底物，以25 ℃條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol甲醛的所需酶量為1個酶活性單位(U)；SOD酶活性測定采用 WST-8法。按照各酶活測定說明書測定草莓過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性，重復(fù)3次。

1.2.5 尖孢鐮刀菌F-1對灰霉病的田間防控效果測定 2021年于湖南省長沙市長沙縣星沙田間大棚內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，供試草莓品種為紅顏。草莓苗于 10月14日進(jìn)行移栽，高壟栽培，壟上雙行。試驗(yàn)設(shè)置3個處理，400 g/L嘧霉胺懸浮劑1000倍液，孢子濃度為1×106孢子/mL的尖孢鐮刀菌F-1發(fā)酵液孢子液，及清水對照，隨機(jī)分區(qū)，每個小區(qū) 80株苗。發(fā)病初期開始施藥，在草莓的花、果和葉片的正面和反面均勻噴施，以葉尖滴藥為度。12月29日第一次施藥，7 d后再施藥1次，共施藥3次。草莓灰霉病田間侵染點(diǎn)以花和果實(shí)為主，第1次施藥前及每次施藥后7 d，摘除全部成熟果實(shí)，分別記錄病果數(shù)和健果數(shù)，計(jì)算病果率和防效，病果率（%）=病果數(shù)/總結(jié)果數(shù)×l00，防效（%）=[（對照區(qū)病果率—處理區(qū)病果率）/對照區(qū)病果率]×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌F-1等不同處理對草莓果實(shí)灰霉病的防治效果

所有草莓均隨著時(shí)間的推移逐漸成熟。接種后第3 d，空白對照CK1和尖孢鐮刀菌F-1處理的草莓無任何發(fā)病癥狀，CK2和其他處理的草莓均開始出現(xiàn)典型的灰霉病癥狀。接種后第6 d（圖1），空白對照CK1仍無發(fā)病癥狀；對照處理CK2的草莓均布滿灰霉，被灰霉病菌大量侵染；SA和尖孢鐮刀菌F-2處理的大部分草莓受到灰霉病侵染；哈茨木霉處理的草莓灰霉病病斑較少，但生長出大量木霉菌菌落，嚴(yán)重影響果實(shí)品質(zhì)；F-1處理的草莓灰霉病病斑最少，且病斑處的病原菌菌絲緊密，菌落生長受到抑制。結(jié)果表明：尖孢鐮刀菌F-1對草莓灰霉病的發(fā)生具有較好的防治效果，SA次之，哈茨木霉菌能有效防控灰霉病，但自身能侵染草莓果實(shí)，不適用于草莓結(jié)果期灰霉病的防治。

圖1 接菌后第6 d各條件處理下草莓灰霉病發(fā)病情況Fig. 1 Incidence of gray mold of strawberry under various treatments 6 d after inoculation

2.2 尖孢鐮刀菌F-1與灰霉病的對峙試驗(yàn)

結(jié)果顯示在PDA平板上灰葡萄孢菌的生長速度快于F-1，兩菌落之間并未形成抑菌圈（圖2），無拮抗作用。

圖2 接種后第7 d尖孢鐮刀菌與灰葡萄孢在的PDA平板上的對峙情況Fig. 2 Antagonism between F. oxysporum F-1 and B. cinerea on PDA plate 7 days after inoculation

2.3 尖孢鐮刀菌 F-1發(fā)酵液對灰葡萄孢菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響.

灰葡萄孢在加有50% F-1發(fā)酵液PDA平板上的生長速度與CK無顯著差異（表1），表明F-1發(fā)酵液對灰葡萄孢沒有抑制作用。孢子萌發(fā)測定結(jié)果顯示24 h后灰葡萄孢孢子在加有發(fā)酵液的培養(yǎng)液中的孢子萌發(fā)率為66.2%（表1），在對照培養(yǎng)液中的萌發(fā)率為82.5%，說明F-1對孢子萌發(fā)有一定的抑制效果。此外，在靜置培養(yǎng)時(shí)，對照處理中灰葡萄孢萌發(fā)的菌絲聚集在液體表層，形成了一層粘附膜，而F-1發(fā)酵液中未形成可見菌膜，說明該菌發(fā)酵液有效抑制了灰葡萄孢菌絲的交錯融合和對管壁的附著能力，F(xiàn)-1發(fā)酵液可能會降低灰葡萄孢菌絲對草莓的附著，從而降低草莓灰霉病的發(fā)生。

表1 尖孢鐮刀菌F-1菌株發(fā)酵液對灰葡萄孢菌落生長和孢子萌發(fā)率的影響Table 1 Effects of F. oxysporum F-1 fermentation broth on colony growth and spore germination rate of B. cinerea

2.4 尖孢鐮刀菌F-1對草莓防御酶CAT、POD、SOD活性的影響

F-1的活性孢子處理草莓后，對草莓POD的活性無顯著影響，但能有效提高草莓內(nèi)CAT和SOD酶的活性，其活性在處理后的第2 d的達(dá)到峰值，進(jìn)而開始下降，在處理后第4 d，活性與對照處理相當(dāng)。F-1的發(fā)酵液處理可提高草莓POD的活性，在處理后第2 d達(dá)到峰值，第3 d恢復(fù)到對照水平，對CAT和SOD的活性無影響。陽性對照SA對POD的誘導(dǎo)效果最好，最高值達(dá)到241 U/g，對SOD的活性也有提高作用，但對CAT的活性具有抑制效果。F-1發(fā)酵混液對以上3種防御酶均具誘導(dǎo)效果，誘導(dǎo)SOD和CAT酶的能力最強(qiáng)，最高值分別達(dá)到269和13.6 U/g。對POD的活性也有一定的提高作用，最高值為158.9 U/g，僅次于SA處理（圖3）。由上述結(jié)果可知，F(xiàn)-1可以通過活性孢子和發(fā)酵液來調(diào)節(jié)草莓防御酶活力，進(jìn)而提升草莓自身抗性，最終表現(xiàn)為抑制草莓灰霉病的發(fā)生。

圖3 各處理對草莓CAT、POD、SOD酶活性的影響Fig. 3 Changes of CAT, POD, SOD activity in strawberry under different treatment

2.5 尖孢鐮刀菌F-1對灰霉病的田間防控效果

由表2可以看到，尖孢鐮刀菌F-1對草莓灰霉病的防效，隨著處理次數(shù)的增多，防治效果逐漸增強(qiáng)，經(jīng)過3次施藥后，尖孢鐮刀菌F-1對草莓灰霉病的防效達(dá)到了70.06%，略低于化學(xué)藥劑嘧霉胺的3次用藥效果。

表2 尖孢鐮刀菌F-1對草莓灰霉病的田間防效Table 2 Field control effect of Fusarium oxysporum F-1 on gray mold of strawberry

3 討論

微生物可以通過各種作用方式防治果蔬病害的發(fā)生，作用機(jī)制主要包括營養(yǎng)與空間重寄生作用、分泌次生代謝產(chǎn)物抑制病原菌生長和誘導(dǎo)寄主抗性[14]等。哈茨木霉T2-16生長迅速，對灰霉病菌和尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，并對草莓、水稻、花生和西瓜等作物具促生誘抗作用，表現(xiàn)出優(yōu)秀的生防效果[15,16]。本研究中，經(jīng)哈茨木霉孢液處理的草莓上灰霉病菌的生長確實(shí)受到了抑制，但成熟期間草莓果實(shí)營養(yǎng)豐富，導(dǎo)致哈茨木霉自身在草莓上大量繁殖，嚴(yán)重影響了草莓的品質(zhì)。因此，哈茨木霉T2-16不適用于草莓結(jié)果期對灰霉病的防治。而非致病性尖孢鐮刀菌F-1不論在離體接種試驗(yàn)中，還是在大田防控中，均對灰霉病的發(fā)生展示出良好的防治作用。

尖孢鐮刀菌是一類即可營養(yǎng)寄生，又可在土壤中腐生的真菌。非致病性尖孢鐮刀菌已被證實(shí)對枯萎病、黃萎病和菌核病等多種病害具有生物防治作用[17-19]，其中研究較深入且應(yīng)用較多的是對枯萎病的防治，在番茄、西瓜、黃瓜、胡麻、蘆筍等作物的枯萎病防治方面均有相關(guān)報(bào)道[20-22]。非致病尖孢鐮刀菌的生防作用主要是基于其碳源競爭、侵染點(diǎn)占領(lǐng)和誘導(dǎo)抗性作用[23,24]。已有研究表明，非致病性尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性的機(jī)制是復(fù)雜和多樣的。非致病性尖孢鐮刀菌Fo47處理后的辣椒和番茄，均發(fā)生了乙烯（ET）生物合成基因的上調(diào)[18]。在辣椒中，F(xiàn)o47處理后56 h，提高了辣椒根系SA的含量，也增加了與JA信號途徑有關(guān)的兩種化合物（12-氧-植物二烯酸和茉莉-異亮氨酸）的水平[25]。此外，對ET、SA和JA信號通路受損的番茄突變體進(jìn)行Fo47處理后，對枯萎病的防御作用并沒有減弱，說明除以上3個信號途徑外，非致病性尖孢鐮刀菌還可通過其他途徑增加植株的系統(tǒng)抗性[26]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，非致病性尖孢鐮刀菌菌株F-1對灰霉病的生防機(jī)制，主要是通過抑制灰葡萄孢孢子萌發(fā)、降低灰葡萄孢菌絲的粘附能力和誘導(dǎo)寄主抗性3個方面實(shí)現(xiàn)的。

雖然尖孢鐮刀菌F-1 在防治草莓灰霉病生物方面表現(xiàn)出較好的效果，但要作為重要生防資源和登記為產(chǎn)品，仍需在其寄主?；院蛯Σ葺焚|(zhì)的影響多方面開展進(jìn)一步的研究與風(fēng)險(xiǎn)評估。