龔慧媛，穆葉舒，洪 琛，羅 穩(wěn)*,王超杰

(1. 河南大學(xué) 天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封 475004； 2. 河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開(kāi)封 475004；3. 河南大學(xué) 淮河醫(yī)院，河南 開(kāi)封 475004)

芳香族硝基炸藥由于穩(wěn)定性好、敏感度較低、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，是目前用量最大、用途最廣的單質(zhì)類炸藥，它們?cè)跒槿祟愇拿鞯陌l(fā)展做出巨大貢獻(xiàn)的同時(shí)，也對(duì)人類的公共安全、生命健康和自然環(huán)境產(chǎn)生了嚴(yán)重的危害[1-3]。在這類炸藥中，2,4,6-三硝基甲苯(TNT)和2,4,6-三硝基苯酚(PA，又稱苦味酸)的應(yīng)用最為廣泛，其中PA的爆炸性比TNT強(qiáng)，同時(shí)在染料工業(yè)，制藥和實(shí)驗(yàn)室中也具有重要作用[4]。PA也因此在自然界中大量殘留，從而導(dǎo)致環(huán)境污染和健康危害。PA的水溶性比TNT好，更利于生物體的吸收而引發(fā)疾病[5]。因此，為了防止恐怖威脅和環(huán)境污染，開(kāi)發(fā)快速便捷的檢測(cè)PA的方法，是許多科研工作者關(guān)注的重點(diǎn)。

檢測(cè)硝基芳烴爆炸物的方法有很多，如液/氣質(zhì)聯(lián)用、紅外光譜法、拉曼光譜、和電化學(xué)法等[6]，它們耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，且受限于儀器，不能方便地用于現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)時(shí)檢測(cè)。相比之下，熒光傳感法具有操作簡(jiǎn)單、高靈敏度和快速響應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[7]。熒光傳感法需要用到熒光分子，其中有機(jī)熒光納米粒子(FONs)因其制備簡(jiǎn)單和低成本，且具有良好的生物相容性，更有應(yīng)用潛力[8]。雖然近年來(lái)關(guān)于FONs的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展[9]，但開(kāi)發(fā)用于水相檢測(cè)的有機(jī)小分子仍是一個(gè)非常具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)[10]。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的有機(jī)熒光小分子在水溶液中容易發(fā)生“聚集引起的猝滅”(ACQ)。唐本忠院士報(bào)道的“聚集誘導(dǎo)發(fā)光”(AIE)[11]小分子為在水相中熒光檢測(cè)提供了可能。

萘酰亞胺是一類具有重要功能的小分子，在醫(yī)藥、生物、化學(xué)和材料等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。例如安奈菲特、米托萘胺和依利奈法德(圖1，A ～ C)曾進(jìn)入臨床試驗(yàn)治療腫瘤[12]?；衔顳 ～ E具有膽堿酯酶抑制活性[13,14]，而F ～ G作為熒光探針用于檢測(cè)金屬離子和生物分子等[15]。本課題組曾報(bào)道了一些靶向細(xì)胞亞器和抑制膽堿酯酶活性的萘酰亞胺衍生物[16,17]，具有較強(qiáng)熒光(圖1, H ～ I)。本文報(bào)道了一種萘酰亞胺衍生物Npd用于檢測(cè)水相中PA。Npd是典型的受體(A)-供體(D)型分子。1,8-萘酰亞胺單元為電子受體，哌啶單元組成電子供體，形成的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)導(dǎo)致其熒光發(fā)射。而PA可以使Npd質(zhì)子化，導(dǎo)致其與PA陰離子之間發(fā)生了強(qiáng)靜電相互作用，阻礙了ICT效應(yīng)，導(dǎo)致熒光淬滅。Npd的合成路線如圖2所示。

圖1 萘酰亞胺類衍生物的結(jié)構(gòu)式

圖2 探針Npd的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

WFH2204B型手提式紫外燈；X-6型顯微熔點(diǎn)儀(溫度未校正)； Bruker DPX-300型超導(dǎo)核磁共振儀，TMS為內(nèi)標(biāo)；Esquire3000型質(zhì)譜儀；1260-6230型高精度飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；島津LC-20AB高效液相色譜儀；愛(ài)丁堡FS5型熒光光譜儀。

1-叔丁氧羰基-4-(氨基甲基)哌啶(純度97%)和4-氟芐溴(純度97%)購(gòu)自上海阿拉丁試劑公司；TNT甲醇溶液(1.00 g/L)和DNT甲醇溶液(1.00 g/L)購(gòu)自麥克林試劑公司； PA的乙腈溶液(0.1 g/L)購(gòu)自德國(guó)DRE公司；其他試劑均為市售分析純，未做進(jìn)一步處理；硅膠(200～300目)購(gòu)自青島海洋硅膠廠。

1.2 化合物的合成

1.2.1 中間體2的合成

將1,8-萘二甲酸酐(1，1.0 mmol)與1-叔丁氧羰基-4-氨甲基哌啶(0.22 g，1.0 mmol)加入到15 mL無(wú)水乙醇中，80 ℃ 加熱攪拌5 h，反應(yīng)完畢后，冷卻至室溫并蒸干溶劑。殘余物中加入20 mL氯仿，用2 mol/L的稀鹽酸洗滌三次，每次15 mL。取有機(jī)相，無(wú)水Na2SO4干燥，蒸干溶劑，得0.34 g白色固體，產(chǎn)率85%。

1.2.2 中間體3的合成

將中間體2(2.0 mmol)加入到無(wú)水乙醇(10 mL)中，冰浴冷卻下緩慢加入4 mol/L的氯化氫的二氧六環(huán)溶液(5 mL)，攪拌1 h后撤去冰浴，自然升至室溫，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。減壓蒸除溶劑，硅膠柱層析(V二氯甲烷∶V甲醇= 20∶1)得0.48 g白色固體，產(chǎn)率82%。1H NMR (300 MHz, D2O)δ7.67 (s, 2H, Ar-H), 7.64 (s, 2H, Ar-H), 7.22 (t,J= 7.8 Hz, 2H, Ar-H), 3.55 (d,J= 6.6 Hz, 2H, NCH2), 3.39 (d,J= 12.9 Hz, 2H, CH2), 2.90 (t,J= 12.6 Hz, 2H, CH2), 1.89～1.74 (m, 3H, CHCH2), 1.51～1.38 (m, 2H, CH2); HRMS calcd for C18H18N2O2[M+H]+295.144 7, found 295.146 1。

1.2.3 探針Npd的合成

將中間體3(2.0 mmol)、4-氟芐溴(2.0 mmol)和無(wú)水K2CO3(4.0 mmol)加入到乙腈(30 mL)中，60 ℃反應(yīng)6 h。冷卻后過(guò)濾，濾餅用乙腈洗滌3次。合并濾液，濃縮，剩余物用硅膠柱層析(V二氯甲烷∶V甲醇= 30∶1)分離，得0.15 g淡黃色固體，產(chǎn)率60%，mp: 128～130 ℃。1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ8.57 (d,J= 7.2 Hz, 2H, Ar-H), 8.19 (d,J= 8.1 Hz, 2H, Ar-H), 7.73 (t,J= 7.8 Hz, 2H, Ar-H), 7.24 (t,J= 7.2 Hz, 2H, Ar-H), 6.95 (t,J= 8.7 Hz, 2H, Ar-H), 4.12 (d,J= 7.2 Hz, 2H, CH2), 3.42 (s, 2H, CH2), 2.84 (d,J= 11.4 Hz, 2H, CH2), 1.91 (t,J= 11.1 Hz, 3H, CH, CH2), 1.68 (d,J= 12.3 Hz, 2H, CH2), 1.56～1.42 (m, 2H, CH2);13C NMR (75 MHz, CDCl3)δ164.5, 163.5, 160.3, 134.20, 133.9, 131.6, 130.9, 130.5, 128.2, 127.0, 122.6, 115.1, 114.8, 62.35, 53.3, 45.3, 35.1, 30.1; HRMS calcd for C25H23FN2O2[M+H]+403.182 2, found 403.182 9。Purity: 98% by HPLC。

1.2 紫外和熒光光譜

稱取一定量的Npd或檢測(cè)物，加入DMSO或超純水，混勻配置成10 mmol/L的儲(chǔ)備液，然后分別向一系列離心管中加入計(jì)算量的Npd儲(chǔ)備液和檢測(cè)物儲(chǔ)備液，并用超純水稀釋到測(cè)試濃度，搖勻后靜置15 min，加入到石英比色皿中，記錄紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜。

1.3 試紙制備測(cè)

普通定性圓形濾紙(直徑為2 cm)用20 μmol/L的Npd溶液浸泡3 h，取出后真空干燥，玻璃板壓平備用。市售PA溶液，蒸干后加入少量超純水溶解，稀釋到待測(cè)濃度備用，用直徑為0.3 mm的薄層層析(TLC)點(diǎn)樣毛細(xì)管輕輕沾取樣品，迅速點(diǎn)至試紙上，吹干后在紫外燈下觀察拍照。

1.4 細(xì)胞毒性

采用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)試化合物對(duì)細(xì)胞生存率的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期的細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)/mL加入到96孔板中，隨后在培養(yǎng)板中加入不同濃度的化合物，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，在37 ℃ 的含5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)48 h。然后，每孔加入50 μL MTT溶液(1 g/L)，繼續(xù)孵育4 h。除去上清液后，加入100 μL的DMSO在室溫下溶解晶體產(chǎn)物15 min。用酶標(biāo)儀測(cè)量在570 nm的吸光度。由公式: 抑制率=(A對(duì)照-A樣品)/(A對(duì)照-A空白)×100% 來(lái)計(jì)算不同濃度的抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的合成

以1,8-萘二甲酸酐和1-叔丁氧羰基-4-氨甲基-哌啶為起始原料，在無(wú)水乙醇中加熱回流生成中間體2，此步不用柱層析分離，可直接進(jìn)行下一步。中間體2經(jīng)稀鹽酸脫保護(hù)生成中間體3，快速柱層析后可得純品，產(chǎn)率較高。3與4-氟溴芐在碳酸鉀的作用下發(fā)生親核取代反應(yīng)，得到目標(biāo)產(chǎn)物Npd。其結(jié)構(gòu)通過(guò)1H NMR、13C NMR及HRMS確證，純度通過(guò)HPLC測(cè)定。

2.2 光學(xué)性質(zhì)

由紫外吸收和熒光光譜(圖3a、b)可以看出，室溫下Npd在不同溶劑中的吸收帶位于340 nm，其在純水中的熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)為400 nm，肉眼可見(jiàn)藍(lán)色熒光，有機(jī)溶劑中熒光較弱。由于Npd易溶于有機(jī)溶劑，不溶于水，通過(guò)向Npd的THF溶液中加入不同比例的水(fw)來(lái)評(píng)價(jià)其AIE性質(zhì)。從圖4a可以看出，隨著fw增加，體系的紫外吸收逐漸降低，表明體系中溶解的Npd逐漸減少，同時(shí)最大吸收發(fā)生了紅移且變寬，表明分子間距變小，共軛程度增加，發(fā)生了聚集。由圖4b和圖5可以看到，394 nm處的熒光強(qiáng)度隨著水的含量增高而明顯增強(qiáng)，這一現(xiàn)象符合AIE分子的特征。

圖3 Npd (20 μmol/L)在不同溶劑中的紫外(a)和熒光(b，λex= 340 nm，slit: 2.0/0.5 nm)光譜

圖4 Npd在THF/水混合溶劑中的UV(a)和FL (b，λex= 340 nm，slit: 2.0/0.5 nm)光譜

圖5 Npd (20 μmol/L)在 394 nm處的熒光強(qiáng)度與THF/水混合溶劑中的水比例的關(guān)系。 插圖：紫外燈(365 nm)下的照片

由于Npd可能在水相中發(fā)生聚集形成納米顆粒，因此其溶液應(yīng)具有丁達(dá)爾現(xiàn)象。用激光筆照射不同水比例的Npd溶液(圖6)，可以看到在純THF中(fw=0%)紅色光帶幾乎不可見(jiàn)，隨著fw增高，紅色光帶越來(lái)越明顯，表明Npd在水中形成了納米顆粒。經(jīng)激光粒度儀測(cè)試純水中Npd的平均粒徑為164.2 nm。

圖6 Npd (20 μmol/L)在不同比例的水/四氫呋喃溶液中的丁達(dá)爾效應(yīng)

AIE分子溶液的熒光會(huì)隨著濃度增大而增強(qiáng)，不會(huì)出現(xiàn)聚集導(dǎo)致的淬滅現(xiàn)象。其原因是分子間距隨濃度增大而減小，導(dǎo)致分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限，受到激發(fā)后非輻射躍遷減少，熒光更強(qiáng)。用THF配置不同濃度的Npd溶液，在紫外燈下(365 nm)肉眼觀察(圖7a)，發(fā)現(xiàn)Npd隨著濃度增大(1 μmol/L～200 mmol/L)其溶液熒光明顯增強(qiáng)。另外，Npd的固體粉末在紫外燈下也發(fā)出明亮熒光(圖7c)。

圖7 Npd 在(a) THF中紫外燈 (365 nm)下的照片，濃度從左到右依次為：1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L，(b) 日光和 (c) 紫外燈 (365 nm)

2.3 PA識(shí)別

往Npd的水溶液中加入PA后記錄紫外和熒光的變化，結(jié)果如圖8所示，加入PA后，340 nm處的紫外吸收明顯升高，且肉眼可見(jiàn)溶液顏色由無(wú)色變?yōu)榈S色。熒光強(qiáng)度在加入PA后顯著降低，加入200 μmol/L的PA后熒光猝滅效率為99.9%。熒光靜態(tài)猝滅常數(shù)Ksv是評(píng)價(jià)傳感器的重要因素，可根據(jù)Stern-Volmer方程：I0/I= 1 +Ksv[Q]，計(jì)算得到。其中I0和I分別是在未加和加入檢測(cè)物時(shí)的熒光強(qiáng)度，Ksv是猝滅常數(shù)，Q是檢測(cè)物的濃度。根據(jù)方程計(jì)算得到猝滅常數(shù)Ksv的值為3.93×104M-1。根據(jù)檢測(cè)限值(LODs)= 3SB/m，其中SB為空白測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，m為熒光強(qiáng)度與樣品濃度的斜率(圖9)。PA濃度在0 ～ 60 μmol/L范圍內(nèi)，識(shí)別具有較好的線性關(guān)系(R2=0. 99)，經(jīng)計(jì)算LODs值為2.09×10-6mol/L，與其他文獻(xiàn)報(bào)告的值相近[18-21]，然而這些文獻(xiàn)報(bào)道的都是在非水或少量水溶液中進(jìn)行檢測(cè)的，限制了它們的實(shí)際應(yīng)用。

圖8 Npd (20 μmol/L)隨PA (0～200 μmol/L) 濃度的變化的UV (a) 和FL (b) 光譜插圖(b)：隨著 PA 濃度的增加，Npd的FL強(qiáng)度 (391 nm) 變化

圖9 Npd與PA識(shí)別的線性關(guān)系圖

由于在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)不可避免地接觸到PA，導(dǎo)致PA少量殘留，因此有必要開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單快速、低成本的檢測(cè)方法。我們將濾紙浸入到Npd溶液中并干燥壓平，制作了一種可用于PA快速檢測(cè)的試紙。未浸泡的濾紙?jiān)?65 nm紫外燈下無(wú)熒光，而浸泡過(guò)的有明亮藍(lán)色熒光。用毛細(xì)管沾取含有PA的溶液，迅速點(diǎn)至試紙上，吹干后在紫外燈下觀察，肉眼可分辨的最低濃度為0.50 mmol/L(圖10)，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道[22]。

圖10 Npd試紙對(duì)水中PA的快速檢測(cè)

2.4 對(duì)PA的選擇性

為了考察Npd對(duì)PA識(shí)別的選擇性，選取了常見(jiàn)的爆炸物如TNT、DNT、硝酸甘油(NG)以及硝基苯(NB)等進(jìn)行了選擇性實(shí)驗(yàn)。向Npd溶液(20 μmol/L)中加入40 μmol/L的待測(cè)物，PA組的熒光強(qiáng)度降低超過(guò)了60%，而加入其它待測(cè)物熒光降低小于20%，表明Npd對(duì)PA有選擇性響應(yīng)(圖11a)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Npd對(duì)PA識(shí)別的抗干擾性，在過(guò)量的干擾物(40 μmol/L)存在下，測(cè)試了Npd(20 μmol/L)和PA(40 μmol/L)體系的熒光強(qiáng)度(圖11b)。圖中顯示，在干擾物存在下，加入PA后體系的熒光強(qiáng)度仍明顯降低，表明Npd對(duì)PA的識(shí)別受其它爆炸干擾物的影響較小。

圖11 Npd對(duì)PA的選擇性(a)和抗干擾性(b)

2.5 機(jī)理研究

采用1H NMR研究Npd對(duì)PA的識(shí)別機(jī)理。由于市售PA溶液價(jià)格昂貴且含量較低(0.1 g/L)，因此我們用對(duì)硝基苯酚代替PA。在Npd的CDCl3溶液加入對(duì)硝基苯酚后，a位置的質(zhì)子信號(hào)向高場(chǎng)位移了0.05，f位置向低場(chǎng)位移了0.05，g位置向低場(chǎng)位移了0.79，(圖12)，表明對(duì)硝基苯酚使Npd發(fā)生質(zhì)子化，兩者發(fā)生了強(qiáng)靜電作用，阻礙了Npd分子的ICT效應(yīng)，導(dǎo)致其熒光淬滅。

圖12 探針Npd的識(shí)別機(jī)制

2.6 Npd的細(xì)胞毒性

采用MTT法測(cè)試了Npd對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、人正常肝細(xì)胞HL-7702、人神經(jīng)母瘤SH-SY5Y、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29和人宮頸癌細(xì)胞Hela的體外抑制率，米托蒽醌(Mito)作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表1。在1 μmol/L和10 μmol/L濃度下，除了SH-SY5Y和Hela細(xì)胞外，Npd對(duì)五種細(xì)胞的抑制率均小于5%; 在50 μmol/L濃度時(shí)，抑制率較弱，在20%～30%之間; 在高濃度(100 μmol/L)下，細(xì)胞抑制率仍低于50%; 值得注意的是，Npd對(duì)正常肝細(xì)胞抑制率小于癌細(xì)胞。陽(yáng)性對(duì)照米托蒽醌在10 μmol/L濃度下對(duì)細(xì)胞的抑制率均大于65%，以上結(jié)果表明Npd的體外細(xì)胞毒性較低。

表1 化合物Npd對(duì)細(xì)胞的體外抑制率(%，n=3)

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)合成了一個(gè)萘酰亞胺衍生物Npd熒光探針并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征和功能評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，Npd是一種AIE分子，能夠在水溶液中對(duì)PA進(jìn)行檢測(cè)，其機(jī)制為PA的酸性使萘酰亞胺上的羰基質(zhì)子化，阻斷了Npd的ICT發(fā)射，導(dǎo)致熒光發(fā)生淬滅。該探針檢測(cè)限為2.09×10-6mol/L，對(duì)PA的識(shí)別不受其他爆炸物的干擾，且細(xì)胞毒性較低，能夠制備成試紙對(duì)PA進(jìn)行簡(jiǎn)便快速定性檢測(cè)，具有潛在的應(yīng)用前景。