錢 堃，楊丙成

(1.華東理工大學 藥學院，上海 200237；2.上海市醫(yī)藥學校，上海 200135)

親水作用色譜(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)是目前分離極性化合物最常用的色譜技術之一[1-2]。它采用強極性固定相、高比例有機相低比例水相的流動相實現(xiàn)了對極性化合物的有效分離分析。這克服了極性化合物在反相色譜柱上保留弱、在正相色譜柱上溶解度差的缺陷，且與質(zhì)譜等質(zhì)量型檢測器有很高的兼容性。因此，HILIC常被應用于蛋白質(zhì)組學、代謝組學和藥物分析等諸多領域。不同于反相色譜保留機理相對單一的特點，HILIC保留機理比較復雜，其分離選擇性改變主要借助于不同官能團的色譜柱來實現(xiàn)，而流動相組成相對單一。因此發(fā)展不同選擇性的固定相一直是該領域活躍的研究方向[3-4]。

硅膠由于剛性好、易于改性等優(yōu)勢而廣泛應用于液相色譜包括HILIC固定相的制備[5-6]。目前絕大多數(shù)HILIC固定相使用硅膠基質(zhì)。但在HILIC模式下，硅膠型固定相常存在明顯的柱流失。柱流失是指固定相在流動相中水解而造成基質(zhì)表面鍵合官能團或基質(zhì)分子脫落進入流動相中的現(xiàn)象。流失的組分通過質(zhì)量型檢測器(如質(zhì)譜、蒸發(fā)光檢測器、電噴霧檢測器)時就會造成基線噪聲和漂移的增加，這在梯度洗脫時尤為明顯[7]。柱流失現(xiàn)象在其他液相色譜模式中不太明顯，但在HILIC中非常顯著(這是其保留機理所造成的)。它甚至被稱為HILIC的阿喀琉斯之踵[8]。

為改善極性固定相的柱流失，已出現(xiàn)了很多方法，包括使用較大空間位阻的連接臂[9]、惰性介質(zhì)[10]、納米顆粒屏蔽[11]等。Armstrong等采用環(huán)果聚糖為連接臂，結合多點連接技術報道了一種高柱效、高穩(wěn)定性的極性固定相[9]。Liu 和Pohl 采用季胺型納米乳液涂覆在硅膠表面制備出混合型固定相[11]。作者課題組前期報道了使用聚乙烯醇(polyvinyl alcohol， PVA)涂覆苯基改性硅膠，可顯著降低柱流失。需要指出的是，該方法雖然在一定程度上提高了固定相的抗水解性能，但其柱流失仍然不太理想[12]。本文在前期基礎上，嘗試在PVA溶液加入戊二醛(glutaraldehyde，GA)交聯(lián)劑，通過PVA上的羥基與GA發(fā)生羥醛縮合反應，增強PVA膜對硅膠的保護作用，從而改善固定相抗流失性能。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：磁力攪拌器購于IKA設備有限公司(德國)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水泵，上海予英儀器有限公司(中國)；PH-070A型干培兩用箱，上海一恒科學儀器有限公司(中國)；SB-5200 DTDN型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司(寧波，中國)；Waters 2695型液相色譜儀(沃特世，美國)，包括自動進樣器和柱溫箱，2998型紫外可見光檢測器、EmpowerTMPro 2漢化版色譜工作站；賽默飛高效液相色譜儀Vanquish Flex配置電噴霧檢測器(charged aerosol detector， CAD)(美國)；裝柱機，大連思譜精工有限公司(中國)；實驗用水來自Milli-Q純水系統(tǒng)。

試劑：單分散乙烯基硅膠(Vinyl-Sil)(粒徑5 μm，孔徑10 nm，比表面積300 m2/g)購于華譜科技有限公司(浙江，中國)；鹽酸、無水甲苯、吡啶、PVA(1750±50)、25% GA水溶液購自上海凌峰化學試劑有限公司(上海，中國)；芐硫醇(98%)、核苷、二羥丙茶堿(99%)購于J&K百靈威科技有限公司(北京，中國)；HPLC乙腈(99.9%)、甲醇(99.8%)購自Tedia公司(Ohio，USA)；其它樣品均購自阿拉丁試劑上海有限公司(中國)。

1.2 固定相的制備

苯基改性硅膠制備方法參照以前方法[12]，其步驟簡述如下：稱取5 g乙烯基硅膠(Vinyl-Sil)超聲均勻分散在45 mL甲醇中，依次加入5 mL芐硫醇、50 mg AIBN，于N2保護下，65 ℃、250 r/min條件下加熱反應24 h。反應后用5#砂芯漏斗過濾后用二氯甲烷、甲醇、水依次沖洗，于60 ℃過夜干燥即得苯基改性硅膠(Bte-Sil)。

極性固定相的制備：稱取5 g PVA溶解在去離子水中，于500 r/min 100 ℃下加熱攪拌1 h即制得5% (w/v)的PVA澄清水溶液，控制其溫度在60 ℃待用；將上述反應中制備得到的Bte-Sil分散于甲醇中，抽濾后快速加入上述PVA水溶液中，接著加入0.5%戊二醛水溶液，超聲5 min使溶液均勻分散，再在60 ℃ 下加熱攪拌30 min，用5#砂芯漏斗減壓抽濾，抽濾至濾餅狀，并于140 ℃熱聚合1 h，后續(xù)輕微研磨、超聲分散即得到最終的極性固定相(PVA@GA-Bte-Sil)。固定相的制備路線如圖1所示：

圖1 極性固定相合成路線

1.3 色譜柱裝填

稱取上述極性固定相(2 g)，超聲分散于甲醇(20 mL)中，以甲醇作為頂替液恒壓(5 000 psi)裝柱30 min、泄壓30 min、使用甲醇在0.2 mL/min的流速沖洗過夜。

為便于對比，選取5根商品化HILIC色譜柱，包括裸硅膠、XIon、XAmide(華譜新創(chuàng)、浙江，中國)、Acclaim-10、Syncronis Amino(Thermofisher Corp.)，以及之前制作的PVA涂覆苯基改性硅膠色譜柱(PVA-Bte-Sil)[12]進行了平行比對；7種色譜柱規(guī)格均為4.6 mm× 150 mm，粒徑均為5 μm(除Acclaim-10使用3 μm)。

2 結果與討論

2.1 固定相結構表征

對得到的固定相進行了元素分析表征。相比于Bte-Sil的含碳量7.08%，通過PVA與GA交聯(lián)涂覆后得到的固定相PVA@GA-Bte-Sil的含碳量有明顯增加(12.44%)；固定相的紅外光譜表征結果如圖2所示，相較于Bte-Sil，PVA@GA-Bte-Sil光譜在2 947 cm-1有明顯的飽和C-H伸縮振動，進一步證明GA@PVA涂敷在Bte-Sil表面。

圖2 不同固定相紅外光譜

2.2 色譜性能評價

首先評估了PVA@GA-Bte-Sil在HILIC模式下分離極性化合物的性能。采用7種核苷作為測試樣品，并與3種商品化HILIC柱進行比較。如圖3(a)所示，PVA@GA-Bte-Sil對模型樣品均達到了基線分離，且表現(xiàn)出較高的柱效(比如對胞嘧啶的理論塔板數(shù)可達60 000/m)。與商品化色譜柱相比，保留時間略短，這可能是內(nèi)層苯環(huán)存在導致其還有一定的疏水性；另外，以小分子有機堿為模型樣品，將PVA@GA-Bte-Sil與之前報道的PVA-Bte-Sil(即無GA交聯(lián)的極性固定相)進行了分離對比。由圖3(b)可以看出，兩種固定相在保留時間、分離選擇性上幾乎完全相同。說明PVA@GA-Bte-Sil并沒有因為GA的引入而對固定相的親水性造成明顯影響。

圖3 PVA@GA-Bte-Sil分離核苷(a)和有機堿(b)條件：流動相：90%乙腈-10%甲酸銨溶液(200 mmol/L，pH 6.8)；流速：1 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長：254 nm；峰識別：1、尿嘧啶，2、5-甲基尿苷，3、尿苷，4、腺苷，5、腺嘌呤，6、胞嘧啶，7、胞苷；8、4-乙基苯胺，9、咖啡因，10、二羥丙茶堿，11、鹽酸小檗堿，樣品濃度：50～200 mg/L；進樣量：2 μL

以7種核苷評估了PVA@GA-Bte-Sil的日內(nèi)和日間穩(wěn)定性。其日內(nèi)保留時間相對標準偏差(relative standard diviation，RSD)為0.08%～0.17%，峰面積RSD為0.14%～0.50%(n=9)，顯示PVA@GA-Bte-Sil良好的重復性；另外，以4種水溶性維生素(對氨基苯甲酸、維生素B2、維生素B13、維生素B3)評價了其日間重復性：連續(xù)3天，每天進樣9次，共計27次(見圖4)。其保留時間RSD≤0.18%，峰面積RSD≤0.92%，進一步表明PVA@GA-Bte-Sil良好的日間重復性。

圖4 PVA@GA-Bte-Sil日間重復性(條件同圖3)

另外，選擇3種不同電荷狀態(tài)的樣品——尿嘧啶(中性)、煙酸(陰離子)和芐基三甲基氯化銨(Benzyl Trimethyl Ammonium Chloride，BTAC，陽離子)，采用相對于HILIC而言比較苛刻的流動相(75%乙腈-25% 60 mmol/L甲酸銨，pH 6.8)沖洗3 000倍柱體積考察了其穩(wěn)定性(見如圖5)。在此過程中，三種樣品的保留時間和峰面積RSD均分別低于1.02%和1.54%。

選取5種核苷樣品作為標樣，保持流動相中的緩沖鹽濃度不變，改變流動相中水含量考察了PVA@GA-Bte-Sil保留機理。結合文獻報道的HILIC保留機理擬合方程lnk=a+b× lnφ+c×φ求得的相關系數(shù)均不低于0.998 1，表明其保留符合典型HLIC機理。

2.3 柱流失測試

為考察PVA@GA-Bte-Sil抗流失性能，采用CAD實時檢測柱流出物的信號大小來評估流失大小。圖6是幾種色譜柱的在梯度洗脫模式下的柱流出物檢測結果(以PEEK管作為空白對照，抗流失性能較好的商品化柱Acclaim HILIC-10作為參照基準)。在10%和50%水相流動相條件下，PVA@GA-Bte-Sil都表現(xiàn)出了最低的低流失；以3～5 min內(nèi)10%水相和10～11 min內(nèi)50%水相測量色譜柱的背景信號和基線噪聲，結果見表1。在含高比例水相條件下，PVA@GA-Bte-Sil背景信號僅為1.46 pA，相當于Syncronis Amino(52.16 pA)的0.03倍，也遠低于Acclaim HILIC-10色譜柱和PVA-Bte-Sil?？梢钥闯?，通過PVA和GA共聚達到了改善柱流失的設計效果。

表1 柱流失檢測(基線背景與噪聲)

圖6 PVA@GA-Bte-Sil色譜柱與其他色譜柱柱流失對比

為了突出PVA@GA-Bte-Sil低柱流失的效果，選擇5種非還原性糖為分析對象，對比了其在PVA@GA-Bte-Sil和商品化XAmino的分離(見圖7)。在相同條件下，PVA@GA-Bte-Sil相對于XAmino不僅基線背景下降了約11倍，基線噪聲也有約9倍的下降，而且樣品信號也有明顯的增強，以D-核糖為例，其峰高從28.09 pA(XAmino)增加到131.22 pA(PVA@GA-Bte-Sil)?？偟慕Y果就是系統(tǒng)信噪比的顯著提升。

3 結論

通過在苯基改性硅膠表面引入GA和PVA共聚涂層制備出類核殼型極性固定相。所得固定相對常見極性化合物表現(xiàn)出良好的分離效果，其保留機理符合典型的HILIC機制，具有良好的抗流失性能和高的運行穩(wěn)定性。該方法將為制備包括硅膠在內(nèi)的其他基質(zhì)極性固定相提供了一種新方法。