高偉欣 黃火清 趙晶 張鑫 楊寧 楊浩萌

（中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

近年來，基因編輯技術已經成為生命科學領域最熱門的研究工具，其中CRISPR/Cas9基因編輯系統因具有成本低廉、操作簡單、編輯效率高等優(yōu)點，在動物、植物、微生物中都獲得了“井噴式”的研究和應用［1-2］。CRISPR/Cas9基因編輯系統可以完成DNA水平上的基因敲除、基因插入、單堿基編輯；并通過與DNA的結合，進行基因的抑制或激活，達到基因表達調控的作用；CRISPR/Cas9系統也可以應用在蛋白質的定向進化、代謝通路的優(yōu)化、表觀遺傳學分析、底盤菌株構建等方面，使過去耗時耗力的基因改造過程變得高效，節(jié)約了大量的人力、物力和財力［3-7］。

Cas9蛋白的本質是一種DNA內切酶，分子量158 kD左右，目前常用于基因編輯的Cas9蛋白多來源于Streptococcus pyogenes（化膿鏈球菌）［8］。Cas9蛋白與gRNA（guide RNA）可以在細胞內或體外自發(fā)組裝成核糖核蛋白復合體（RNP，ribonucleoprotein）。RNP可以“掃描”整個DNA序列，識別出與gRNA上互補的序列，并定位于PAM位點與互補序列上，使DNA雙鏈解開而形成R-loop結構，gRNA與互補鏈雜交，Cas9蛋白的HNH酶活性位點切割互補的DNA鏈，而RuvC活性位點將切割非互補鏈，最終使PAM序列上游3 nt處的DNA雙鏈斷裂，完成剪切過程［9-10］。

在對基因組DNA進行基因編輯時，Cas9蛋白和gRNA遞送進入細胞的方式一般有3種［11-12］。首先，也是最常用的方式，可以將它們的編碼基因克隆在特定質粒上，通過電轉、原生質體、農桿菌等轉化過程進入細胞，在細胞內完成轉錄、翻譯等過程，最終Cas9蛋白和gRNA結合，發(fā)揮基因編輯功能；其次是將編碼Cas9蛋白的mRNA和gRNA遞送進細胞中，通過翻譯合成蛋白并與gRNA結合而發(fā)揮功能；也可以將成熟的Cas9蛋白與gRNA一起在體外組裝成RNP，然后通過原生質體轉化、顯微注射等方法導入宿主細胞，同樣可以達到切割基因組上特定位點的目的［13］。目前，直接遞送RNP的基因編輯已經成功的應用于動物、植物、真菌等的細胞中。例如，在動物基因編輯研究中，對人的T細胞、小鼠的胚胎細胞中與疾病相關基因成功進行了敲除或突變。Wang等［14］研究表明，基于RNP的CRISPR/Cas9基因編輯是研究小鼠免疫系統中基因功能的一種有前景的新策略；Seki等［15］研究表明，采用基于RNP的CRISPR/Cas技術很大程度簡化了免疫治療的基因編輯過程。在植物的基因編輯研究中，如玉米、水稻、煙草等，成功對植物抗病基因進行了改造。Park等［16］應用RNP的基因編輯在較短時間內培育作物的新特性；Khatodia等［17］利用RNP技術使植物具有更持久更廣譜的病毒抗性。在里氏木霉、黑曲霉、青霉、稻瘟病菌等真菌的基因編輯研究中，基于RNP的CRISPR/Cas技術促進了酶蛋白、有機酸、抗生素等的生產［18-19］。Kuivanen等［20］研究表明基于體外組裝的RNP可以提高靶向效率并且改進了黑曲霉生產半乳酸的能力；Hao等［21］研究證明將Cas9/gRNA復合物轉化到里氏木霉中可以實現快速敲除基因的目的，在菌株改良和功能基因組學研究中有廣泛的應用。近年來，還發(fā)展出基于RNP的DNA內切酶體外活性的作物基因型分析技術、基于RNP的病原體檢測技術等，也為RNP的應用提供了新的思路［22-23］。但究竟如何獲得有活性的RNP，其詳細的體外構建、組裝和活性檢測的方法及注意事項卻很少報導，限制了RNP復合體在基因編輯中的應用。

本研究在大腸桿菌中成功表達了Cas9蛋白，同時，通過體外轉錄獲得敲除目標基因的gRNA，并獲得了Cas9蛋白和gRNA自發(fā)組裝的RNP復合體。經過對RNP復合體的體外活性驗證和在黑曲霉中的基因敲除驗證，結果表明RNP具有較好的DNA雙鏈剪切活性，在黑曲霉中成功敲除了目標基因，為進一步的菌種改造，提供了良好的材料并大大降低了試驗成本。

1 材料與方法

1.1 材料

黑曲霉F223菌株由本實驗室保存；表達宿主為大腸桿菌BL21（DE3），pEASY-blunt克隆載體購自北京全式金生物技術有限公司；pET28a（+）由本實驗室保存；pREDCas9質粒購自Addgene網站（Addgene #71541；https://www.addgene.org/71541/）。

商品化Cas9蛋白購自GenScript公司；重組酶購自北京全式金生物技術有限公司；硫酸卡那霉素和氨芐青霉素購自索萊寶生物科技有限公司；DNA 膠回收試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；DNA高保真聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；限制性核酸內切酶XhoI、SpeI和NcoI購自TaKaRa有限公司；真菌DNA提取試劑盒購自OMEGA公司；UniversAllTMTissue Extraction Kit快速基因組DNA提取試劑盒購自益生生技；T7轉錄試劑盒MEGAscriptTMT7 High Yield Transcription Kit購自invitrogen公司；RNA純化試劑盒購自天根生化科技有限公司；蛋白純化介質為Ni-NTA-agarose resin（Qiagen公司）；無填料層析柱購自NEB；蛋白含量測定試劑盒為北京全式金生物技術有限公司產品；蛋白質分子量標準為上海生化研究所產品；其它所用試劑為國產分析純試劑。

LB液體培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物、1%NaCl、1%蛋白胨；固體LB培養(yǎng)基另外加入2%的瓊脂粉；YPD液體培養(yǎng)基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、0.5%酵母提取物；CD固體培養(yǎng)基（pH 6.0）：2%葡萄糖、0.2%氯化鉀、0.3%硝酸鈉、0.05%七水硫酸鎂、0.1%磷酸氫二鉀、0.001%七水硫酸亞鐵、2%瓊脂粉；原生質體轉化后生長培養(yǎng)基（pH 7.0）：1 mol/L山梨醇、1%葡萄糖、2%瓊脂粉；發(fā)酵培養(yǎng)基（pH 6.0）：5%蔗糖、3%豆粕、2%玉米漿、0.1%硫酸鎂。

1.2 方法

1.2.1 載體的構建 以pREDCas9質粒為模板，以Pet-Insert-F和Pet-Insert-R為引物，用高保真聚合酶擴增cas9基因全長序列，并用膠回收試劑盒回收該PCR產物。同時，將pET28a（+）表達載體用XhoI和NcoI做雙酶切處理，37℃水浴反應1 h，酶切產物用膠回收試劑盒回收。將以上兩個回收片段與重組酶混合，50℃反應15 min，將重組產物轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，轉化方法參考說明書，將感受態(tài)細胞在37℃，200 r/min條件下孵育后涂在添加卡那霉素的固體LB平板上，將長出的單克隆進行PCR驗證并測序，最終獲得包含pET28a-Cas9-NLS表達載體的大腸桿菌BL21菌株。

提取黑曲霉F223的基因組DNA（詳見Fungal DNA Mini Kit 說明書），并以此為模板，以glucoamylase-F和glucoamylase-R為引物，高保真聚合酶擴增黑曲霉來源的糖化酶（基因編號：An03g06550）的DNA序列，用膠回收試劑盒回收該PCR產物，克隆到pEASY-blunt載體上，進行DNA測序，獲得正確的帶有glucoamylase基因的重組質粒，即pEASY-glucoamylase。重組質粒經SpeI酶切線性化，用于Cas9蛋白體外活性驗證。

以黑曲霉F223的基因組DNA為模板，以223up-F和223up-R為引物，高保真聚合酶擴增黑曲霉糖化酶上游同源臂；以223down-F和223down-R為引物，同樣獲得下游同源臂；以hph-F和hph-R為引物，擴增潮霉素抗性基因表達框。用引物223up-F和223down-R將上述3個片段進行融合PCR，膠回收試劑盒回收該PCR產物，獲得donor DNA。用引物hph-jc-F和hph-jc-R分別進行測序，驗證3個片段是否完成連接。本研究中所使用的引物及序列信息如表1所示。

表1 引物名稱及序列信息Table 1 Primer names and sequence information

1.2.2 重組Cas9蛋白的表達 將Cas9蛋白表達菌株活化，按1%接種量轉接至200 mL的LB液體培養(yǎng)基中，添加卡那霉素至終濃度為50 μg/mL。將其在37℃條件下，200 r/min搖床培養(yǎng)大約3 h，至OD600=0.6-0.8；加入0.5 mmol/L IPTG誘導蛋白表達，在30℃條件下，200 r/min搖床誘導大約5 h；將菌體在12 000 r/min條件下，離心3 min，用20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液洗一遍菌體，于-20℃冰箱凍存。

1.2.3 重組Cas9蛋白的純化 凍存的菌體用破碎緩 沖 液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）懸 浮 定 容至20 mL，進行超聲破碎，樣品參數設置為：功率30%，超聲5 s，間隔5 s，總時間為30 min。破碎后在12 000 r/min離心10 min，取上清進行純化。Cas9蛋白純化的填料使用Qiagen公司的Ni-NTA-agarose resin，吸取5 mL Ni-NTA-agaroseresin 于空柱子中，注意樹脂與墊片間不要留有空隙和氣泡。使用含20 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L imidazole，500 mmol/L NaCl，pH 8.0） 洗5個柱體積，去除雜蛋白，用500 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L imidazole，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）洗脫并收集Cas9蛋白。使用100 000 MW CO蛋白超濾管，將洗脫緩沖液替換為蛋白存儲液（20 mmol/L Hepes，pH 7.5，150 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，10%glycerol）。最后使用蛋白含量測定試劑盒對純化前后的蛋白樣品進行定量及SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 gRNA體外轉錄和純化 使用E-CRISPR網站（http://www.e-crisp.org/E-CRISP/）選擇黑曲霉來源糖化酶基因內部的PAM序列，對gRNA和對照cgRNA進行DNA模板合成（北京博邁德基因技術有限公司）。使用合成的DNA為模板，T7轉錄試劑盒轉錄出gRNA和對照cgRNA；具體反應體系如下：DNA模 板200 ng、ATP/UTP/CTP/GTP各4 μL、10× Reaction Buffer 4 μL、Enzyme Mix 4 μL，總 體積40 μL，37℃反應4 h 或過夜，轉錄后的gRNA和cgRNA稀釋100倍，用NanoDrop測定濃度。使用RNA純化試劑盒對轉錄獲得的gRNA和cgRNA進行純化，純化后的產物洗脫體積控制在20 μL，純化后的gRNA用NanoDrop測定濃度。RNA體外轉錄模板的序列信息如表2所示。1.2.5 RNP復合體體外活性驗證 取純化后的gRNA（或cgRNA）與Cas9蛋白（或商品化的Cas9蛋白，即cCas9）及線性化的pEASY-glucoamylase質粒DNA混合，反應緩沖液為20 mmol/L Hepes，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L EDTA，pH 6.5，反應總體積為20 μL，在37℃條件下反應1 h，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測線性化質粒的切割情況。具體試驗步驟如下：

表2 RNA體外轉錄模板的序列信息Table 2 Sequence information of in vitro transcription templates of RNA

首先，設計7個陰性對照試驗。分別為線性化質粒DNA；DNA與重組表達的Cas9蛋白；DNA與cCas9蛋 白；DNA與gRNA；DNA與cgRNA；DNA與cgRNA和Cas9蛋白；DNA與cgRNA和cCas9蛋白混合。在37℃條件下反應2 h以上，質粒的添加量都為200 ng，反應總體積為25 μL，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。

其次，試驗組分為兩組，第一組以商品化的Cas9蛋白為試驗對象，第二組以純化的重組Cas9蛋白為試驗對象，每組的Cas9蛋白和gRNA的添加量均如表3中所示。反應總體積為25 μL，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測線性化質粒的切割情況。

表3 RNP復合體活性驗證試驗組反應體系Table 3 Reaction system of test group for RNP complex activity verification

1.2.6 RNP復合體體內活性驗證 為了驗證RNP復合體的體內活性，采用原生質體轉化法，將RNP和帶潮霉素篩選標記的donor DNA共同轉化至黑曲霉糖化酶生產菌株中。黑曲霉原生質體的轉化方法參考van等［24］方法。首先將黑曲霉菌絲接種于YPD液體培養(yǎng)基，32℃搖床振蕩培養(yǎng)2 d，成為均勻的小球。將其通過目篩過濾取小球，用無菌水沖洗干凈后，取適量菌體加入到原生質體酶解液中，30℃，70 r/min蕩培養(yǎng)2 h收集原生質體?；旌细?0 μg的gRNA和純化得到的Cas9，在37℃條件下孵育30 min，總體積為10 μL，即得到RNP復合體。以PEG介導的原生質體轉化法將20 μL回收產物donor DNA和10 μL RNP復合體共同轉入黑曲霉中。轉化子在潮霉素平板中，32℃培養(yǎng)2-3 d后，挑取轉化子至24孔板中，用于陽性轉化子的篩選。

首先通過PCR鑒定轉化子，用快速提取基因組試劑盒提取基因組DNA，用引物GA223homo-downjc-F和hph-jc-R檢測潮霉素基因hph是否被整合到黑曲霉基因組中，篩選陽性轉化子。挑取陽性轉化子到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d后取樣。收集上清發(fā)酵液，進行SDSPAGE分析。

2 結果

2.1 載體的構建

以pREDCas9質粒為模板，成功擴增了cas9基因全長序列，并在cas9基因3'端通過引物加入了21 bp的核定位信號序列（NLS），該序列編碼含7個氨基酸的短肽，能使Cas9蛋白和gRNA復合物（RNP）被識別并通過親水性的核孔復合物進入細胞核而發(fā)揮功能；在核定位信號序列3'端引入了6個His-Tag蛋白純化標簽，便于純化。將該片段和用XhoI與NcoI進行雙酶切處理的pET28a（+）載體進行重組轉化，經過測序驗證，最終獲得了pET28a-Cas9-NLS表達載體。

以黑曲霉F223的基因組DNA為模板，擴增得到了黑曲霉來源糖化酶（基因編號：An03g06550）的DNA序列，獲得重組質粒pEASY-glucoamylase，并且經過SpeI酶切成為線性化DNA片段。

以黑曲霉F223的基因組DNA為模板，擴增獲得了黑曲霉糖化酶基因上/下游同源臂序列與實驗室保存的潮霉素抗性基因表達框進行融合PCR，產物進行測序驗證為正確，成功獲得了donor DNA。

2.2 重組Cas9蛋白的表達與純化

經IPTG誘導，細胞破碎和鎳柱純化，對純化后的Cas9蛋白樣品進行SDS-PAGE分析（圖1），Cas9蛋白的理論分子量為158 kD，與蛋白電泳中條帶位置相符，說明重組Cas9蛋白在大腸桿菌中成功表達，并獲得較純的蛋白樣品。Cas9蛋白最終的得率：共8 mL Cas9蛋白洗脫液，測得蛋白濃度約400 μg/mL，原發(fā)酵液為200 mL，得率大約為16 mg/L。

圖1 重組Cas9蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDA-PAGE analysis of recombinant Cas9

2.3 gRNA的轉錄與純化

合成的gRNA和對照cgRNA體外轉錄模板的序列信息見表2。其中特異識別糖化酶基因的20 nt核酸序列用小寫字母標注，5'端T7啟動子序列為黑體序列，3'端gRNA非識別區(qū)序列為斜體序列，將該完整序列進行DNA合成，同時選擇另一個在黑曲霉基因組和體外驗證用質粒上都不存在的20 nt核酸序列作為對照序列，同樣合成對照DNA。

按照T7轉錄試劑盒操作，獲得的gRNA和cgRNA終濃度均為10 μg/μL左右；經RNA純化試劑盒純化，gRNA和cgRNA終濃度為5-15 μg/μL左右，該濃度不能太低，否則會導致反應體積過大，剪切效率下降。

2.4 RNP復合體的體外活性驗證

如圖2-A核酸電泳所示，在7個陰性對照組中，每個反應都在37℃反應2 h以上，都沒有發(fā)生DNA被剪切的情況，該試驗結果表明，Cas9蛋白、gRNA與線性化質粒缺少任何一個，都無法完成剪切反應；另外，因為cgRNA無法識別線性化質粒上的PAM位點，無論其是與重組Cas9蛋白還是商品化的cCas9分別反應時，線性化DNA也都不能被切割。

如圖2-B所示，試驗組分為兩組，第一組以商品化的cCas9蛋白為試驗對象，第二組是以純化的重組Cas9蛋白為試驗對象。每個試驗組中的Cas9蛋白與gRNA的量按從200 ng到6.4 μg共設了6個反應。當Cas9蛋白與gRNA的量為800 ng時，核酸電泳顯示已經有微弱的DNA條帶被切割下來，分子量約1.4 kb，與gRNA的識別位點切割DNA后預測大小一致。在隨著Cas9蛋白與gRNA的量不斷增加時，線性化DNA被切割的更加完全，圖中1.4 kb大小的DNA片段的亮度明顯增加，未被切割的剩余線性化質粒的分子量也明顯降低。由此結果說明，當DNA、Cas9蛋白、gRNA同時存在的情況下，Cas9蛋白與gRNA結合形成RNP，此時Cas9才能發(fā)揮剪切作用；另外，隨著RNP復合體濃度的提高，剪切效果更加的明顯；但是當RNP濃度提高到一定程度時，線性化質粒被完全切割，剪切反應受底物量的限制也會達到平臺期，再增加RNP濃度也不會再對質粒的非識別位點進行切割。由此表明，gRNA識別位點的專一性保證了RNP復合體沒有發(fā)生脫靶切割；在大腸桿菌中表達并且純化的重組Cas9蛋白與商業(yè)化Cas9蛋白具有相似的剪切效果，證明重組Cas9蛋白同樣有良好的核酸酶活性。最后，確定了RNP活性檢測的最適反應體系為gRNA/Cas9 蛋白的質量各1.6 μg。在25 μL的反應體系中，37℃反應1 h后，可以對200 ng DNA底物充分進行剪切。

圖2 RNP復合體體外活性驗證Fig.2 In vitro activity verification of RNP complex

2.5 RNP復合體的體內活性驗證

對黑曲霉轉化子進行PCR驗證，檢測引物和RNP復合體基因編輯示意見圖3。在11個轉化子的核酸電泳圖4中，與對照原始菌株CK相比，靶向的糖化酶基因內部明顯被插入潮霉素抗性標簽，獲得了特異的1.4 kb左右條帶，這些條帶經測序驗證，潮霉素抗性基因hph成功插入RNP在基因組上的剪切位點內。

圖3 RNP復合體體內編輯過程示意圖Fig.3 Schematic diagram of RNP complex editing process in vivo

圖4 陽性轉化子的PCR驗證Fig.4 Verification of positive transformants by PCR

對PCR陽性轉化子發(fā)酵液上清進行SDS-PAGE分析。如圖5所示，幾乎所有轉化子的糖化酶蛋白條帶消失，8號轉化子與對照菌株相比，糖化酶蛋白條帶減弱，說明當將RNP復合物和donor DNA一同轉化至黑曲霉中，在RNP復合物的作用下，可以在黑曲霉中實現高效定向整合并敲除目標基因。

圖5 轉化子發(fā)酵液上清的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of supernatant of transformant fermentation broth

3 討論

RNP復合體介導的基因編輯技術開啟了CRISPR/Cas9系統應用的新篇章，成為提高編輯效率、降低脫靶率和免疫反應的有效手段［25］。利用RNP復合體進行基因編輯，不存在外源基因整合進基因組的風險，在細胞內也不會進行RNA的轉錄和蛋白質的翻譯，減少了Cas9蛋白在細胞內停留的時間，減少了Cas9蛋白對宿主細胞的毒性和免疫反應；同時，RNP復合物可以提高gRNA的穩(wěn)定性，降低了gRNA和Cas9蛋白無法進入同一細胞核的概率，也降低了Cas9蛋白的脫靶率；RNP復合體在完成DNA剪切之后會被細胞內的蛋白酶、核酸酶等降解，在細胞中無殘留，可以反復使用RNP轉化同一宿主細胞，達到迭代進化的效果；由于gRNA是體外轉錄的，不受合成量和種類的限制，可以在一次轉化過程中使用多個gRNA錨定不同的目標基因，同時進行多個基因的編輯，提高基因編輯效率，加速細胞進化過程［26-27］。

雖然具有以上優(yōu)勢，有剪切活性的RNP復合體的獲得卻并不簡單，在試驗設計中需要注意以下幾點：（1）Cas9蛋白的基因來源于古細菌，在大腸桿菌中表達需要注意基因中密碼子的偏好性。本研究中的cas9基因來源于pREDCas9質粒，該基因已經完成大腸桿菌密碼子優(yōu)化，適于在大腸桿菌中表達，并提高蛋白的表達量；（2）對20 nt的識別位點進行選擇時，應該與基因組數據庫進行比較，選擇在基因組上單一的靶位點，避免基因編輯過程中的脫靶和非靶基因突變，為了提高試驗效率，一般選擇兩個以上的20 nt的識別位點進行試驗，從中選擇剪切效果好，專一性高的識別位點；（3）gRNA的體外轉錄使用了T7啟動子，保證其轉錄效率的最短序列為：TAATACGACTCACTATAGGG；（4）本研究用到的gRNA的轉錄模板DNA為基因合成，成本較高，后期的試驗可以利用該模板DNA構建gRNA 轉錄用“骨架質粒”，不同識別位點的gRNA只需合成一對引物，更換20 nt識別序列即可合成新的gRNA，可以有效節(jié)約試驗成本。

當然，獲得具有活性的RNP復合體后，下一步面臨的問題是如何將其遞送進宿主細胞。有研究表明，RNP復合體可以通過物理方式，如電穿孔、核轉染、顯微注射等方法導入細胞，但對細胞有一定的傷害；也可以通過化學方法如聚乙二醇（PEG）介導的原生質體轉化、聚乙烯亞胺、樹枝狀聚合物等介導的轉化等方法，但對不同的細胞也會有不同的毒性；另外還有納米載體介導的RNP復合體遞送等其他方法，在動物、植物、微生物、藻類等不同物種中都成功的進行了基因編輯，這些研究成果，為我們的后續(xù)試驗提供了有效的手段和寶貴的經驗［26］。本試驗通過采用聚乙二醇（PEG）介導的原生質體的轉化方法，將RNP復合體和供體DNA一同轉化至黑曲霉中，根據現有實驗結果，RNP復合體在體外可以剪切目的基因，在黑曲霉體內也使目的基因表達的相應蛋白條帶消失，都說明RNP復合體確實在體外和體內都發(fā)揮了基因編輯的作用；通過對轉化子的基因組DNA的提取和PCR鑒定，在目的基因上確實整合了潮霉素的篩選標記，與推測的剪切位點和插入位點的PCR條帶大小基本一致；我們隨機對3個PCR產物進行了測序，確實是在設計的位點上進行了切割和插入，因此體外和體內驗證結果一致，都達到了定點剪切的目的，并且基因編輯效率也比較高。

之所以選擇黑曲霉作為體內驗證實驗的受體菌株，是因為黑曲霉作為絲狀真菌，是發(fā)酵工業(yè)的重要生產菌株，已經被廣泛應用于生產各種酶制劑和有機酸等［28］。例如，全球市場上60%的檸檬酸是通過黑曲霉發(fā)酵生產的；據不完全統計，有30多種工業(yè)用酶制劑都可以通過黑曲霉菌株進行工業(yè)化生產［29］。利用RNP介導的基因編輯工具對黑曲霉工業(yè)菌株進行改造，可以達到提高菌株優(yōu)化效率的目的，對黑曲霉的工業(yè)化應用具有深遠的意義。下一步，我們將對RNP在體內基因編輯的條件進行優(yōu)化，進一步提高編輯效率、降低脫靶率。

4 結論

本研究獲得了具有較好剪切活性的RNP復合體，其中純化的Cas9蛋白具有與商品化Cas9蛋白相似的作用效果，使試驗成本大幅度降低；gRNA的轉錄采用T7轉錄試劑盒，使gRNA合成的質量得到保證，同時可以針對不同的目標基因合成不同的gRNA，積累成“gRNA庫”，為后續(xù)試驗提供便利。RNP復合體的體外活性檢測方法可以在體外直觀的檢測到核酸剪切的過程，也為RNP復合體在基因編輯之外的基因型分析、病毒檢測、活體成像等方面的應用奠定了基礎；RNP復合體的體內活性檢測，選擇工業(yè)生產糖化酶的黑曲霉菌株，從SDS-PAGE上直觀看到蛋白條帶的消失，說明該方法對表達量極高的蛋白也能成功完成基因敲除，為進一步的菌株改造奠定了基礎。