周雪敏 康麗鵑 郭永妮 楊笑含 蔣易龍 王澤龍 孫倩 康波

（四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，成都 611130）

多胺主要包括腐胺、亞精胺和精胺［1］，三者在鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）、亞精胺合成酶（spermidine synthase，SPDS）、精胺合成酶（spermine synthase，SPMS）、亞精胺/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn) 移 酶（spermidine/spermine N 1 -acetyltransferase，SSAT）、乙酰多胺氧化酶（acetylpolyamine oxidase，APAO）、精胺氧化酶（spermine oxidase，SMO）等多胺合成代謝相關酶作用下，相互轉(zhuǎn)換以維持多胺池的穩(wěn)態(tài)［2］。多胺具有調(diào)控動物生長發(fā)育、繁殖和衰老等多種生物學功能［3-4］。近年來研究表明，多胺在細胞增殖過程中必不可少［5］，可參與調(diào)控組織再生和發(fā)育過程。多胺能促進小鼠骨骼肌的修復、纖維化和組織重塑［6］，調(diào)節(jié)肌源性分化［7］，對肌肉組織再生［8］和發(fā)育具有重要調(diào)控作用；多胺代謝異常會導致肌肉發(fā)育不良、肌肉肥大和萎縮［9］。骨骼肌的生長發(fā)育狀況是家禽產(chǎn)肉性能的重要影響因素［10］，家禽出生后的骨骼肌增重迅速，其生長主要由肌纖維肥大和衛(wèi)星細胞增殖融合引起［11］，表現(xiàn)為肌纖維的增粗和增長。肌源性調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs）主要包括肌源性因子5（myogenic factor 5，Myf5）、生肌決定因子1（myostatin1，MyoD1）和肌細胞生成素（myogenin，MyoG）等［12］，它們調(diào)控了整個肌肉發(fā)育過程［13］。胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是調(diào)節(jié)骨骼肌合成代謝和分解代謝的關鍵生長因子［14］；肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）基因，是一種骨骼肌生長發(fā)育的負調(diào)控因子，其功能和表達量的變化也可能會造成肌肉重量的變化［15］。然而，這些調(diào)控肌肉發(fā)育的關鍵基因在鴨出生后的表達規(guī)律及其與多胺調(diào)控禽類肌細胞增殖分化、骨骼肌發(fā)育的研究尚不完全清楚。

因此，本研究檢測不同日齡鴨肌肉組織多胺含量、多胺代謝和肌肉發(fā)育相關基因表達量的變化，探究肌肉組織多胺代謝和肌肉發(fā)育相關基因表達的規(guī)律及其相關性，為闡明多胺調(diào)控鴨肌肉發(fā)育作用機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

四川農(nóng)業(yè)大學水禽育種場提供同批孵化的農(nóng)華麻鴨30只（雌雄各半），日糧營養(yǎng)水平和管理方式均一致。分別在出雛后的0、30、60、90和120日齡采集鴨胸肌和腿肌組織并迅速凍于液氮，而后存放至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。本實驗的動物使用已通過四川農(nóng)業(yè)大學動物護理和使用委員會的倫理審查和批準。

1.2 方法

1.2.1 組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 使用Tirzol（TaKaRa，大連）法提取鴨胸肌和腿肌總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。按照RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）說明書，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 肌肉發(fā)育、多胺代謝相關基因的RT-qPCR檢測分析 應用GenBank下載目的基因序列，使用Primer Premire 5.0軟件設計引物后利用Oligo 12對設計的引物評價，整理后送到擎科生物科技有限公司進行合成，引物信息如表1。以不同日齡的鴨胸肌和腿肌cDNA為模板，采用PCR反應體系（10 μL）：0.5 μL的cDNA模板，上下游引物各0.2 μL，SYBR Green 5.0 μL，去RNase水4.1 μL。反應條件：95℃，30 s；95℃，5 s；退 火，30 s；95℃，15 s；60℃，30 s。

表1 實驗所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

1.2.3 高效液相色譜檢測多胺含量 取0.1g鴨肌肉組織浸泡于0.5 mL的5%高氯酸，加入10 μL的1，6-己二胺研磨充分，取上清；上清液中加入2 mL 2.5% NaOH和4 μL的苯甲酰氯，漩渦振蕩均勻，置于40℃水浴鍋衍生30 min，將pH調(diào)至7.0；用15 mL超純水和15 mL 15%甲醇潤洗C18固相萃取柱，再用萃取柱過濾衍生液，接著用0.5 mL甲醇洗脫樣品；0.22 μm針頭過濾器過濾洗脫液后4℃避光保存。以流速0.5 mL/min，紫外檢測器檢測波長229 nm；柱溫25℃，流動相組成水∶甲醇=38∶62（V∶V）作為高效液相色譜檢測條件。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 利用2-??Ct法，以GAPDH作為內(nèi)參基因，計算不同日齡組鴨肌肉組織中目的基因的相對表達量，運用SAS 9.0統(tǒng)計軟件ANOVA過程進行方差分析和Duncan多重比較，數(shù)值以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。使用Origin 軟件對不同日齡鴨肌肉組織多胺代謝和肌肉發(fā)育相關基因表達量進行Pearson Correlation相關性分析和繪圖。數(shù)值以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 不同日齡鴨肌肉組織多胺含量的變化規(guī)律

如圖1和圖2所示，0日齡鴨胸肌組織多胺含量最高（P<0.05），30日齡時顯著下降（P<0.05），60 日齡鴨胸肌組織腐胺和亞精胺含量繼續(xù)下降，之后無顯著變化，而鴨胸肌精胺含量則自此開始無顯著變化（P>0.05）。如圖2所示，0日齡鴨腿肌組織多胺含量最高（P<0.05），30日齡時下降，之后隨日齡增加，無顯著變化（P>0.05）。

圖1 不同日齡鴨胸肌組織多胺含量的變化規(guī)律Fig. 1 Changes of polyamine contents of different aged duck pectoralis

圖2 不同日齡鴨腿肌組織多胺含量的變化規(guī)律Fig. 2 Changes of polyamine contents in different aged duck leg muscles

2.2 不同日齡鴨肌肉組織多胺代謝相關基因表達量的變化規(guī)律

如圖3、圖4所示，胸肌ODC和SPMS基因表達量在0日齡時最高（P<0.05），而后下降，到60日齡時表達量最低（P<0.05），隨后ODC和SPMS基因表達量上升，90日齡的表達量顯著高于60日齡（P<0.05），而與120日齡時的表達量無顯著差異（P>0.05）；SPDS和APAO基因表達量隨著日齡增加先下降后上升，SPDS基因表達量在0日齡時最高，30日齡和60日齡時下降，但30日齡和60日齡的表達量無顯著差異（P>0.05），隨后SPDS表達量逐漸上升，120日齡的表達量顯著高于90日齡，而顯著低于0日齡時的表達量（P<0.05），APAO基因0日齡的表達量僅次于120日齡時達到的最大表達量（P<0.05），30、60和90 日齡表達量的變化趨勢與SPDS的表達規(guī)律一致；SSAT和SMO基因表達量在0日齡時最高而后下降，SSAT下降到60日齡后保持不變（P>0.05），SMO下降至30日齡后保持不變（P>0.05）。如圖4所示，腿肌中多胺合成基因都具有先升高后降低再升高的規(guī)律，但存在一定時間差異，ODC第一次升高在30日齡（P<0.05），而后下降，最后在120日齡時達到最高（P<0.05），SPDS和SPMS第一次升高在60日齡（P<0.05），最后在120日齡時達到最高（P<0.05）；多胺代謝相關基因SSAT和SMO表達量都呈先下降后不變最后再升高的規(guī)律，SSAT基因表達量0日齡時最高（P<0.05），30日齡時顯著降低，但與60日齡和90日齡時表達量無顯著差異（P>0.05），隨后上升至與0日齡時無顯著差異（P>0.05），APAO基因表達量0日齡時最高（P<0.05），30日齡時下降，從60 日齡開始隨日齡增加，逐漸上升并在120日齡時上升至與0日齡時無顯著差異（P>0.05）。

圖3 不同日齡鴨胸肌中多胺代謝相關基因表達量變化Fig. 3 Expression changes of of polyamine metabolism related gene in different aged duck pectoralis

圖4 不同日齡鴨腿肌中多胺代謝相關基因表達量變化Fig. 4 Expression changes of polyamine metabolism related gene in different aged duck leg muscles

2.3 不同日齡鴨肌肉組織發(fā)育相關基因表達量的變化規(guī)律

以RT-qPCR方法對鴨胸肌和腿肌肌肉發(fā)育相關基因的表達進行檢測分析，結果如圖5、圖6所示。胸肌中MyoD1和Myf5基因均在0日齡時表達最高（P<0.05），而后下降，到60日齡和90日齡時表達較低，而后相比于60日齡表達略有上升；MyoG和IGF-1基因在0日齡時表達較高，30日齡時達到最高（P<0.05），60日齡時表達降低，而后不發(fā)生顯著變化；而MSTN基因表達量在30日齡時顯著下降達到最低，60日齡時逐漸上升，到90日齡時最高而后又下降。腿肌中，MyoD1基因表達在90日齡和120日齡時升高；Myf5基因在30日齡和60日齡時下降，90日齡和120日齡時略有升高；MyoG基因表達量在30日齡時升高而后趨于不變；MSTN基因在90日齡時升高，120日齡時達到最高。

圖5 不同日齡鴨胸肌中MyoD1、Myf5、MyoG、IGF-1和MSTN基因表達量變化Fig. 5 Changes of MyoD1，Myf5，MyoG，IGF-1 and MSTN gene expressions in different aged duck pectorales

圖6 不同日齡鴨腿肌中MyoD1、Myf5、MyoG和MSTN基因表達量變化Fig. 6 Expression changes of MyoD1，Myf5，MyoG and MSTN gene in different aged duck leg muscles

2.4 不同日齡鴨肌肉發(fā)育相關基因與多胺代謝基因表達量的相關性分析

對不同日齡鴨肌肉發(fā)育相關基因和多胺代謝基因表達量進行兩兩相關性分析，由表2和表3可知，列入r2值大于等于50%的兩兩配對。相關性分析表明，鴨胸肌中MyoD1基因與SPMS、SPDS、SSAT、SMO基因的相關系數(shù)分別0.733 24、0.846 36、0.810 69和0.827 96，且 差 異 極 顯 著（P<0.01）；Myf5基因與SPMS、SPDS、SSAT、SMO基因的相關系數(shù)分別為0.946 4、0.827 96、0.945 63和0.916 11，且差異極顯著（P<0.01）。鴨腿肌中ODC基因與MyoD1、MSNT基因的相關系數(shù)分別達到0.746 32和0.919 39，且差異極顯著（P<0.01）。

表2 胸肌中肌肉發(fā)育相關基因與多胺代謝基因表達量的相關系數(shù)Table 2 Correlation coefficient between expressions of polyamine metabolism and muscle development genes in breast muscle

表3 腿肌中肌肉發(fā)育相關基因與多胺代謝基因表達量的相關系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between expressions of polyamine metabolism and muscle development genes in leg muscle

3 討論

3.1 鴨胸肌和腿肌組織多胺含量的變化

近年來研究表明，多胺可參與調(diào)控組織再生和發(fā)育過程。多胺能夠促進細胞增殖，對細胞生長必不可少［16］，在生長迅速的組織中其含量明顯高于其他組織［5］。多胺可促進骨骼肌成肌細胞分化，增強小鼠坐骨神經(jīng)切斷后的代償性肌肉肥大［7］。多胺及其前體處理可提高牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖率和增殖相關基因的表達［17］，以及牛衛(wèi)星細胞分化相關基因豐度［18］。多胺可以改善因年齡、氧化應激造成的肌肉萎縮和肌肉營養(yǎng)不良［19］。作為多胺的一種，亞精胺能誘導骨骼肌衛(wèi)星細胞自噬從而促進細胞增殖［20］。研究發(fā)現(xiàn)，鴨胸肌和腿肌生長發(fā)育存在一定的性別和品種的差異，高郵鴨和金定鴨的胸肌重拐點日齡為52日齡，腿肌重拐點日齡為16 日齡［21］；北京鴨兩個品系的胸肌重拐點日齡在36-41日齡，腿肌重拐點日齡在20-23 日齡［22］；烏嘴白羽優(yōu)質(zhì)肉鴨胸肌重和腿肌重的拐點日齡，公鴨為50.4日齡、27.3日齡，母鴨為46.2日齡、25.2 日齡［23］，這些結果提示雛鴨胸肌、腿肌的快速生長期分別在60日齡和30 日齡以前。我們的結果發(fā)現(xiàn)，0日齡和30日齡鴨胸肌組織中以及0日齡鴨腿肌組織中多胺含量較高，提示在鴨胸肌和腿肌快速生長時期，多胺可能促進肌肉細胞增殖和分化，進而參與調(diào)控肌肉組織的生長發(fā)育。然而，出生后的鴨肌肉發(fā)育主要是肌肉衛(wèi)星細胞的增殖、再生和肥大，30 日齡相比于0日齡的胸肌增重是增加的，多胺含量是下降的，由于我們?nèi)狈喰丶『屯燃≈氐墓拯c日齡及其前后日齡的多胺含量檢測，所以胸肌和腿肌增重與多胺含量變化是否存在相關性還有待進一步研究。

3.2 鴨胸肌和腿肌多胺代謝相關基因表達量的變化

多胺合成代謝基因ODC、SPDS、SPMS及多胺分解代謝相關基因SSAT、APAO、SMO調(diào)控腐胺、精胺和亞精胺三者相互轉(zhuǎn)化［24］，進而調(diào)控多胺代謝在機體內(nèi)保持動態(tài)穩(wěn)定，這與細胞正常增殖和組織生長息息相關［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，鴨胸肌中的多胺代謝相關基因，除APAO外均在0日齡時表達最高，說明0日齡時多胺合成及分解代謝較為旺盛。ODC和SPMS基因表達模式相似，均在0日齡時最高，而后下降，到60日齡時表達最低，而后表達上升無顯著變化；SPDS和APAO表達模式類似，表現(xiàn)為30日齡時下降，60日齡時保持不變，90日齡和120日齡逐漸上升；SSAT和SMO基因表達在0日齡時最高而后下降，SSAT下降到60日齡后保持不變，SMO下降至30日齡后保持不變，而鴨胸肌中多胺含量先下降后不變的規(guī)律，提示胸肌中多胺代謝相關基因呈一定規(guī)律性變化調(diào)節(jié)著多胺池的穩(wěn)態(tài)。鴨腿肌中，ODC基因表達趨勢表現(xiàn)為30日齡時升高，60日齡時下降，90日齡時不變，120日齡時又上升至最高；SPDS和SPMS基因表達規(guī)律一致，表現(xiàn)為60日齡時升高，90日齡時下降，120日齡時上升至最高；SSAT和SMO基因表達規(guī)律相似，表現(xiàn)為先下降后不變，再上升到120日齡時達到最高，而APAO基因表達量先不變再上升至120日齡時達到最高，提示腿肌多胺代謝相關基因呈一定規(guī)律表達并調(diào)控多胺池的穩(wěn)定。同時，我們發(fā)現(xiàn)胸肌和腿肌多胺代謝相關基因表達有著不同的規(guī)律，這可能由于胸腿和腿肌起源、發(fā)育速度以及快肌和慢肌分布不同［26］造成的組織差異性。

3.3 鴨胸肌和腿肌多胺代謝基因與肌肉發(fā)育相關基因表達量的相關性

出生后早期階段，衛(wèi)星細胞的增殖和融合可使肌核數(shù)量增加，有助于肌肉生長，而出生后期及成年后肌肉的肥大則不伴隨肌核數(shù)量的改變和衛(wèi)星細胞的增殖和融合［27］。MyoD1和Myf5在成肌細胞增殖、轉(zhuǎn)化及肌纖維形成過程有重要作用［28］，在成年后可通過其表達判斷肌肉增殖和肥大［29］。MyoD1過度表達會抑制成肌細胞增殖并加快成肌纖維細胞的成熟［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，鴨胸肌的MyoD1和Myf5基因表達量在0日齡時最高，30日齡時下降，60日齡時繼續(xù)下降，與腐胺、亞精胺含量變化規(guī)律和多胺相關代謝基因（ODC、SPMS、SPDS、SSAT）表達規(guī)律一致，可能在早期參與衛(wèi)星細胞增殖融合的肌肉生長過程；而后相比于60日齡和90日齡，120日齡時胸肌中MyoD1、SPDS和APAO基因顯著升高，推測MyoD1、SPDS和APAO基因在生長發(fā)育后期參與肌肉的成熟和肥大；另外，相關性分析表明MyoD1和Myf5基因與鴨胸肌多胺代謝基因（SPMS、SPDS、SSAT、SMO）存在顯著正相關，提示多胺代謝基因（SPMS、SPDS、SSAT、SMO）與MyoD1和Myf5基因共同參與鴨胸肌的發(fā)育。MyoG同樣是MRFs成員，作為骨骼肌發(fā)育的正調(diào)控因子，促進肌細胞增殖形成肌纖維［17］，主要影響產(chǎn)肉性能［31］。IGF-1可促進骨骼肌干細胞的增殖、肌細胞的分化以及融合成肌管［32］，也與肌肉質(zhì)量增加密切相關，是唯一能在肌肉再生和肥大中起關鍵作用的生長因子［33］。胸肌中，MyoG和IGF-1基因在30日齡時達到最高，提示30日齡時是胸肌發(fā)育的重要時期。MSTN作為肌肉生長發(fā)育的抑制劑，胸肌中MSTN在90日齡時達到最高，提示90日齡時胸肌發(fā)育受到了負向調(diào)控。然而，腿肌MyoD1的基因表達與MSTN的表達相似，在90日齡和120日齡時突然升高，且MSTN在120日齡時達到最高，此時ODC、SPDS、SPMS和APAO基因表達量達到最高，推測在120日齡時腿肌中多胺代謝較為旺盛，可能與MyoD1和MSTN基因共同調(diào)控鴨腿肌的生長。此外，相關性分析發(fā)現(xiàn)，多胺合成限速酶基因ODC與MyoD1和MSTN基因表達具有相關性，提示ODC可能與MyoD1和MSTN基因共同參與鴨腿肌的發(fā)育。

4 結論

鴨胸肌和腿肌的多胺含量在0日齡和30日齡時較高，胸肌和腿肌中多胺代謝基因呈一定規(guī)律變化，且鴨胸肌中多胺代謝基因（SPMS、SPDS、SSAT、SMO）與肌肉發(fā)育相關基因（MyoD1和Myf5）的表達存在正相關，腿肌中多胺代謝基因ODC與MyoD1和MSTN基因表達正相關，提示這些多胺代謝基因與肌肉發(fā)育相關基因可能共同調(diào)控鴨胸肌和腿肌的生長。