陳英 王藝?yán)?鄒鵬飛

（集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361021）

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptor associated factors，TRAFs）是Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）、NOD樣受體（NODlike receptors，NLRs）、RIG-I樣 受 體（RIG-I like receptors，RLRs）介導(dǎo)信號通路的重要接頭蛋白，在宿主的固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中具有重要作用［1-5］。TRAFs可以介導(dǎo)核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）的激活，調(diào)控宿主的免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)［1，3］。

目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)TRAF（TRAF1-7）成員，其共同特征是都有高度保守的C-末端TRAF結(jié) 構(gòu) 域（除 了TRAF7在C-末 端 包 含7個(gè)WD40）［6］。TRAF結(jié)構(gòu)域分為TRAF-N（coiled-coil domain）和TRAF-C（beta-sandwich domain，MATH domain），主要參與蛋白質(zhì)之間的相互作用［7］。TRAFs（TRAF1除外）含有一個(gè)額外的N端結(jié)構(gòu)域，由一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)域（RING finger domain）和若干個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（zinc fingers domain）組成［1］。TRAF2、TRAF3、TRAF5和TRAF6的環(huán)指結(jié)構(gòu)域具有E3泛素連接酶活性，可通過K63關(guān)聯(lián)的多聚泛素化介導(dǎo)蛋白質(zhì)泛素化，激活下游信號通路［8-12］。

TRAF6蛋白作為TRAF家族的重要成員，參與腫瘤壞死因子受體超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，也在IL-1/TLR 家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程發(fā)揮重要作用，因而獲得廣泛關(guān)注［13-16］。哺乳動物中的相關(guān)研究表明，一些TLR家族成員（如TLR3/4）可通過與β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域接頭蛋白（Toll/interleukin-1 receptor（TIR）domain containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）相互作用，招募并激活TRAF3和TRAF6［17］。TLR家族其他成員（TLR1/2/4/5/6/7/8/9）和白介素-1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）超家族成員（IL-1/18/33R）可通過招募接頭蛋白髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88），激活I(lǐng)L-1受體相關(guān)激酶1或4（interleukin-1 receptor associated kinase-1/4，IRAK1/4），從而激活TRAF6［18-20］。同時(shí)，TRAF6還可以通過TLR7/8/9-MyD88途徑激活下游IRF7［21-22］。

近年來，TRAF6的同源基因在硬骨魚類中被克隆和鑒定，包括青魚（Mylophyngodon piceus）［23］、花 鱸（Lateolabrax maculatus）［24］、草 魚（Ctenopharyngodon idellus）［25］、 鯽（Carassius auratus）［26］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［27］等。其中對青魚相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)TRAF6（bcTRAF6）在RIG-I/MAVS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起正調(diào)控作用［23］；花鱸TRAF6可以抑制哈氏桿菌（Vibrio harveyi）和無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［24］；草魚TRAF6可與IRF5相互作用，激活I(lǐng)RF5并誘導(dǎo)IFN1表達(dá)上調(diào)［25］；鯽TRAF6的mRNA表達(dá)水平在聚肌苷酸胞苷酸（Poly I：C）、鞭毛蛋白（flagellin）和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）刺激下顯著上調(diào)［26］；而虹鱒TRAF6的基因沉默顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的MAPKs和NF-κB相關(guān)信號通路的激活［27］。上述研究結(jié)果共同說明硬骨魚類TRAF6在響應(yīng)病原入侵、激活免疫相關(guān)信號通路、啟動機(jī)體免疫應(yīng)答等過程中的重要作用。

大黃魚（Larimichthys crocea）屬硬骨魚綱鱸形目石首魚科黃魚屬，是我國東部和南部沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類［28］。近年來，隨著網(wǎng)箱養(yǎng)殖密度和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖條件惡化，經(jīng)常面臨著刺激隱核蟲病、弧菌病、假單胞菌病、黏孢子蟲病、虹彩病毒病等疾病的侵襲［29-32］。然而，目前有關(guān)大黃魚的病原識別及免疫激活的相關(guān)基礎(chǔ)研究依然較匱乏，有必要開展大黃魚基礎(chǔ)免疫學(xué)的相關(guān)研究。因此，本研究以大黃魚為實(shí)驗(yàn)對象，克隆了大黃魚TRAF6基因，利用GFP熒光示蹤質(zhì)粒揭示了其亞細(xì)胞定位，同時(shí)通過熒光定量PCR檢測了TRAF6在健康大黃魚各組織以及在不同病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）刺激下的表達(dá)水平，初步解析了TRAF6在抗感染免疫中的作用。研究結(jié)果將為深入解析TRAF6在宿主固有免疫應(yīng)答中的功能及其介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康大黃魚（體長18 cm±1.5 cm，體重60 g±15 g，8月齡），購自福建寧德富發(fā)水產(chǎn)有限公司。實(shí)驗(yàn)前，大黃魚在25℃的循環(huán)海水系統(tǒng)中暫養(yǎng)兩周。

實(shí)驗(yàn)所用人胚腎細(xì)胞系（HEK 293T）購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)保藏中心），使用含10%胎牛血清（Invitrogen-Gibco）、100 U/mL青霉素（P）和鏈霉素（S）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM），培養(yǎng)于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 利用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）對核苷酸和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析；通過ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測基因的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）；利用在線軟件（http://www.bio-soft.net/sms/index.HTML）推算蛋白質(zhì)分子量；利用NCBI基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）檢索脊椎動物TRAF6的基因序列，進(jìn)一步使用Splign（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi）對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2.2 體內(nèi)免疫刺激 為研究TRAF6在健康大黃魚體內(nèi)的組織分布情況，將6條健康大黃魚用0.01%丁香酚麻醉后，取鰓、肝、脾、頭腎、體腎、腸、心、腦、皮膚和肌肉，將其分別保存于RNAlater中，同時(shí)取血液保存于Trizol中，用于后續(xù)總RNA的提取。為了研究大黃魚TRAF6在不同免疫刺激下的表達(dá)特征，將魚分成五組并分別腹腔注射變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）懸浮液（5 × 105CFU/mL）、脂多糖（LPS）（L3024，Sigma，來自大腸桿菌 O111：B4，0.5 mg/mL）、肽聚糖（PGN）（69554，來自枯草芽孢桿菌，Sigma，1 mg/mL）、聚肌胞苷酸（Poly I：C，P9582，Sigma，1 mg/mL）和PBS溶液（對照組）各100 μL。注射6、12和24 h后每組隨機(jī)選取6尾大黃魚，分別采集鰓、頭腎、脾、腸、血液組織以備后續(xù)總RNA的提取等實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 總RNA提取和cDNA合成 使用Eastep?Super總RNA提 取 試 劑 盒（Promega）從 上 述 器官/組織樣本中取綠豆粒大小組織塊（20-40 mg）用于提取總RNA，其中，血液樣品取300 μL使用TIANGEN?RNAsimple總RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳和OD260/280分析測定RNA的質(zhì)量和濃度。每個(gè)樣品取1 μg總RNA與不含RNase的DNase I（Thermo ScientificTM）反應(yīng)，隨后使用第一鏈cDNA合成試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，#K1622，Thermo ScientificTM）將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并保存于-80℃冰箱中，用于目的基因克隆或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用羅氏LightCycler?480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Go Taq?qPCR Master Mix試劑（Promega，Madison，美國），在384孔板上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系為10 μL：2 ×SYBR Green Master Mix 5 μL，正 向 引 物0.5 μL（4 μmol/L），反向引物0.5 μL（4 μmol/L），cDNA模板1 μL（100 ng/μL），無核酸酶水3 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸15 s，在81℃進(jìn)行讀板，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，16℃反應(yīng)5 min。將靶基因的相對表達(dá)量使用內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行校正，并使用比較Ct方法（2-??Ct）進(jìn)行分析。采用t檢驗(yàn)確定各處理組間的顯著性差異水平，其中*表示差異顯著P< 0.05，**表示差異極顯著P< 0.01。引物序列見表1。

1.2.5 質(zhì)粒構(gòu)建 克隆大黃魚TRAF6的ORF序列并構(gòu)建至pMD19-T載體上測序鑒定，使用限制性內(nèi)切酶將含有目的基因的pMD19-T質(zhì)粒及真核表達(dá)質(zhì)粒pTurboGFP-N進(jìn)行酶切，并將大黃魚TRAF6的ORF序列插入至pTurboGFP-N載體中，構(gòu)建大黃魚TRAF6的GFP熒光示蹤質(zhì)粒。上述質(zhì)粒構(gòu)建體均通過測序驗(yàn)證，所用引物序列見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.6 亞細(xì)胞定位分析 將HEK 293T細(xì)胞（每孔2× 105個(gè)細(xì)胞）傳代培養(yǎng)于6孔板中（已放入細(xì)胞爬片）過夜，使用Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑將5 μg pTurbo-TRAF6-GFP和pTurboGFP-N（對照）質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染于HEK 293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染約24 h后，細(xì)胞爬片用PBS洗滌并用4%多聚甲醛室溫固定10 min，再加入TritonX-100透化處理10 min，繼續(xù)用PBS洗滌一次后用4, 6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色封片2 h。使用激光共聚焦顯微鏡（德國萊卡）觀察細(xì)胞并拍照。

2 結(jié)果

2.1 大黃魚TRAF6基因的克隆與序列分析

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列信息（GenBank accession No. XM_019273436.2），利 用Primer 5設(shè)計(jì)特異性引物，以大黃魚脾臟cDNA為模板克隆并獲得大黃魚TRAF6的ORF全長，命名為Lc-TRAF6（GenBank accession No. OL333599）。Lc-TRAF6ORF由1 725個(gè)核苷酸組成，編碼574個(gè)氨基酸（aa）。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lc-TRAF6由N端RING finger結(jié)構(gòu)域（80-118 aa）、zinc fingers結(jié)構(gòu)域（138-187 aa，214-271 aa），coiled-coil結(jié)構(gòu)域（361-398 aa）和C端MATH-TRAF6結(jié)構(gòu)域（405-530 aa）構(gòu)成（圖1）。

圖1 大黃魚TRAF6與其他脊椎動物TRAF6氨基酸序列比對Fig. 1 Multiple alignment of Lc-TRAF6 with TRAF6 in other vertebrates

將Lc-TRAF6與其他脊椎動物TRAF6氨基酸序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，不同魚類之間的TRAF6相似性較高，其中Lc-TRAF6的氨基酸序列與斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）TRAF6的相似性為94%，與紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）的相似性為87%，與虹鱒的相似性為78%，與草魚的相似性為75%，與斑馬魚（Denio rerio）和斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punetaus）的相似性為74%。而與鳥類和哺乳動物TRAF6相比，相似性水平有所下降，與 雞（Gallus gallus）、人（Homo sapiens）和 小 鼠（Mus musculus）的相似性分別為66%、65%和64%（表2）。

表2 Lc-TRAF6與其它脊椎動物TRAF6氨基酸序列相似性比較Table 2 Comparison of amino acid sequence similarity between Lc-TRAF6 and TRAF6 in other vertebrates

將Lc-TRAF6與紅鰭東方鲀、斑馬魚、雞、小鼠和人TRAF6的cDNA序列與其對應(yīng)的基因序列進(jìn)行比較，對其基因的外顯子和內(nèi)含子組成進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lc-TRAF6基因序列由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，其外顯子與內(nèi)含子結(jié)構(gòu)與紅鰭東方鲀最為相似，而斑馬魚與鳥類和哺乳動物基因組結(jié)構(gòu)更為相似，均包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子（圖2）。在所檢測的物種中，紅鰭東方鲀TRAF6基因序列長度最短，為2 700 bp，小鼠最長，為14 395 bp；脊椎動物TRAF6基因在第2-5個(gè)外顯子十分保守，其長度分別為151、159、72和78 bp，但內(nèi)含子差異很大，其中最長的內(nèi)含子有4 860 bp，而最短的內(nèi)含子僅有71 bp（圖2）。

圖2 Lc-TRAF6與其他脊椎動物TRAF6基因結(jié)構(gòu)比較Fig.2 Genomic structure comparison of gene Lc-TRAF6 with TRAF6 in other vertebrates

2.2 大黃魚TRAF6的亞細(xì)胞定位

為了解析Lc-TRAF6的亞細(xì)胞定位，將GFP熒光示蹤質(zhì)粒pTurbo-TRAF6-GFP和pTurboGFP-N分別轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞并用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色。激光共聚焦顯微鏡分析結(jié)果表明TRAF6-GFP融合蛋白主要分布在胞漿，且在靠近細(xì)胞核的部位呈現(xiàn)點(diǎn)狀聚集現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pTurboGFP-N的細(xì)胞其GFP熒光蛋白在全細(xì)胞中均有分布（圖3）。

圖3 Lc-TRAF6的亞細(xì)胞定位分析Fig.3 Subcellular localization analysis of Lc-TRAF6

2.3 大黃魚TRAF6的表達(dá)分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測了Lc-TRAF6mRNA在健康大黃魚11種器官/組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明Lc-TRAF6mRNA在所有檢測器官/組織中普遍表達(dá)，但是在不同器官/組織中的Lc-TRAF6mRNA的表達(dá)水平存在差異，其中在血液中表達(dá)量最高，其次是鰓、肌肉、頭腎、脾、心、肝、腸、體腎、皮膚，在腦中表達(dá)量最低（圖4）。

圖4 Lc-TRAF6的組織表達(dá)分析Fig. 4 Tissue expression analysis of Lc-TRAF6

為了進(jìn)一步解析Lc-TRAF6基因在宿主免疫反應(yīng)中的作用，我們通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測Lc-TRAF6在Poly I：C、LPS、PGN刺 激 下 和P.plecoglossicida感染后鰓、脾臟、頭腎、血液和腸中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，Lc-TRAF6在Poly I：C刺激下其表達(dá)水平顯著上調(diào)：鰓在刺激6 h時(shí)Lc-TRAF6的表達(dá)水平相較于對照組上調(diào)了2.5倍（圖5-A），脾在刺激12 h和24 h時(shí)Lc-TRAF6的表達(dá)水平相較于對照組分別上調(diào)了6.8倍和1.9倍（圖5-B），頭腎在6 h和12 h 時(shí)Lc-TRAF6的表達(dá)水平相較于對照組分別升高了2.8倍和3.2倍（圖5-C），腸在刺激24 h時(shí)Lc-TRAF6的表達(dá)水平相較于對照組上調(diào)了2.8倍（圖5-D），外周血中在刺激12 h時(shí)Lc-TRAF6的表達(dá)水平相較于對照組上調(diào)了3.0倍（圖5-E）。LPS 刺激能顯著誘導(dǎo)Lc-TRAF6的表達(dá)水平上調(diào)：鰓在LPS刺激6 h時(shí)Lc-TRAF6的表達(dá)水平為對照組的1.9倍（圖5-A），脾在LPS刺激12 h時(shí)Lc-TRAF6的表達(dá)水平為對照組的4.0倍（圖5-B），在LPS刺激24 h時(shí)頭腎、腸和血表達(dá)水平較對照組分別高了1.9倍、2.2倍和2.0倍（圖5-C-E）。在 PGN感染刺激下，Lc-TRAF6的表達(dá)水平也顯著上調(diào)：鰓和腸在刺激6 h時(shí)Lc-TRAF6的表達(dá)水平較對照組分別上調(diào)了1.8倍和2.2倍（圖5-A和5-D），頭腎在刺激12 h和24 h時(shí)Lc-TRAF6的表達(dá)水平較對照組分別上調(diào)1.8倍和1.6倍（圖5-C），脾和血在刺激12 h時(shí)Lc-TRAF6的表達(dá)水平較對照組分別上調(diào)3.9倍和4.2倍（圖5-B和5-E）。同時(shí)，在P. plecoglosicida感染刺激下也能顯著誘導(dǎo)大黃魚 TRAF6 表達(dá)上調(diào)：鰓在刺激6 h時(shí)Lc-TRAF6表達(dá)水平是對照組的1.9倍（圖5-A），脾在12 h時(shí)Lc-TRAF6表達(dá)量為對照組的6.5倍，頭腎在24 h時(shí)Lc-TRAF6表達(dá)水平是對照組的1.8倍（圖5-C），腸組織在刺激6、12、24 h時(shí)Lc-TRAF6表達(dá)水平分別是對照組的2.8倍、2.2倍和1.9倍（圖5-D），外周血中刺激12 h 時(shí)Lc-TRAF6的表達(dá)量最高，為對照組的2.9倍（圖5-E）。此外，在不同病原相關(guān)分子模式刺激6 h時(shí)鰓中Lc-TRAF6表達(dá)量均上調(diào)（圖5-A）；而脾臟和血液中Lc-TRAF6表達(dá)量峰值均出現(xiàn)在12 h時(shí)（圖5-B和5-E）。

圖5 Poly I：C、LPS、PGN和P. plecoglossicida刺激下Lc-TRAF6的表達(dá)分析Fig. 5 Expression analysis of Lc-TRAF6 under Poly I：C，LPS，PGN，and P. plecoglossicida stimulation

3 討論

TRAF6是TLR信號通路中的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，泛素化后的TRAF6激活TAK1，繼而使IKK和MAPK磷酸化，分別激活NF-κB和AP-1［33］。哺乳動物TRAF6包含4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，包括RING finger結(jié)構(gòu)域、一系列zinc finger結(jié)構(gòu)域、一個(gè)coiled-coil區(qū)域和一個(gè)MATH結(jié)構(gòu)域。與哺乳動物TRAF6相似，Lc-TRAF6也包含經(jīng)典結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)RING finger結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)zinc finger結(jié)構(gòu)域、一個(gè)coiled-coil結(jié)構(gòu)域和一個(gè)MATH結(jié)構(gòu)域。

TRAF6基因結(jié)構(gòu)分析表明，魚類TRAF6基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，魚類和哺乳動物TRAF6基因外顯子的大小部分相似，同時(shí)斑馬魚和哺乳動物TRAF6基因只包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，上述結(jié)果表明TRAF6基因可能在脊椎動物的演化中出現(xiàn)了差異。

大黃魚TRAF6-GFP融合蛋白在HEK 293T細(xì)胞中主要分布于胞漿，且在靠近細(xì)胞核的部位呈現(xiàn)出點(diǎn)狀聚集的現(xiàn)象。其他硬骨魚類TRAF6的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，斜帶石斑魚TRAF6-GFP融合蛋白的綠色熒光主要分布在人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）細(xì)胞質(zhì)中，未見亮綠色斑點(diǎn)［12］。草魚TRAF6-GFP位于草魚腎細(xì)胞（Ctenopharyngodon idellakidney cell line，CIK）細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核周圍由亮綠色斑點(diǎn)包圍［25］?；|TRAF6-GFP融合蛋白主要分布在HEK 293T細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核周圍也可見亮綠色斑點(diǎn)［24］，與大黃魚TRAF6-GFP分布情況極為相似，提示硬骨魚類TRAF6可能具有結(jié)合囊泡或形成聚集體的機(jī)制［34］。

大黃魚TRAF6在不同組織和器官中廣泛表達(dá)，其中在血液中表達(dá)量最高，其次是鰓、脾、頭腎等，在腦中表達(dá)最低。其他硬骨魚類TRAF6表達(dá)分析結(jié)果顯示，TRAF6分別在草魚頭腎［35］、鯽肌肉［26］、尼羅羅非魚脾臟［36］、虹鱒和青魚肝臟［27，37］表達(dá)量最高。上述結(jié)果表明硬骨魚類TRAF6的組織表達(dá)特征可能因物種不同而存在一定的差異。

此外，大黃魚TRAF6的表達(dá)水平在Poly I：C、LPS、PGN和P. plecoglossicida刺激下均顯著上調(diào)，且在脾、頭腎、腸、鰓和血液中的表達(dá)變化因免疫刺激和器官/組織的不同而存在差異。其他硬骨魚類中的相關(guān)研究顯示，花鱸TRAF6的表達(dá)水平在Poly I：C刺激和赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒（red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV）感 染 后 顯著上調(diào)［38］，鯽TRAF6在Poly I：C、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）刺激后其表達(dá)水平顯著上調(diào)［26］，在小瓜蟲（Ichthyophthirius multifiliis）感染后，草魚TRAF6在皮膚、鰓、頭腎和脾臟中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)［35］。上述結(jié)果表明硬骨魚類TRAF6參與了宿主的免疫反應(yīng)，特別是在宿主響應(yīng)寄生蟲、細(xì)菌和病毒等病原入侵的過程中具有重要作用。

值得注意的是，大黃魚TRAF6在鰓和脾臟組織中響應(yīng)不同PAMPs刺激的時(shí)間不盡相同。其中，鰓中TRAF6的表達(dá)水平在Poly I：C、LPS、PGN和P.plecoglossicida刺激6 h時(shí)其表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明鰓可能參與了病原體入侵的早期反應(yīng)。鰓是魚與外界密切接觸的黏膜器官，鰓相關(guān)淋巴組織（gillassociated lymphiof tissues，GIALT）中富含免疫分子和免疫效應(yīng)細(xì)胞，其中免疫分子包括抗菌肽、急性反應(yīng)物質(zhì)等，免疫效應(yīng)細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和抗體分泌細(xì)胞等［39-40］。當(dāng)機(jī)體被病原刺激后，鰓相關(guān)淋巴組織會啟動免疫細(xì)胞及免疫分子參與免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)TRAF6等免疫相關(guān)信號分子的表達(dá)，激活免疫相關(guān)信號通路。而脾臟中TRAF6表達(dá)水平在不同PAMPs刺激12 h時(shí)達(dá)到峰值，且脾臟中TRAF6的表達(dá)上調(diào)幅度均大于鰓中，表明脾臟可能主要參與了病原體入侵的中期反應(yīng)，這與鯉感染嗜水氣單胞菌12 h時(shí)TRAF6基因的表達(dá)模式相似［41］。

4 結(jié)論

大黃魚TRAF6基因ORF全長1 725 bp，編碼一個(gè)含574 aa的蛋白，由RING finger結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)zinc finger結(jié)構(gòu)域、coiled-coil結(jié)構(gòu)域和MATHTRAF6結(jié)構(gòu)域組成。大黃魚TRAF6主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，且在細(xì)胞核周圍存在點(diǎn)狀聚集。大黃魚TRAF6廣泛表達(dá)于健康大黃魚中不同器官/組織中，在血液中表達(dá)水平最高，在腦中最低；在Poly I：C、LPS、PGN刺激和P. plecoglossicida感染下黏膜免疫組織（鰓和腸）、外周免疫組織（脾和頭腎）和血液中TRAF6表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明大黃魚TRAF6參與宿主的免疫應(yīng)答。