黃曉茹，陳 杭，林 珊，張忠龍

福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福州 350005

支氣管肺炎是累及支氣管壁和肺泡的炎癥，為兒童時(shí)期最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，2～3歲兒童多發(fā)[1]。引起支氣管肺炎的病因主要有細(xì)菌、病毒和肺炎支原體，其中引起支氣管肺炎的病毒主要有呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒和副流感病毒等；細(xì)菌主要有肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌等。淋巴細(xì)胞亞群是機(jī)體免疫防御體系中的重要組成部分，可反映機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫水平，其變化與感染性疾病類(lèi)型和程度有關(guān)[2-3]。本研究通過(guò)對(duì)不同類(lèi)型支氣管肺炎的外周淋巴細(xì)胞亞群、血小板壓積(PCT)等的變化作回顧性分析，探討淋巴細(xì)胞亞群、PCT變化在患兒支氣管肺炎的病因診斷中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年8月至2021年8月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州兒童醫(yī)院診斷為支氣管肺炎的患兒173例作為感染組，再按照其所感染病原體的種類(lèi)分為細(xì)菌組30例、肺炎支原體組30例、病毒組30例、2種病原體組73例和3種病原體組10例。同時(shí)選取在本院進(jìn)行健康體檢的健康兒童30例作為對(duì)照組。各組研究對(duì)象的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)合臨床癥狀及血常規(guī)、影像學(xué)等相關(guān)檢查，符合《兒科學(xué)》[4]中支氣管肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)細(xì)菌組經(jīng)咽拭子或痰標(biāo)本培養(yǎng)出致病菌，肺炎支原體及病毒相關(guān)檢測(cè)均為陰性；(3)肺炎支原體組的血清肺炎支原體免疫球蛋白(Ig)M抗體陽(yáng)性，細(xì)菌及病毒相關(guān)檢測(cè)均為陰性；(4)病毒組血清相關(guān)特異性IgM抗體或咽拭子13種呼吸道病原體核酸檢測(cè)陽(yáng)性，細(xì)菌及肺炎支原體相關(guān)檢測(cè)均為陰性；(5)2種病原體組同時(shí)檢出2種類(lèi)型病原體，包括細(xì)菌和肺炎支原體相關(guān)檢測(cè)均為陽(yáng)性，病毒為陰性或細(xì)菌和病毒相關(guān)檢測(cè)均為陽(yáng)性，肺炎支原體為陰性或肺炎支原體和病毒相關(guān)檢測(cè)均為陽(yáng)性，細(xì)菌為陰性這3種情況；(6)3種病原體組同時(shí)檢出3種類(lèi)型病原體，即細(xì)菌、肺炎支原體和病毒相關(guān)檢測(cè)均為陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他呼吸道感染性疾病，如急性扁桃體炎、支氣管炎、肺炎等；(2)合并其他部位感染；(3)合并其他嚴(yán)重臟器病變；(4)自身免疫性疾病或者免疫缺陷病；(5)過(guò)敏性疾病。

表1 各組研究對(duì)象的一般資料比較

1.2儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，以及相關(guān)配套試劑購(gòu)自中國(guó)梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；生物熒光顯微鏡、試劑購(gòu)自西班牙比爾塞有限公司；Hema9600基因擴(kuò)增儀購(gòu)自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；3500DX基因分析儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀及相關(guān)配套試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司；全自動(dòng)血液分析儀及相關(guān)配套試劑購(gòu)自法國(guó)ABX公司。

1.3方法

1.3.1PCT檢測(cè) 采集研究對(duì)象靜脈血2 mL，采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，通過(guò)電阻抗法檢測(cè)PCT。

1.3.2間接免疫熒光法 取15 μL血清、15 μL PBS和150 μL吸附劑于離心管中，混勻，以13 000 r/min離心10 min，取上清液加入載玻片孔中，37 ℃溫育90 min，洗片，每孔加入15 ℃抗人IgM FITC結(jié)合物，37 ℃溫育30 min，洗片，加入封閉介質(zhì)置于生物熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3PCR毛細(xì)電泳片段分析法 采集患兒咽拭子標(biāo)本，通過(guò)PCR毛細(xì)電泳片段分析法檢測(cè)病毒的核酸序列。按照13種呼吸道病原體多重檢測(cè)試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)，對(duì)咽拭子標(biāo)本進(jìn)行標(biāo)本前處理、核酸提取、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增、毛細(xì)電泳儀熒光信號(hào)強(qiáng)度的測(cè)量、PCR產(chǎn)物的毛細(xì)電泳分離等步驟的處理。

1.3.4淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 按照淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，取12 μL熒光標(biāo)記抗體于流式細(xì)胞儀專用TruCONT管中，加入50 μL全血，混勻，室溫暗處放置15 min，加入450 μL 10%FACS溶血素，混勻，室溫暗處放置15 min。采用美國(guó)BD公司FACS Calibur型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1各組淋巴細(xì)胞亞群比較 各組支氣管肺炎患兒CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD8+、CD16+56+NK細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CD4+T細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，感染組、細(xì)菌組、病毒組、2種病原體組、3種病原體組CD3+T細(xì)胞降低(P<0.05)；感染組、細(xì)菌組、病毒組、肺炎支原體組、2種病原體組、3種病原體組CD8+T細(xì)胞降低(P<0.05)；細(xì)菌組CD4+T細(xì)胞升高(P<0.05)；感染組、細(xì)菌組、病毒組、肺炎支原體組CD4+/CD8+升高(P<0.05)；細(xì)菌組、病毒組CD16+56+NK細(xì)胞降低(P<0.05)；感染組、細(xì)菌組、病毒組、2種病原體組、3種病原體組CD19+B細(xì)胞升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組淋巴細(xì)胞亞群比較

2.2各組PCT比較 各組PCT比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對(duì)照組比較，感染組、細(xì)菌組、病毒組、2種病原體組PCT升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組PCT比較

2.3CD4+/CD8+、PCT在支氣管肺炎中的診斷價(jià)值 繪制CD4+/CD8+、PCT在支氣管肺炎中的ROC曲線，CD4+/CD8+、PCT曲線下面積(AUC)分別為0.653、0.671。當(dāng)CD4+/CD8+最佳臨界值為1.80時(shí)，靈敏度和特異度分別為45.7%、90.0%；當(dāng)PCT的最佳臨界值為0.282%時(shí)，靈敏度和特異度分別為56.0%、88.9%。見(jiàn)表4。

表4 CD4+/CD8+、PCT在支氣管肺炎中的診斷價(jià)值

3 討 論

有研究表明，兒童的免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未健全，免疫功能不完善或免疫功能低下是其重要原因[5-7]。機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)是依賴于各淋巴細(xì)胞亞群間的相互制約、協(xié)調(diào)，形成適應(yīng)性免疫應(yīng)答[8-10]。機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答含有細(xì)胞免疫和體液免疫兩種，參與細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞包括表達(dá)CD4+的輔助性T細(xì)胞(Th)和CD8+的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。Th通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子活化B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，起到對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)[11]。CTL可特異性直接殺傷靶細(xì)胞或殺滅靶細(xì)胞內(nèi)的病原體[12]，對(duì)機(jī)體免疫功能起到抑制作用[13]。CD4+/CD8+反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，其比值降低提示細(xì)胞免疫功能抑制[14]。而參與體液免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞是表達(dá)CD19+的B淋巴細(xì)胞，通過(guò)產(chǎn)生IgG、IgA和IgM等抗體抗感染[15-17]。表達(dá)CD16+56+的自然殺傷細(xì)胞無(wú)需抗原預(yù)先致敏即可殺傷感染細(xì)胞，參與機(jī)體的固有免疫應(yīng)答[18]。

本研究通過(guò)對(duì)173例支氣管肺炎患兒的外周血淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定與分析，可以看出，與對(duì)照組比較，感染組的CD3+T細(xì)胞降低，說(shuō)明支氣管肺炎患兒的機(jī)體免疫功能低下，而各組CD8+T細(xì)胞均有不同程度的降低，CD4+/CD8+、CD19+B細(xì)胞均有不同程度的升高，說(shuō)明支氣管患兒在病原體入侵后機(jī)體處于一種應(yīng)激狀態(tài)，細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)，是機(jī)體抵抗病原體入侵的自然反應(yīng)。單一類(lèi)型病原體感染，即細(xì)菌組、肺炎支原體組和病毒組的CD4+/CD8+較對(duì)照組明顯升高，而2種病原體組的CD4+/CD8+卻無(wú)明顯變化，說(shuō)明可考慮用CD4+/CD8+初步判斷是單一類(lèi)型病原體感染，還是同時(shí)感染2種類(lèi)型病原體。對(duì)于單一類(lèi)型病原體感染者，肺炎支原體組的CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞較對(duì)照組無(wú)明顯變化，而細(xì)菌組和病毒組的CD3+T細(xì)胞較對(duì)照組降低，CD19+B細(xì)胞較對(duì)照組升高，說(shuō)明可考慮用CD3+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞鑒別肺炎支原體組、細(xì)菌組和病毒組；細(xì)菌組與病毒組較對(duì)照組的CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和CD16+56+NK細(xì)胞均降低，CD4+/CD8+、CD19+B細(xì)胞均升高，同時(shí)細(xì)菌組的CD4+T細(xì)胞卻明顯升高，而病毒組無(wú)明顯變化，說(shuō)明可考慮用CD4+T細(xì)胞鑒別細(xì)菌組和病毒組。

PCT是由血小板計(jì)數(shù)和平均血小板體積經(jīng)過(guò)計(jì)算獲得[19]，反映血小板體積在單位體積全血中所占的比例，并且大血小板的活性更高，可以反映血小板活化程度[20]。本研究結(jié)果表明，2種病原體組與3種病原體組的外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化較對(duì)照組相似，但是2種病原體組的PCT較對(duì)照組明顯升高，而3種病原體組卻無(wú)明顯變化。由于3種病原體組的病例數(shù)不多，能否使用PCT這一指標(biāo)來(lái)鑒別2種病原體組與3種病原體組，有待進(jìn)一步積累完善數(shù)據(jù)。

另外，本研究探討了CD4+/CD8+與PCT在支氣管肺炎中的診斷價(jià)值。從繪制的ROC曲線中可以看出，CD4+/CD8+、PCT的AUC分別為0.653、0.671，表明二者對(duì)患兒支氣管肺炎具有一定的診斷價(jià)值。當(dāng)CD4+/CD8+、PCT的最佳臨界值分別為1.80、0.282%時(shí)，其靈敏度均不高，但是二者的特異度較高。

支氣管肺炎患兒存在一定程度的機(jī)體免疫功能失調(diào)及PCT的變化，且感染的病原體不同，其細(xì)胞免疫和PCT具有不同的特點(diǎn)，故可通過(guò)對(duì)外周血淋巴細(xì)胞亞群及PCT檢測(cè)來(lái)鑒別和診斷支氣管肺炎的病原體，在疾病早期輔助指導(dǎo)臨床治療，使病情發(fā)展得到控制，縮短患兒病程。