季 磊，陳 博，馬曉健

(大連市檢驗檢測認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧 大連 116021)

甜味劑是賦予食品甜味的物質(zhì)，[1]是一類有著廣泛應(yīng)用的食品添加劑。甜味劑具有增加食品的甜度、增強口感和改善風(fēng)味等作用，按照其來源可分為天然甜味劑和人工合成甜味劑。[2]人工合成的甜味劑包括二肽類、磺酰胺類和蔗糖衍生物。其中，阿斯巴甜、阿力甜和紐甜都屬于二肽類人工合成甜味劑，[3]具有甜度高、不提供能量、價格便宜等特點。但是如果過量使用甜味劑，有可能會對身體健康產(chǎn)生不良影響。[4]

根據(jù)GB/T 15037-2006標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，[5]葡萄酒應(yīng)該以葡萄或葡萄汁發(fā)酵釀制而成，生產(chǎn)過程中不允許添加甜味劑。目前檢測二肽類甜味劑阿斯巴甜、阿力甜和紐甜含量的方法主要有表面增強拉曼光譜法[6]、高效液相色譜法[7-8]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]和離子色譜法[11]等方法。本研究使用高效液相色譜法同時測定葡萄酒中阿斯巴甜、阿力甜和紐甜的含量，處理方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀Alliance 2695/2996、固相萃取柱Oasis MAX 3mL/60mg，美國沃特世Waters；色譜柱Poroshell EC-C18(2.7μm，4.6mm×100mm)，美國安捷倫Angilent；電子天平BSA224S、超純水系統(tǒng)，德國賽多利斯Sartorius；旋渦混合器XW-80A，上海精科實業(yè)有限公司；24位氮吹儀，美國Organomation；超聲波清洗器SK8300GT，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；阿斯巴甜(含量：94.49%)，德國Dr.Ehrenstorfer；阿力甜(含量：98%)，美國Panphy；紐甜(含量：98%)，加拿大TRC；甲醇、乙腈，色譜純；氨水、甲酸，分析純。

1.2 測定方法

1.2.1 樣品處理

將樣品混勻并超聲10min除去二氧化碳，稱取2g樣品于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。取出1mL容量瓶中液體于玻璃試管中，加入2mL 2%氨水溶液，旋渦混合器震蕩1min。試管中液體全部過用3mL甲醇和3mL水活化的MAX固相萃取柱(3mL/60mg)，分別用3mL水和3mL甲醇淋洗，棄去全部淋洗液，再使用6mL 4%甲酸-甲醇溶液洗脫，收集全部洗脫液，40℃水浴氮氣吹干。殘余物用10%乙腈-水溶液定溶至1mL，旋渦混合器震蕩1min。過0.22μm微孔濾膜，待測。

1.2.2 液相色譜檢測條件

色譜柱為Poroshell EC-C18(2.7μm，4.6mm×100mm)，柱溫30℃，進(jìn)樣量30μL；檢測器波長205nm；流動相A為純水，流動相B為乙腈，洗脫梯度見表1。

表1 液相色譜洗脫梯度

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別稱取一定量的阿斯巴甜、阿力甜和紐甜標(biāo)準(zhǔn)品至100mL容量瓶中，用10%乙腈-水溶液定容，配制成含量為100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。分別取10μL、25μL、50μL、250μL、500μL和1500μL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于50mL容量瓶中，用10%乙腈-水溶液定容，配制成含量分別為0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L和3.00mg/L的上機工作溶液，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，溶液中化合物的含量(mg/L)為橫坐標(biāo)x，色譜峰面積為縱坐標(biāo)y。三種化合物的相關(guān)系數(shù)均大于0.9995，線性關(guān)系較好。所得曲線和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2.2 回收率試驗及定量限

取適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入樣品中，每個濃度6個平行，經(jīng)1.2.1處理后測定，分別計算三種化合物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。經(jīng)計算，當(dāng)阿斯巴甜、阿力甜和紐甜的添加量為0.1mg/kg時，測定結(jié)果信噪比S/N>10，回收率大于83%，同時相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6%，本方法中阿斯巴甜、阿力甜和紐甜的定量限均確定為0.1mg/kg。添加回收試驗中，阿斯巴甜回收率在85.2%～93.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于6%，阿力甜回收率在82.7%～91.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于6%，紐甜回收率在90.3%～96.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于4%。樣品添加量和結(jié)果見表3，色譜圖見圖1。

表3 樣品添加量、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖1 空白樣品色譜圖及三種化合物加標(biāo)樣品色譜圖

3 討論

3.1 檢測器波長的選擇

空白樣品經(jīng)過1.2.1處理，加入阿斯巴甜、阿力甜和紐甜配制成1mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在190nm～400nm檢測波長條件下進(jìn)行掃描。經(jīng)過比較，波長205nm條件下三種化合物都有較大響應(yīng)且干擾較少。

3.2 樣品處理方法的選擇

在二肽類甜味劑的檢測中，最常見的樣品處理方法主要有以下兩種：樣品經(jīng)過稀釋過濾后檢測[12-13]和用固相萃取柱凈化樣品[14-15]之后檢測。本次研究首先使用純水稀釋后過濾樣品提取液的方法處理樣品，經(jīng)過檢測雜質(zhì)對三種化合物的檢測效果都有一定影響，其中對紐甜的影響相對較小。

通過比較使用C18固相萃取柱[15-16]、HLB固相萃取柱[14]和MAX固相萃取柱處理樣品的結(jié)果，三種固相萃取柱對去除樣品中雜質(zhì)的干擾都有一定的效果，其中MAX固相萃取柱的凈化效果相對較好，凈化后雜質(zhì)對三種化合物的檢測影響都比較小。本次研究最終選擇使用MAX固相萃取柱凈化樣品。

3.3 液相色譜條件的選擇

本次研究比較了使用不同比例的甲醇、乙腈、水和硫酸銨溶液[17]作為流動相，化合物色譜圖的峰面積、峰高、保留時間和分離度等因素。在使用同樣色譜柱的條件下，使用甲醇或乙腈作為有機相，三種化合物的峰面積沒有很大差別，使用乙腈時的峰高大約是使用甲醇時的兩倍；使用硫酸銨溶液作為流動相對改善目標(biāo)化合物的出峰有一定效果；使用梯度洗脫時三種化合物的峰形明顯好于等度洗脫，且梯度洗脫條件下更容易與雜質(zhì)分離。綜合考慮樣品檢測的情況，為了使方法更加簡單、快速、高效，本方法選擇使用乙腈-水流動相梯度洗脫檢測樣品。

4 結(jié)論

本次研究采用固相萃取法處理樣品，利用高效液相色譜法建立了葡萄酒中阿斯巴甜、阿力甜和紐甜含量的檢測方法。經(jīng)過驗證，本方法的準(zhǔn)確度、精密度、定量限和回收率都滿足檢測需求，可以用于葡萄酒中阿斯巴甜、阿力甜和紐甜的含量的檢測。