徐梓馨 廖紅雨 李慧一 徐銘益

肝細胞脂質代謝、細胞增殖及凋亡等情況的變化對非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)進展至關重要[1-4]。miRNA是一種在不同物種中高度保守的非編碼小RNA[5]。miRNA-122、miRNA-223、miRNA-34、miRNA-29、miRNA-194等在肝臟疾病中，發(fā)揮重要作用[6-9]。文獻報道，miRNA-219(miR-219)在四氯化碳誘導的肝纖維化小鼠模型中可抑制肝星狀細胞膠原沉積，進而抑制肝纖維化的進展；在肝癌小鼠模型中，miR-219可調控肝癌細胞的增殖、凋亡和遷移，發(fā)揮保護作用[10，11]。本研究通過構建脂肪肝小鼠和脂肪肝細胞模型，了解miR-219在脂毒性環(huán)境下對肝細胞脂質代謝、細胞活性與凋亡的影響。

材料與方法

一、材料與試劑

實驗小鼠購于上海斯萊克實驗動物中心，小鼠低脂飼料及高脂飼料均購于南通特洛菲實驗飼料有限公司，胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液、棕櫚酸(palmitic acid，PA)、Lipo3000脂質體轉染試劑、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，EDU試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。PCR引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，反轉錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒，HE染色、油紅染色試劑盒均購于上海翊圣生物科技有限公司。

二、方法

(一)動物模型構建 共有10只8周齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠用于脂肪肝小鼠模型的構建。小鼠體質量為25～30 g，由上海斯萊克實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院實驗動物中心。10只小鼠隨機分為低脂組(low fatty diet，LFD)與高脂組(high fatty diet，HFD)，每組5只，LFD組小鼠喂養(yǎng)普通飼料(即低脂飼料)，HFD組小鼠喂養(yǎng)高脂飼料。喂養(yǎng)16周后處死小鼠，取部分肝組織經(jīng)脫水、石蠟包埋或OCT凝膠包埋用于病理學檢測。取適當組織進行q-PCR檢測，余組織凍存于液氮中。

(二)肝組織病理檢查 建模小鼠處死后，取適當大小的新鮮組織塊置于4%甲醛溶液中固定48 h，脫水處理、石蠟包埋。蠟塊以4 μm 切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察其病理改變。新鮮肝組織經(jīng)過4%甲醛中固定48 h，依次經(jīng)過20%、10%蔗糖溶液梯度各24 h脫水后，用OCT溶膠包埋。以10 μm厚度進行冰凍組織切片，用于油紅染色，光學顯微鏡下檢測其病理程度并拍照。

(三)原代肝細胞(primary hepatocytes，PHC)提取、培養(yǎng)及處理 使用兩步膠原酶消化法分離8周齡雄性C57BL/6J 野生型小鼠的PHC[12]。分離得到的PHC用含10% FBS、50 mg/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞分為陰性對照組(mi-NC)和miR-219過表達組(mi-miR-219)，按照說明，用miR-219模擬物(miR-219 mimic)或陰性對照(mi-NC)轉染PHC，轉染濃度為50 nmol/mL，轉染完成24 h后，再以200 μmol PA處理PHC細胞24 h。

(四)原代肝細胞油紅染色 在PHCs細胞轉染完成培養(yǎng)24 h后更換含有200 μmol PA的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照試劑盒說明進行細胞油紅染色，光學顯微鏡下觀察細胞脂質沉積情況。

(五)生化檢測 全自動生化分析儀檢測對照組和PA處理組細胞上清液中AST、ALT水平。操作按照試劑盒說明書進行。

(六)EDU檢測 原代肝細胞轉染完成且PA處理之后，按照EDU試劑盒說明書進行EDU孵育、細胞固定化以及ApolloR染色，在熒光顯微鏡下觀察。

(七)QRT-PCR法檢測miRNA、mRNA相對表達量 采用TRIzol法提取總RNA并純化，進一步測定RNA樣品的濃度和純度，判斷樣品純度是否符合實驗要求。按照試劑說明書反轉錄合成cDNA后行RT-PCR。本研究主要檢測PA處理的肝細胞內(nèi)miR-219的表達，以及脂質代謝相關因子硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)[13]，細胞增殖關鍵分子增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen ，PCNA)和細胞周期蛋白D1(CyclinD1)[14,15]，以及凋亡相關分子半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的mRNA表達。對應的引物序列見表1。實驗過程中以U6、β-actin分別作為miRNA和mRNA的內(nèi)參對照，進行標準化轉換得到各樣本的拷貝數(shù)(Ct值)，樣品目的基因的相對表達率(relative expression，RQ)=2-△△CT。每個樣品的內(nèi)參基因和靶基因各設3個重復試驗。

結 果

一、非酒精性脂肪性肝小鼠模型的建立

為了構建非酒精性脂肪性肝病小鼠模型，將小鼠隨機分為HFD組和LFD組，分別喂養(yǎng)高脂飼料和普通飼料。HE染色顯示LFD組小鼠肝組織小葉結構完整，中央靜脈細胞排列有序，未見明顯脂肪變性及炎性細胞浸潤(圖1A)，HFD組可見明顯的肝小葉結構紊亂，出現(xiàn)明顯的脂肪泡及氣球樣變，伴隨大量炎性細胞浸潤(圖1B)。油紅染色顯示，LFD組小鼠肝細胞形態(tài)、結構正常，細胞核居中，僅存在少量脂質沉積(圖1C)，HFD組小鼠肝組織可見大量明顯的脂質沉積于匯管區(qū)周圍(圖1D)。HE染色和油紅染色結果表明非酒精性脂肪性肝病小鼠模型構建成功。

表1 qRT-PCR相關引物序列

A、B:HE染色；C、D:油紅染色(×100)

二、非酒精性脂肪性PHC細胞模型建立

油紅染色顯示，對照組PHC中紅色脂滴較少，經(jīng)過PA處理的PHC內(nèi)紅色脂肪顆粒明顯增加(圖2)。PA處理組PHC細胞上清液AST、ALT水平分別為12.743 U/L和7.410 U/L，高于對照組7.427 U/L和3.577 U/L，差異均有統(tǒng)計學意義(t=8.650、7.828，P=0.001、0.0014)。這些結果表明非酒精性脂肪肝細胞造模成功。

A:對照組; B: PA處理組

三、脂肪肝小鼠肝組織和脂毒性PHC中miR-219表達

在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中，HFD組小鼠肝組織miR-219表達水平為0.455±0.028，LFD組為1.000±0.125(P<0.05)。從野生型小鼠分離提取PHC，PA處理以模擬高脂環(huán)境，發(fā)現(xiàn)PA處理組PHC中miR-219的表達水平為0.676±0.064，對照組為1.000±0.190(P<0.05); miR-219的表達在高脂小鼠和PA刺激的PHC中均明顯下降，說明在非酒精性脂肪性肝病時，肝細胞中miR-219的表達受到明顯抑制，肝細胞功能也可能會受到影響。

四、在高脂環(huán)境下，過表達miR-219緩解PHC內(nèi)脂質沉積

為進一步探究miR-219對脂毒性環(huán)境下肝細胞的脂質代謝的影響，在PA處理的PHC中過表達miR-219。結果顯示miR-219在PHC內(nèi)升高1000倍，過表達miR-219的PHC細胞模型成功構建。油紅染色發(fā)現(xiàn)mi-miR219組PHC內(nèi)紅色脂肪顆粒明顯變少(圖3)。進一步檢測脂質代謝相關因子SCD1和FAS的表達，發(fā)現(xiàn)過表達mi-R219的PHC細胞內(nèi)，SCD1(mi-miR219+PA：0.539±0.048，miR-NC+PA：1.000±0.033，P<0.01)和FAS(mi-miR219+PA：0.722±0.036，miR-NC+PA：1.000±0.051，P<0.05)的mRNA表達均明顯下降。這些結果表明在高脂環(huán)境下，miR-219可緩解肝細胞脂質代謝紊亂。

A: miR-NC+PA；B: mi-miR219+PA

五、在高脂環(huán)境下，過表達miR-219促進PHC細胞增殖并抑制細胞凋亡

為進一步探索過表達miR-219對高脂環(huán)境下肝細胞的增殖及細胞凋亡的影響，進一步檢測了增殖相關因子(PCNA、CyclinD1)的表達。與miR-NC+PA組相比，mi-miR219+PA組的PHC中PCNA(mi-miR219+PA:1.652±0.185，miR-NC+PA:1.000±0.203，P<0.05)和CyclinD1(mi-miR219+PA:1.791±0.154, miR-NC+PA:1.000±0.135，P<0.05)的mRNA表達均出現(xiàn)明顯上升。EDU檢測提示過表達miR-219后，細胞增殖明顯增強(圖4)，說明在高脂環(huán)境下，miR-219可提高PHC的活性，促進PHC增殖。

A: miR-NC+PA；B: mi-miR219+PA

此外，與對照組相比，過表達miR-219后，PHC細胞中凋亡相關基因Caspase-3表達明顯下降(mi-miR219+PA:0.574±0.054，miR-NC+PA:1.000±0.35，P<0.05)，Bcl-2基因表達明顯上升(mi-miR291:1.535±0.109，miR-NC:1.000±0.208,P<0.05)；說明在高脂環(huán)境下，過表達miR-219可明顯促進肝細胞增殖，抑制肝細胞凋亡，提示mi-R219可能緩解脂毒性環(huán)境下肝細胞受到的損傷。

討 論

Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)在脂肪肝小鼠模型中，miR-103可通過靶向FAS和SCD1抑制肝臟新生脂肪生成，進而緩解NAFLD。miR-219可以通過抑制膠原沉積、促進細胞增殖、抑制凋亡等作用，在肝纖維化、肝癌中發(fā)揮作用[9-10]。

在本研究中，HE和油紅染色證實成功構建了NAFLD小鼠模型。在HFD組小鼠肝組織中，發(fā)現(xiàn)miR-219表達水平明顯下降。一些脂質(如PA)具有脂毒性，可導致肝細胞脂質代謝紊亂、活性受損、細胞凋亡增多乃至死亡[17.18]。從野生型小鼠分離提取原代肝細胞，用PA處理以模擬脂毒性環(huán)境，發(fā)現(xiàn)在PA處理的PHC中miR-219的表達水平也出現(xiàn)明顯下降，這說明miR-219在高脂環(huán)境下表達受到顯著抑制。

在PHC中過表達miR-219后，進一步檢測肝細胞脂質代謝、細胞增殖及凋亡等情況。SCD1和FAS能夠促進肝細胞脂質的合成，促進脂質在細胞內(nèi)沉積，是反映脂質代謝水平的關鍵因子。相比對照組，過表達miR-219組PHC脂質代謝因子SCD1、FAS的表達水平出現(xiàn)下降，脂質沉積也明顯減輕。提示miR-219可能對改善肝細胞的脂質代謝紊亂，緩解脂質沉積起關鍵作用。PCNA和CyclinD1是細胞DNA合成過程中的重要因子，其表達水平可反映細胞活性或細胞增殖的情況[14,15]。Q-PCR檢測過表達miR-219后PHC中這兩個基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)PCNA和Cyclin D1的表達均出現(xiàn)明顯上升，EDU檢測也提示細胞增殖明顯增強。此外，凋亡相關因子Caspase-3與細胞凋亡成正相關，促進細胞凋亡[19],而Bcl-2負調控細胞凋亡[20]，過表達miR-219可明顯抑制Casepase-3的表達，而促進Bcl-2的表達。這些表明過表達miR-219可緩解高脂對肝細胞活性的影響，促進增殖并抑制凋亡。

綜上所述，在高脂環(huán)境下，miR-219不僅可顯著緩解肝細胞脂質代謝紊亂，減輕脂質沉積，也能夠減輕脂毒性對細胞活性的影響，促進細胞增殖抑制凋亡，發(fā)揮保護肝細胞的作用。但是miR-219在脂肪肝進程中起保護作用的具體機制及其下游靶基因仍需要進一步的探索。