曹 強(qiáng),李 箏

(1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102；2.湘潭市第一人民醫(yī)院病理科，湖南 湘潭 411102)

近年來，結(jié)直腸腺癌患病率呈逐年上升趨勢，結(jié)直腸腺癌的發(fā)生涉及多種基因的改變，NM23基因是一種常見的抑癌基因，NM23基因突變可通過微管聚合的異常及對細(xì)胞骨架的影響參與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移等[1]。NM23-H1對結(jié)腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移均具有抑制作用[2]。Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK-STAT)信號通路參與了多種病理過程，如炎癥、腫瘤、免疫性疾病等[3]。JAK-STAT信號通路中活化了的P-STAT信號蛋白經(jīng)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，指導(dǎo)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄[4-5]。何超月等[6]發(fā)現(xiàn)，吉馬酮可能是通過下調(diào)JAK-STAT信號通路活性抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移的。彭文等[7]發(fā)現(xiàn)，激活JAK2-STAT3通路可逆轉(zhuǎn)BCAR4沉默對食管癌EC9706細(xì)胞侵襲、遷移，以及對炎癥因子表達(dá)的抑制和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。張大為等[8]發(fā)現(xiàn)，復(fù)方苦參注射液能通過抑制JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮其對肝癌HepG2細(xì)胞增殖、侵襲的抑制作用，JIANG等[9]發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)RP11-468E2.5可抑制JAK-STAT信號通路，JAK-STAT信號通路的阻斷能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，同時(shí)可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。本研究探討了NM23-H2與JAK-STAT信號通路在結(jié)直腸腺癌的遷移過程中的作用及是否存在相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來源 選取2018年1月至2021年1月湖南省湘潭市第一人民醫(yī)院收集的結(jié)直腸腺癌病理蠟塊80個(gè)，其中腺癌35個(gè)，癌旁組織20個(gè)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25個(gè)。人結(jié)直腸腺癌SW620細(xì)胞購自上海康朗生物科技有限公司，將帶有NM23-H2基因的重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-NM23-H2)轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞命名為SW620-NM23-H2，在湖南省湘潭市中心醫(yī)院細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.1.2儀器與試劑 石蠟切片機(jī)購自河南鄭州南北儀器有限公司，UniTMA Quick-Ray手動式組織芯片制備儀購自上海宇北醫(yī)療器械有限公司，病理組織攤烤片機(jī)購自沈陽恒松科技有限公司，吹風(fēng)機(jī)、高壓鍋、離心機(jī)均由湖南省湘潭市中心醫(yī)院細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)室提供，細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺購自濟(jì)南騰昊科學(xué)儀器有限公司，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自北京東方安諾生化科技有限公司，HH-W600S電熱恒溫水箱、TGL-16WL離心機(jī)均購自常州金壇良友儀器有限公司，ECLIPSE MA100倒置顯微鏡購自北京創(chuàng)城致佳科技有限公司，24孔板、Transwell小室均購自北京明陽科華生物科技有限公司，伯樂小型電泳儀1658001購自山東濟(jì)南愛來寶儀器設(shè)備有限公司，蛋白質(zhì)印跡(Western blot)凝膠成像儀購自上海金鵬分析儀器有限公司。免疫組織化學(xué)(免疫組化)一抗——P-STAT3抗體、兔抗人多克隆抗體均購自沈陽萬類生物科技有限公司，NM23-H2抗體、兔抗人多克隆抗體均購自北京百奧萊博科技有限公司，均于-20 ℃冰箱保存。免疫組化二抗購自上海愛必信生物科技有限公司，4 ℃冰箱保存?？乖迯?fù)液——枸櫞酸緩沖液購自上海尚寶生物科技有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自天津格里斯醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司，蒸餾水、二氨基聯(lián)苯胺顯色液、載玻片、蓋玻片、中性樹膠封片劑均由湖南省湘潭市中心醫(yī)院細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)室提供，lipofectamine2000購自北京沃比森科技有限公司，G418購自青島捷世康生物科技有限公司，NM23-H2基因的重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-NM23-H2)購自武漢益普生物科技有限公司，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶均購自上?？道噬锟萍加邢薰?，結(jié)晶紫及甲醇購自上海尚寶生物科技有限公司，青霉素-鏈霉素雙抗購自上海源培生物科技有限公司，用于Western blot實(shí)驗(yàn)的P-STAT3抗體及二抗均購自沈陽萬類生物科技有限公司，RIPA裂解液購自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1組織芯片制作 將80個(gè)病理蠟塊對應(yīng)的蘇木精-伊紅(HE)染色切片逐一由病理科主治醫(yī)師進(jìn)行癌組織觀察，并與之對應(yīng)的蠟塊組織對比觀察，由此在蠟塊上對癌組織進(jìn)行定位，使用手動式組織芯片制作儀采集蠟塊中已標(biāo)記好的癌組織，轉(zhuǎn)移到空白蠟塊內(nèi)，然后將制作好的組織芯片放入60 ℃的溫箱內(nèi)，使用包埋框重新對組織芯片蠟塊進(jìn)行二次包埋，將二次包埋好的組織芯片蠟塊放入4 ℃冰箱備用。

1.2.2HE染色方法 將制作好的組織芯片從4 ℃冰箱中取出，使用石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片，切片烘烤后進(jìn)行染色：(1)將切片放入二甲苯液中停留15 min，重復(fù)1次；(2)將切片依次放入100%、90%、80%乙醇中各停留5 min；(3)切片放入蒸餾水中停留5 min；(4)將切片放入蘇木素染液中染色10 min，然后用水流沖洗2 min；(5)用鹽酸乙醇分化30 s；(6)將切片放入伊紅染色液中染色1 min；(7)依次將切片放入80%、90%、95%、100%乙醇中各2 min，取出后進(jìn)行透明并用中性樹膠封片。

1.2.3免疫組化染色 前期切片制作方法與HE染色相同，免疫組化染色步驟：(1)將切片放入3個(gè)盛有二甲苯的缸中各停留15 min；(2)依次將切片放入100%、90%、80%乙醇中各停留3 min，然后放入蒸餾水中停留5 min；(3)將切片放入盛有枸櫞酸鹽的高壓鍋中煮沸3 min后緩慢冷卻；(4)用3%過氧化氫孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶；(5)滴加正常山羊血清處理15 min；(6)在切片上滴加P-STAT3、NM23-H2抗體放置于4 ℃冰箱過夜；(7)在切片上滴加二抗，37 ℃恒溫箱孵育20 min；(8)將二氨基聯(lián)苯胺顯色液滴加適量于切片上，顯微鏡下邊觀察邊顯色，顏色出現(xiàn)黃色改變即刻終止，使用流動自來水沖洗；(9)將切片放入蘇木素液中染色1 min，自來水沖洗返藍(lán)10 min；(10)將切片分別放入80%、95%、100%乙醇中各停留5 min；(11)將切片放入二甲苯停留5 min，使用中性樹膠封片。

1.2.4結(jié)果判定 P-STAT3定位于細(xì)胞核，NM23-H2定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，P-STAT3、NM23-H2顯色后呈棕褐色或棕黃色顆粒。評分標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)切片陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分，棕黃色或棕褐色計(jì)2分，淺黃色計(jì)1分，無色計(jì)0分；(2)根據(jù)陽性細(xì)胞百分比計(jì)分，陽性細(xì)胞占0%～30%計(jì)1分，>30%～80%計(jì)2分，>80%計(jì)3分；(3)總分為陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分和陽性細(xì)胞百分比計(jì)分的乘積，0～3為陰性，>3～7分為陽性，>7～9分為強(qiáng)陽性。

1.2.5SW620細(xì)胞培養(yǎng)及SW620-NM23-H2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立 首先用75%乙醇噴灑并擦拭無菌超凈工作臺，將購買的SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含有青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液，放入二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞增殖情況，當(dāng)細(xì)胞覆蓋瓶底至80%左右時(shí)取出培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)液并用PBS吹打殘留的培養(yǎng)液，加入1 mL胰蛋白酶消化液，蓋好瓶蓋放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)細(xì)胞回縮凸起變圓時(shí)立即停止胰蛋白酶消化，并將培養(yǎng)瓶中胰蛋白酶倒掉，在培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)液，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其分散脫壁，將細(xì)胞懸液接種在新的培養(yǎng)瓶中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的SW620細(xì)胞，使用胰蛋白酶消化液消化后接種于6孔板并加入培養(yǎng)液過夜，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將含有l(wèi)ipofectamine2000的無血清培養(yǎng)基和含有pcDNA3.1-NM23-H2的無血清培養(yǎng)基混合，用槍頭輕輕上下吹打直至其混勻，將混合液室溫下放置10 min，吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，加入混合液和無血清培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)4 h后倒掉培養(yǎng)板中的液體，加入DMEM高糖培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板放入二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)24 h后用胰蛋白酶消化6孔板中的細(xì)胞進(jìn)行傳代，接種于新的6孔板中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，加入G418,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)2周后待培養(yǎng)板中長出單細(xì)胞克隆株時(shí)移至96孔板中進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)細(xì)胞長滿整個(gè)孔時(shí)用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并將其移至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，收集陽性克隆細(xì)胞。

1.2.6Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 將SW620細(xì)胞、SW620-NM23-H2細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，并用PBS洗滌1次，使用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，在下室加入DMEM高糖培養(yǎng)液，上室加入150 μL細(xì)胞懸液，繼續(xù)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，棄培養(yǎng)液，用PBS洗2次，甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次，顯微鏡下觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.2.7Western blot 待SW620細(xì)胞、SW620-NM23-H2培養(yǎng)至匯合度達(dá)85%時(shí)取出培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)液，每瓶細(xì)胞加3 mL PBS，輕輕搖動1 min，倒掉洗液，每瓶細(xì)胞加入500 μL裂解液，反復(fù)吹打轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，放置于冰上用裂解液裂解20 min，輕輕晃動培養(yǎng)瓶使細(xì)胞充分裂解，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮至培養(yǎng)瓶一側(cè)，迅速將細(xì)胞碎片及裂解液移至2 mL離心管內(nèi)，12 000 r/min離心10 min后將上清液移至0.5 mL離心管內(nèi)并于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用不同體積牛血清白蛋白(BSA)和超純水配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的BSA溶液。用移液槍分別移取100 μL配好的BSA溶液滴加至板孔中，再分別加入200 μL考馬斯亮藍(lán)，檢測各孔吸光度。將15%分離膠倒入玻璃板中，加入超純水壓膠，分離膠凝固后倒掉超純水，然后加入濃縮膠，插入齒梳濃縮膠凝固后拔出齒梳。在電泳槽內(nèi)加入電泳液后緩慢加入樣本，開始電泳，電泳結(jié)束后開始切膠，取下玻璃板輕輕分離，棄上層濃縮膠，根據(jù)泳道及Marker標(biāo)記切下蛋白相對分子質(zhì)量所對應(yīng)的膠，根據(jù)膠的尺寸剪切聚偏氟乙烯膜，由黑色面開始，依次鋪膜，即海綿、三層濾紙、膠、膜、三層濾紙、海綿，鋪膜過程中不能干，同時(shí)趕走氣泡。結(jié)束后取出膜，放入含有5%BSA的脫脂牛奶中常溫下封閉1 h后取出膜滴加一抗，4 ℃冰箱過夜，用TBST 洗膜后將膜放入二抗室溫孵育1 h后用凝膠成像系統(tǒng)顯影。

2 結(jié) 果

2.13種蠟塊P-STAT3、NM23-H2表達(dá)比較 3種蠟塊P-STAT3、NM23-H2表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3種蠟塊P-STAT3、NM23-H2表達(dá)比較

2.2NM23-H2對SW620細(xì)胞的遷移具有抑制作用 未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿膜數(shù)比穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中P-STAT3的表達(dá)明顯降低 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中P-STAT3表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

3 討 論

腫瘤特別是惡性腫瘤嚴(yán)重危害著人們的身體健康，目前，對惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的病因及機(jī)制仍沒有完全明了，結(jié)直腸腺癌發(fā)生的基因分子機(jī)制尚不太清楚，NM23基因家族是研究較早的一種抑癌基因，其家族成員有6個(gè)，研究較多的是NM23-H1及NM23-H2。NM23基因編碼蛋白質(zhì)能參與細(xì)胞紡錘體形成及細(xì)胞運(yùn)動，MN23基因突變有可能通過影響細(xì)胞運(yùn)動進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[10]。作為NM23基因家族成員之一的NM23-H2是否參與了結(jié)直腸腺癌轉(zhuǎn)移抑制作用方面的研究還不是很多，本研究對結(jié)直腸腺癌、癌旁組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)NM23-H2的表達(dá)情況進(jìn)行了免疫組化染色，結(jié)果顯示，3種組織NM23-H2表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明NM23-H2基因可能參與了結(jié)直腸腺癌的轉(zhuǎn)移，并且有可能在結(jié)直腸腺癌的轉(zhuǎn)移中具有抑制作用，本研究Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)比穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞組明顯增多，提示NM23-H2基因的高表達(dá)對結(jié)直腸腺癌細(xì)胞的遷移具有明顯的抑制作用。

在結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中存在多種信號通路的活化，殷舞等[11]通過免疫組化的方法檢測了磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR)信號通路中關(guān)鍵信號分子——PI3K、p-Akt、p-mTOR在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PI3K、Akt、mTOR信號通路在不同級別腺瘤至腺癌中均呈過度激活狀態(tài)。張果等[12]通過HE和免疫組化方法證實(shí)了Wnt/β-聯(lián)蛋白信號通路在結(jié)直腸腺癌中處于過度活化狀態(tài)。

相關(guān)信號通路的活化在結(jié)直腸腺癌增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要的角色，JAK-STAT信號通路作為細(xì)胞內(nèi)廣泛存在并參與細(xì)胞的分裂、增殖、分化、凋亡等重要生命活動過程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，以及浸潤、轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用。鄧楨等[13]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1可通過抑制JAK-STAT信號通路活性進(jìn)一步抑制肝癌細(xì)胞增殖、浸潤、遷移等，提示JAK-STAT信號通路的活化參與了胃癌的增殖及遷移。鮑軍等[14]發(fā)現(xiàn)，精子關(guān)聯(lián)抗原5能通過活化JAK-STAT信號通路增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力。有關(guān)宮頸腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，JAK2、STAT3抑制劑能降低細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。

JAK-STAT信號通路的活化是否對結(jié)直腸腺癌增殖、遷移有促進(jìn)作用，本研究通過免疫組化方法測得JAK-STAT信號通路中核心轉(zhuǎn)錄因子——P-STAT在結(jié)直腸腺癌、癌旁組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，本研究也探討了在結(jié)直腸腺癌中NM23-H2與JAK-STAT信號通路的相關(guān)性，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中JAK-STAT信號通路中關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子——P-STAT3表達(dá)量明顯低于未轉(zhuǎn)染組，提示NM23-H2對結(jié)直腸腺癌的抑制可能是通過下調(diào)JAK-STAT信號通路的活性來實(shí)現(xiàn)的，結(jié)直腸腺癌的發(fā)生是多基因多分子共同參與的結(jié)果，將為進(jìn)一步揭示結(jié)直腸腺癌發(fā)展機(jī)制、新靶點(diǎn)藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。