趙玉紅，邵 偉，吳淑華，李 勐

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.病理科；2.神經(jīng)外科，山東 濱州 256600)

星形細(xì)胞瘤是較常見的神經(jīng)上皮源性顱腦腫瘤，由膠質(zhì)細(xì)胞異常增生所致。根據(jù)異型特點(diǎn)及分化將其分成4個級別，Ⅰ級惡性水平最低，患者預(yù)后最佳；Ⅳ級則相反。惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞通常呈浸潤性生長，手術(shù)無法完全切除，復(fù)發(fā)率較高[1]。雖然手術(shù)，放、化療等是治療膠質(zhì)瘤的常見方式，但療效不佳，1年生存率僅為57%[2]。因此，探究腦星形細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制具有重要的臨床指導(dǎo)意義。Hippo-Yes相關(guān)蛋白(YAP)通路首次發(fā)現(xiàn)于果蠅中，其作用在于為細(xì)胞傳導(dǎo)信號提供渠道,可以使細(xì)胞在繁殖與死亡時基本實(shí)現(xiàn)均衡。YAP1為該通路中介入轉(zhuǎn)錄的一種重要物質(zhì)，其單獨(dú)情況下不發(fā)揮作用，在人體中主要是以磷酸化的方式介入信號傳導(dǎo)工作。有關(guān)動物實(shí)驗(yàn)表明，YAP1能使膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-聯(lián)蛋白(β-catenin)通路介入腫瘤細(xì)胞的繁殖[3-4]。為檢測人星形細(xì)胞瘤中是否也存在這種調(diào)節(jié)模式，本研究使用免疫組織化學(xué)(免疫組化)法檢查了人各級星形細(xì)胞瘤中YAP1和β-catenin的表達(dá)并分析了Hippo與Wnt信號路徑在星形細(xì)胞瘤發(fā)生及惡性進(jìn)展中的作用，以及彼此間的影響與臨床價值。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2013年1月至2020年12月本院收治的確診且有完整病理檢查資料的星形細(xì)胞瘤患者52例，其中男32例，女20例；年齡4～77歲，中位年齡36歲；Grade分級Ⅰ～Ⅱ級15例，Ⅲ級19例，Ⅳ級18例。選取同期收治的腦減壓術(shù)后正常腦組織10例作為對照組。切取組織前均未經(jīng)放、化療，由2名副高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的病理醫(yī)師依據(jù)蘇木精-伊紅染色切片及蠟塊篩選確定入選病例。

1.1.2試劑 濃縮型YAP1一抗購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，兔抗人β-catenin即用型抗體購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司，陽離子防脫片、通用型二抗PV-6000、磷酸鹽緩沖液(PBS)、乙二胺四乙酸(pH 8.0)修復(fù)液、二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒均購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。復(fù)染用蘇木素、分化液所需鹽酸、脫水涉及的不同濃度乙醇試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1檢測方法 運(yùn)用免疫組化Elivision兩步法，篩選好的蠟塊以4 μm厚度切片并撈于免疫組化專用載玻片上，70 ℃烤片30 min，常規(guī)脫蠟至水。用PBS沖洗3次，每次3 min。取出切片放置于高壓鍋乙二胺四乙酸(pH 8.0)修復(fù)液(按說明書標(biāo)準(zhǔn)配置)內(nèi)隔水熱修復(fù)13 min，冷卻至室溫后水洗切片，用PBS沖洗3次，每次3 min。3%過氧化氫液室溫孵育切片15 min后水洗，用PBS沖洗3次，每次3 min。滴加一抗(YAP1稀釋度為1∶200；β-catenin為即用型)后置于4 ℃冰箱過夜。次日由冰箱中取出復(fù)溫后水洗10 min后用PBS沖洗3次，每次3 min。滴加通用型二抗PV-6000，置37 ℃溫箱孵育30 min，取出后水洗5 min后用PBS沖洗3次，每次3 min。用新鮮配置的二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色，光學(xué)顯微鏡下控制，達(dá)到顯色標(biāo)準(zhǔn)及時入水終止顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水封片。用前期篩選好的陽性切片進(jìn)行陽性對比，用PBS代替一抗進(jìn)行陰性對比。

1.2.2結(jié)果判讀 邀請2名單獨(dú)的研究人員評價有關(guān)的免疫染色切片的得分，其對患者的臨床資料毫不了解。按染色強(qiáng)度除以陽性細(xì)胞獲得的結(jié)果核算分?jǐn)?shù)。使用陽性細(xì)胞百分比作為評分標(biāo)準(zhǔn)：0為低于5%的細(xì)胞(弱陽性)，1+為5%～<25%的細(xì)胞(弱陽性)，2+為25%～50%的細(xì)胞(陽性)，3+為超過50%的細(xì)胞(強(qiáng)陽性)。利用著色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：0為無染色，1+為淡黃色，2+為深黃色。參考染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)相加的數(shù)據(jù)得到相關(guān)化學(xué)染色得分標(biāo)準(zhǔn)：0～1為陰性，2+為弱陽性，3～4++為中度陽性，5+++為強(qiáng)陽性。

1.2.3用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因生存分析 OncoLnc屬于一種交互型嘗試生存關(guān)系的工具，使用在下載與mRNA、微小RNA或長鏈非編碼RNA(lncRNA)表達(dá)有關(guān)的臨床信息上。OncoLnc涵蓋了源于TCGA中記載的33種癌癥分析數(shù)據(jù)，累計納入了超過8 650例患者的生存信息及源于TCGA數(shù)據(jù)庫的mRNA與微小RNA的RNA-SEQ表達(dá)數(shù)據(jù)，其他源于MiTranscriptome beta數(shù)據(jù)庫的lncRNA表達(dá)也記載于其中。用戶可利用特定基因的表達(dá)對腫瘤患者實(shí)施分組處理，接著開展Kaplan-Meier研究或下載信息以便深入地開展研究。OncoLnc還保管了過去核算的生存資料，方便使用者在短時間內(nèi)查詢各種癌癥之間的生存關(guān)系。此數(shù)據(jù)庫可以使用戶在短時間內(nèi)查詢某種固定基因在不同種類癌癥中的表達(dá)，不僅如此，還能明確和其有關(guān)的新型lncRNA。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法等；采取Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同級別星形細(xì)胞瘤及正常腦組織中YAP1和β-catenin表達(dá)比較 正常腦組織中YAP1表達(dá)極少，主要著色部位為個別神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；β-catenin無明顯表達(dá)。星形細(xì)胞瘤中YAP1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，β-catenin在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中均有表達(dá)，二者表達(dá)強(qiáng)度均隨腫瘤級別增高而增強(qiáng)。見圖1。

2.2YAP1和β-catenin表達(dá)與星形細(xì)胞瘤患者臨床病理特征的關(guān)系 星形細(xì)胞瘤中YAP1的表達(dá)主要受腫瘤大小、分級影響，β-catenin的表達(dá)主要受腫瘤分級影響，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 YAP1表達(dá)與星形細(xì)胞瘤患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3YAP1和β-catenin在不同級別星形細(xì)胞瘤中表達(dá)的相關(guān)性 星形細(xì)胞瘤中YAP1 和β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.553，P<0.05)。見圖2。

表2 β-catenin表達(dá)與星形細(xì)胞瘤患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4YAP1表達(dá)與星形細(xì)胞瘤患者預(yù)后的關(guān)系 在低級別膠質(zhì)瘤、高級別膠質(zhì)瘤中YAP1高表達(dá)組患者生存期均較低表達(dá)組明顯縮短。見圖3。

3 討 論

Hippo信號通路由一系列保守激酶組成，是調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、凋亡的關(guān)鍵通路，YAP1位于下游，是通路核心效應(yīng)分子。YAP廣泛存在于性腺細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，本身并不具有轉(zhuǎn)錄活性，其是用磷酸化的方式介入細(xì)胞的信號傳導(dǎo)和下游靶分子的轉(zhuǎn)錄過程。Hippo-YAP1信號通路可與Wnt/β-catenin[5]、上皮生長因子受體[6]、磷酸肌醇-3激酶/哺乳動物雷帕霉素蛋白[7]、上游激活蛋白信號通路[8]等其他信號通路相互作用。Wnt/β-catenin通路是一個復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞膜上的β-catenin可以與鈣粘蛋白E結(jié)合起到連接細(xì)胞的作用，也可以在Wnt通路中以下游因子的身份入核并在細(xì)胞核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子，影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄[9]。通常情況下β-catenin位于降解形態(tài)時會讓細(xì)胞中保留較少的β-catenin。在獲得有關(guān)信號干預(yù)后β-catenin在細(xì)胞中無法被分解，如此將集中進(jìn)入細(xì)胞核中，干擾下游基因的轉(zhuǎn)錄?；罨腨AP1一般集中在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，但最新研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)YAP1也可通過促進(jìn)β-catenin降解、抑制Wnt信號通路的方式起到抑制腫瘤的作用[10]。

YAP1在多種腫瘤中表達(dá)增多影響腫瘤進(jìn)展和患者預(yù)后。MURAMATSU等[10]發(fā)現(xiàn)，在人類食管鱗癌染色體中YAP1基因能夠繁殖，形成高表達(dá)，增進(jìn)食管鱗癌的演化。LIU等[11]研究表明，YAP1在子宮頸鱗癌的細(xì)胞質(zhì)中為高表達(dá)，而在細(xì)胞核中正好相反；在子宮頸腺癌中YAP1呈現(xiàn)出細(xì)胞核高表達(dá)。因此，判定YAP1細(xì)胞定位與細(xì)胞功能密切相關(guān)。另有相關(guān)研究表明，胃癌中YAP1細(xì)胞核表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)后影響因素[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌中 YAP1作為促癌基因加速了腫瘤的進(jìn)展，但在乳腺癌中YAP1表達(dá)缺失，作為抑癌基因發(fā)揮作用[13-14]。BARRY等[15]和WANG等[16]研究表明，結(jié)腸癌患者中YAP1和β-catenin出現(xiàn)雙核陽性者生存期更短，提示YAP1在人結(jié)直腸癌中具有抑癌基因和促癌基因的雙重作用。ORR等[17]發(fā)現(xiàn)，高級別膠質(zhì)瘤中YAP1的表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常腦組織，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Ⅳ級)中YAP1細(xì)胞核陽性率大于10%，且與生存時間呈負(fù)相關(guān)[18]。以往研究發(fā)現(xiàn)，YAP缺乏相關(guān)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，不能單獨(dú)發(fā)揮作用，但YAP能通過與目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子，如TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(Tead)結(jié)合而發(fā)揮作用[19]。Wnt通路失活的狀態(tài)下YAP與β-catenin的N-末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合并一起移動至細(xì)胞核中，YAP和β-catenin各自與Tead和 T細(xì)胞因子相互作用形成YAP-Tead-β-catenin-T細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄；當(dāng)Wnt被激活時YAP和β-catenin從復(fù)合物中脫離出來，YAP從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，激活Hippo通路，上游因子磷酸化YAP，參與Wnt信號通路的調(diào)節(jié)并阻礙β-catenin的核定位，進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)錄活性。β-catenin在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用依賴于Wnt蛋白的表達(dá)，其在腫瘤細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均可表達(dá)。而YAP1在腫瘤細(xì)胞中磷酸化前后也呈現(xiàn)出不同的細(xì)胞定位。因此，YAP1在多種腫瘤形成中具有組織細(xì)胞特異性且作用并不明確，在不同級別星形細(xì)胞瘤中發(fā)揮抑癌還是促癌作用也不清楚。不同激活方式、涉及的下游通路決定了二者表達(dá)及相互作用時的多種定位組合；腫瘤類型也影響了YAP1和β-catenin的相互關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，YAP1主要定位于星形細(xì)胞瘤的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)。在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)高于正常腦組織。高級別星形細(xì)胞瘤中表達(dá)明顯高于低級別星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)。在高級別星形細(xì)胞瘤中YAP1細(xì)胞核陽性率明顯提高，相關(guān)生存分析也顯示了與文獻(xiàn)報道的高度一致性。此外，相關(guān)分析顯示，星形細(xì)胞瘤中YAP1和β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)，這意味著YAP1和β-catenin在星形細(xì)胞瘤的繁殖活動中的確具有協(xié)同效果。進(jìn)一步與臨床參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，YAP1和β-catenin在星形細(xì)胞瘤的表達(dá)主要與腫瘤大小、級別相關(guān)，同時，YAP1和β-catenin的協(xié)同作用使患者壽命大為縮短。與前期多種相關(guān)研究結(jié)果較為吻合，為深入分析星形細(xì)胞瘤的發(fā)病原因奠定了理論基礎(chǔ)。但本研究也觀察到，YAP1主要在星形細(xì)胞瘤的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；β-catenin則主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核中表達(dá)較少，越高級別星形細(xì)胞瘤中β-catenin更傾向于集中在細(xì)胞膜上。二者在星形細(xì)胞瘤中呈現(xiàn)復(fù)雜的細(xì)胞定位。盡管如此，二者細(xì)胞定位的組合未影響其在腫瘤中的表達(dá)差異及相關(guān)性。涉及大腸癌的一篇文獻(xiàn)提到，Hippo下調(diào)和β-catenin上調(diào)是由于磷酸化后的YAP和存在于細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin結(jié)合后影響β-catenin的入核[20]。這就很好地解釋本研究在星形細(xì)胞瘤中觀察到的YAP1和β-catenin的細(xì)胞定位情況。

綜上所述，YAP1和β-catenin在人星形細(xì)胞瘤中有表達(dá)差異且呈正相關(guān)，不受二者細(xì)胞定位的影響，YAP1和β-catenin的協(xié)同表達(dá)影響患者預(yù)后，二者可作為調(diào)節(jié)星形細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)標(biāo)記。此外，鑒于本研究樣本數(shù)及研究方法的局限性，只初步探討了星形細(xì)胞瘤中YAP1和β-catenin在轉(zhuǎn)錄水平上的相互作用。而作為較易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的腫瘤，星形細(xì)胞瘤的進(jìn)展很大程度上取決于血管增殖，新生血管的大量增加加速了腫瘤浸潤、生長并破壞周圍腦組織。Hippo信號通路能調(diào)節(jié)VEGF，β-catenin也可介入基質(zhì)金屬蛋白酶的轉(zhuǎn)錄，這都是涉及血管形成的相關(guān)調(diào)控機(jī)制[21]。Hippo/YAP1和Wnt/β-catenin通路在星形細(xì)胞瘤血管增殖中發(fā)揮作用的具體過程及與其他信號通路的交互作用將是今后研究的重點(diǎn)。下一步計劃擴(kuò)充病例數(shù)，在分子水平上進(jìn)一步增加血管增殖方面的檢測，進(jìn)一步探尋干擾星形細(xì)胞瘤惡化進(jìn)展的結(jié)合點(diǎn)。