昌家宇，丁清穎，肖轉(zhuǎn)泉，王宗德，張 驥，陳尚钘*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院；國家林業(yè)草原木本香料(華東)工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330045；2.江西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江西 南昌 330027)

松枯梢病是一種世界性林木病害，是分布范圍最廣的林木真菌病害之一，它使許多國家的松樹人工林受到巨大損失。據(jù)統(tǒng)計，全世界已有近30個國家報道了松枯梢病的發(fā)生與危害[1]。1999年，松枯梢病在中國多省引起了松樹大面積枯死的現(xiàn)象，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失，因此研究人員把松枯梢病列為中國重要的森林病害并進(jìn)行深入研究[2]。在中國，引起松枯梢病的病原菌主要是松球殼孢菌(Sphaeropsissapinea)，該菌株適宜在24～28 ℃、pH值6.0條件下生長，對樟子松、馬尾松、濕地松、火炬松、多脂松等都有很大的危害，它會引起頂芽、新梢及叢枝枯死，枝干潰瘍、變褐等發(fā)病癥狀[3]。目前，在松枯梢病的防治方面，主要有營林技術(shù)措施、化學(xué)防治和生物防治。其中化學(xué)防治是較為常用且實用的方法，能快速及時地防止病情的傳播，是林間常用的防控方法，所用的化學(xué)藥劑有波爾多液、苯醚甲環(huán)唑和多菌靈等藥劑[4]。據(jù)文獻(xiàn)報道，25%的苯醚甲環(huán)唑?qū)φ磷铀煽萆也〔≡z生長及孢子萌發(fā)能起到較好的抑制作用[5]；77%氫氧化銅可濕性粉劑及50%多菌靈可濕性粉劑對松枯梢病的抑制效果較好[6]。

松節(jié)油是我國產(chǎn)量較大的天然產(chǎn)物之一，其主要成分α-蒎烯和β-蒎烯是很好的林產(chǎn)化工原料。王宗德等在α-蒎烯和β-蒎烯的深加工化學(xué)利用方面，合成了許多系列的衍生物。研究發(fā)現(xiàn)由α-蒎烯作原料合成的(E)-莰烯醛肟及其烷基醚[7]、莰烯腈[8]、內(nèi)型異莰烷基甲醛肟[9]，以及由β-蒎烯作原料合成的氫化諾卜基季銨鹽[10-11]等對松枯梢病原菌都具有顯著的抑制作用。季銨鹽類化合物是一類性能優(yōu)良的陽離子表面活性劑，具有化學(xué)性能穩(wěn)定、廣譜抗菌、低毒高效和使用方便等優(yōu)點；開發(fā)新型植物源季銨鹽類化合物，對于新型綠色高效植物源抑菌劑的開發(fā)和應(yīng)用都具有十分重要的意義。因此，本研究采用菌絲生長速率法就含單氫化諾卜基的單季銨鹽、含雙氫化諾卜基的單季銨鹽與含雙氫化諾卜基的雙子季銨鹽三個系列共36種化合物對松枯梢病原菌(S.sapinea)生長的抑制率作了測定與對比，并選擇其中4種化合物進(jìn)行抑菌機(jī)理試驗，以期為氫化諾卜基季銨鹽類化合物開發(fā)成為有效殺滅松枯梢病原菌的化學(xué)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 氫化諾卜基季銨鹽類化合物的來源

13個含單氫化諾卜基的單季銨鹽，由氫化諾卜基二烷基叔胺和鹵代烴反應(yīng)合成得到[12-13]，分別為氫化諾卜基二甲基乙基溴化銨(1)、氫化諾卜基二甲基丙基溴化銨(2)、氫化諾卜基二甲基正丁基溴化銨(3)、氫化諾卜基二甲基正戊基溴化銨(4)、氫化諾卜基二甲基乙基碘化銨(5)、氫化諾卜基二甲基丙基碘化銨(6)、氫化諾卜基二甲基正丁基碘化銨(7)、氫化諾卜基二乙基丙基溴化銨(8)、氫化諾卜基二乙基正丁基溴化銨(9)、氫化諾卜基二乙基正戊基溴化銨(10)、氫化諾卜基二乙基正癸基溴化銨(11)、氫化諾卜基二乙基丙基碘化銨(12)、氫化諾卜基二乙基正丁基碘化銨(13)。

5個含雙氫化諾卜基的單季銨鹽，由氫化諾卜基鹵代物和含氫化諾卜基的叔胺反應(yīng)合成得到[10]，分別為：雙氫化諾卜基二甲基溴化銨(14)、雙氫化諾卜基二甲基碘化銨(15)、雙氫化諾卜基二乙基溴化銨(16)、雙氫化諾卜基二乙基碘化銨(17)、N,N-雙氫化諾卜基溴化哌啶(18)。

余下18個含雙氫化諾卜基的雙子季銨鹽，由氫化諾卜基二烷基叔胺和α,ω-二鹵代烷反應(yīng)合成得到[11,14-15]，分別為：二亞甲基-1,2-雙(氫化諾卜基二甲基溴化銨)(19)、三亞甲基-1,3-雙(氫化諾卜基二甲基溴化銨)(20)、四亞甲基-1,4-雙(氫化諾卜基二甲基溴化銨)(21)、五亞甲基-1,5-雙(氫化諾卜基二甲基溴化銨)(22)、六亞甲基-1,6-雙(氫化諾卜基二甲基溴化銨)(23)、四亞甲基-1,4-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨)(24)、五亞甲基-1,5-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨)(25)、六亞甲基-1,6-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨)(26)、三亞甲基-1,3-雙(氫化諾卜基二乙基溴化銨)(27)、四亞甲基-1,4-雙(氫化諾卜基二乙基溴化銨)(28)、(五亞甲基-1,5-雙(氫化諾卜基二乙基溴化銨)(29)、六亞甲基-1,6-雙(氫化諾卜基二乙基溴化銨)(30)、1,4-二芐基-雙(氫化諾卜基二甲基溴化銨)(31)、1,4-二芐基-雙(氫化諾卜基二乙基溴化銨)(32)、1,4-二芐基-雙(氫化諾卜基二丙基溴化銨)(33)、1,4-二芐基-雙(氫化諾卜基二甲基氯化銨)(34)、1,4-二芐基-雙(氫化諾卜基二乙基氯化銨)(35)、1,4-二芐基-雙(氫化諾卜基二丙基氯化銨)(36)。

3個系列共36種含氫化諾卜基的季銨鹽類化合物均為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林產(chǎn)化工研究所提供，結(jié)構(gòu)通式如圖1所示。

1.R=C2H5, X=Br; 2.R=C3H7, X=Br; 3.R=n-C4H9, X=Br; 4.R=n-C5H11, X=Br; 5.R=C2H5, X=I; 6.R=C3H7, X=I; 7.R=n-C4H9, X=I; 8.R=C3H7, X=Br; 9.R=n-C4H9, X=Br; 10.R=n-C5H11, X=Br; 11.R=n-C10H21, X=Br; 12.R=C3H7, X=I; 13.R=n-C4H9, X=I; 14.R=CH3, X=Br; 15.R=CH3, X=I; 16.R=C2H5, X=Br; 17.R=C2H5, X=I; 18.R,R=CH2(CH2)3CH2, X=Br; 19.R=CH3, X=Br, M=(CH2)2; 20.R=CH3, X=Br, M=(CH2)3; 21.R=CH3, X=Br, M=(CH2)4; 22.R=CH3, X=Br, M=(CH2)5; 23.R=CH3, X=Br, M=(CH2)6; 24.R=CH3, X=Cl, M=(CH2)4; 25.R=CH3, X=Cl, M=(CH2)5; 26.R=CH3, X=Cl, M=(CH2)6; 27.R=C2H5, X=Br, M=(CH2)3; 28.R=C2H5, X=Br, M=(CH2)4; 29.R=C2H5, X=Br, M=(CH2)5; 30.R=C2H5, X=Br, M=(CH2)6; 31.R=CH3, X=Br, M=1,4-CH2-C6H4-CH2; 32.R=C2H5, X=Br, M=1,4-CH2-C6H4-CH2; 33.R=C3H7, X=Br, M=1,4-CH2-C6H4-CH2; 34.R=CH3, X=Cl, M=1,4-CH2-C6H4-CH2; 35.R=C2H5, X=Cl, M=1,4-CH2-C6H4-CH2; 36.R=C3H7, X=Cl, M=1,4-CH2-C6H4-CH2

1.2 試劑與儀器

百菌清和多菌靈，均為市售產(chǎn)品。松球殼孢菌(Sphaeropsissapinea)，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)教研室提供。

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-10無菌超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；CHP-250智能培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器公司；Quanta250掃描電子顯微鏡(SEM)，美國FEI公司；UV-5500紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；DDS-307電導(dǎo)率儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 化合物抑菌活性的測定

采用菌絲生長速率法[16]測試化合物對松枯梢病原菌的抑菌活性。以98%百菌清和多菌靈作為陽性對照，不加任何化合物的PDA培養(yǎng)基平板作為空白對照。將化合物用無菌水配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的溶液，通過二倍稀釋法得到5個濃度梯度的溶液，將其與滅菌過的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基以一定的體積比混合，得到質(zhì)量濃度為200、100、50、25和12.5 mg/L的含藥培養(yǎng)基，每組重復(fù)3次。接菌后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天，待空白對照組平板的菌落直徑生長至整個培養(yǎng)皿的2/3左右，用十字交叉法測量其菌落直徑，根據(jù)直徑計算得到化合物對菌絲生長的抑制率，計算公式如下：

校正直徑=菌落平均直徑-菌餅直徑(0.5 cm)

采用DPS 7.0建立毒力回歸方程，以化合物質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)(x)，抑制率轉(zhuǎn)換的機(jī)率值為縱坐標(biāo)(y)，毒力回歸方程為：y=a+bx，當(dāng)y=50%時，求出其抑菌的半數(shù)有效質(zhì)量濃度(EC50)。

1.4 化合物抑菌機(jī)理探究

1.4.1菌絲生長量的測定 經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌餅與滅菌過的50 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基置于錐形瓶中在搖床進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時分別加入10 mL的4種化合物藥液，使其終濃度為相應(yīng)的EC50值，以無菌水替代藥液作空白對照，并繼續(xù)培養(yǎng)至生長穩(wěn)定期。將菌絲進(jìn)行抽濾并用無菌水洗滌，置于恒溫干燥箱中干燥至質(zhì)量恒定并稱質(zhì)量，得到菌絲干質(zhì)量[17]。

1.4.2細(xì)胞膜通透性測定 將處于生長穩(wěn)定期的松枯梢病菌菌絲進(jìn)行抽濾并用無菌水洗滌，得到新鮮菌絲。稱取0.5 g松枯梢病菌菌絲于50 mL燒杯中，并分別加入10 mL EC50濃度下的化合物藥液，以無菌水替代藥液作空白對照。選用電導(dǎo)率儀分別測定藥液處理0、20、40、60、80、100、120、140、160和180 min后的菌絲電導(dǎo)率，最后置于沸水中加熱進(jìn)行死處理5 min后測定其電導(dǎo)率。每組樣品重復(fù)測定3次，以相對電導(dǎo)率(η)來表示細(xì)胞膜通透性[18]，計算公式如下：

式中：C1—處理不同時間后的電導(dǎo)率，S/m；C0——0 min時的電導(dǎo)率，S/m；C死處理—死處理時的電導(dǎo)率，S/m。

1.4.3SEM分析 將4個化合物用無菌水配制成的溶液與滅菌過的PDA培養(yǎng)基以一定的體積比混合，得到最終質(zhì)量濃度為相應(yīng)EC50值的含藥培養(yǎng)基，接菌后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天。選用經(jīng)EC50濃度處理的松枯梢病菌菌絲作為電鏡觀察對象，挑取少許的菌絲于干凈的蓋玻片上置于離心管中，加入2.5%戊二醛進(jìn)行固定；固定后用0.1 mol/L、pH值為7.0的磷酸緩沖液漂洗，去除多余的戊二醛；再用5個梯度濃度(50%、70%、80%、90%和95%)的乙醇溶液進(jìn)行脫水，每個濃度處理15 min，再用無水乙醇處理2次，每次處理10 min；脫水結(jié)束后取出蓋玻片，自然干燥，置于干燥器中保存；最后經(jīng)噴金處理后便可上鏡觀察[19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物對松枯梢病原菌的抑制作用

含單氫化諾卜基的單季銨鹽(1～13)、含雙氫化諾卜基的單季銨鹽(14～18)和含雙氫化諾卜基的雙子季銨鹽(19～36)共36個化合物，以及百菌清、多菌靈在藥液質(zhì)量濃度為50 mg/L時，對松枯梢病原菌的抑制率、毒力回歸方程和EC50值見表1。從表1數(shù)據(jù)來看，在藥液質(zhì)量濃度為50 mg/L時，含雙氫化諾卜基的單季銨鹽、含雙氫化諾卜基的雙子季銨鹽對松枯梢病原菌的抑制率均比百菌清和多菌靈高，大多數(shù)化合物的抑制率都在90%以上，其中還有18個化合物的抑制率高達(dá)100%。由表1還可以看出，含氫化諾卜基的雙子季銨鹽類化合物對松枯梢病原菌的抑制率都很高，除36(73.75%)外，幾乎都達(dá)100%；雙氫化諾卜基的單季銨鹽，有溴離子的化合物(14、16、18)抑菌率都達(dá)100%。文獻(xiàn)[20]報道50%多菌靈可濕性粉劑對松枯梢病原菌有明顯的防治效果。本研究所用的藥液質(zhì)量濃度為50 mg/L，相當(dāng)于1 g化合物要稀釋到20 000倍。從表1數(shù)據(jù)可以看出，含氫化諾卜基的雙子季銨鹽對松枯梢病原菌的抑制效果均明顯強(qiáng)于含氫化諾卜基的單季銨鹽，且大多數(shù)雙子季銨鹽的EC50值均低于對照樣百菌清和多菌靈。

表1 季銨鹽類化合物對松枯梢病菌的抑制率、EC50及毒力回歸方程

根據(jù)以上抑菌作用分析，含雙氫化諾卜基的單季銨鹽和雙子季銨鹽對松枯梢病原菌的抑制效果明顯，因此選用了不同類型的具有明顯抑菌效果的4種化合物：14、26、28和31，從菌絲干質(zhì)量、細(xì)胞膜通透性以及菌絲結(jié)構(gòu)3個方面，來初步探究其對松枯梢病菌的抑菌機(jī)理。

2.2 4種化合物對松枯梢病菌的抑菌機(jī)理研究

2.2.1對菌絲干質(zhì)量的影響 經(jīng)不同化合物處理后的菌絲干質(zhì)量結(jié)果見圖2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種化合物處理后的菌絲干質(zhì)量均低于空白對照組，且造成了不同程度的抑制效果。例如化合物31的抑制效果最為明顯，抑制率達(dá)到了50%以上；其次是化合物26，抑制率為23.67%。由此可知，4種化合物能夠在一定程度上抑制松枯梢病菌菌絲的生長。

圖2 藥液處理后的松枯梢病菌菌絲干質(zhì)量變化

2.2.2對細(xì)胞膜通透性的影響 4種化合物對松枯梢病菌細(xì)胞膜通透性的作用結(jié)果見圖3。由圖可知，處理組與空白對照組的相對電導(dǎo)率隨著時間的推移均不同程度的升高，且處理組的相對電導(dǎo)率均高于空白對照組。因此，可以看出4種化合物對松枯梢病菌細(xì)胞膜造成了不同程度的損傷。當(dāng)藥液處理60 min時，4種化合物的相對電導(dǎo)率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組，其中14的相對電導(dǎo)率為27.0%，是空白對照組的2倍。由以上結(jié)果可以推測化合物破壞了松枯梢病菌細(xì)胞膜的完整性，增加了細(xì)胞膜的通透性，從而導(dǎo)致相對電導(dǎo)率顯著升高。

2.2.3對菌絲體形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響 經(jīng)4種化合物處理后松枯梢病菌菌絲的掃描電鏡圖見圖4。由圖可知，空白對照組(圖4(e))的松枯梢病菌菌絲細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，呈圓柱形，菌絲體光滑均勻；而經(jīng)4種化合物處理的松枯梢病菌菌絲體(圖4(a)～圖4(d))形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，菌絲出現(xiàn)扭曲，表面褶皺明顯，菌絲體粗細(xì)不一，甚至在局部菌絲體表面有脊?fàn)钔黄?。推測4種化合物均可以改變松枯梢病菌菌絲體形態(tài)，從而可能破壞菌絲體的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致菌絲死亡。

a.14; b.26; c.28; d.31; e.CK

3 結(jié) 論

3.1采用菌絲生長速率法測試了含單氫化諾卜基的單季銨鹽、含雙氫化諾卜基的單季銨鹽和含雙氫化諾卜基的雙子季銨鹽共36種化合物對松枯梢病菌的抑制率，結(jié)果表明：在質(zhì)量濃度為50 mg/L時，含雙氫化諾卜基的季銨鹽對松枯梢病菌具有明顯的抑制效果，抑制率均高于陽性對照百菌清和多菌靈，且雙子季銨鹽的抑制效果明顯強(qiáng)于單季銨鹽。

3.2從松枯梢病菌菌絲干質(zhì)量、細(xì)胞膜通透性以及菌絲結(jié)構(gòu)3個方面初步探究了4種化合物對松枯梢病菌的抑制機(jī)理，結(jié)果表明：經(jīng)14、26、28和31這4種化合物處理后的松枯梢病菌的菌絲干質(zhì)量減少，說明4種化合物均一定程度地抑制了菌絲的生長；相比空白對照，4種化合物處理后的相對電導(dǎo)率明顯升高，說明化合物破壞了松枯梢病菌細(xì)胞膜的完整性；掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn)，處理后的菌絲體形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變。本研究初步探究了含氫化諾卜基季銨鹽對松枯梢病菌的抑菌機(jī)理，后續(xù)可從核酸、蛋白質(zhì)以及酶活性等多方面進(jìn)一步深入研究。