袁東琴，姜康，張宇，李冬，賀佳敏，范廣俊，孫娜*（.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院藥學部，遼寧 大連 602；2.大連醫(yī)科大學藥學院，遼寧 大連 6044；.復旦大學附屬金山醫(yī)院，上海 200540）

中藥注射劑因起效快、生物利用度高，被廣泛應用于臨床治療中，但是相關不良反應的報道也逐年增加。不良反應病例報告調查結果顯示，中藥注射劑引起的不良反應占中藥引起的所有不良反應的40%以上[1]，過敏反應是其中占比較高的一項不良反應[2]。目前，中藥注射劑的過敏反應已成為我國公眾關注的主要問題之一，但是由于中藥注射劑成分復雜，對于其引發(fā)的過敏反應的特點及其機制研究并沒有形成統(tǒng)一的定論，因此，建立一種簡單、可靠的方法來預測中藥注射劑的過敏反應具有廣泛應用前景。

熱毒寧注射液是目前常用的一類清熱解毒類中藥注射液，由青蒿、金銀花和梔子3味常用中藥精制而成，具有清熱、疏風、解毒的功效，臨床主要用于治療外感風熱所致的感冒、咳嗽及急性支氣管炎等[3]，目前已將熱毒寧注射液加入到新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的診療方案中[4]。

隨著熱毒寧注射液臨床應用范圍的擴大，有關不良反應的研究報道也逐漸增多。熱毒寧注射液最常見的不良反應是過敏反應，臨床表現主要為皮膚瘙癢和斑丘疹等，大多數不良反應發(fā)生在用藥后30 min內[5-6]；且血清免疫毒理學研究表明，熱毒寧注射液過敏反應可能是由免疫球蛋白E（IgE）介導的Ⅰ型過敏反應[7]，但也有研究顯示臨床使用劑量下，熱毒寧注射液及其主要成分綠原酸單次給藥不會誘導大鼠嗜堿性粒細胞白血病細胞（RBL-2H3）釋放組胺[8]。因研究方法和手段的單一性導致熱毒寧注射液過敏反應的研究并沒有形成統(tǒng)一的定論，因此本研究以RBL-2H3作為評價模型，探討熱毒寧注射液對RBL-2H3的影響及其可能的致敏機制，為進一步的基礎研究及臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 細胞和試藥

RBL-2H3（武漢普諾賽生命科技有限公司）。熱毒寧注射液（批號：200714，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司），鈣離子載體A23187（批號：128M4161M）、β-氨基己糖苷酶（β-hex）底物溶液（批號：SLBR7548V）（美國Sigma公司），0.33%中性紅染料（批號：201904216，北京索萊寶科技有限公司），MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（批號：SC122-01，北京賽文創(chuàng)新科技有限公司），大鼠白介素4（IL-4）ELISA試劑盒（批號：E-ELR0014c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司），Fluo-3 AM Ca2＋熒光探針（批號：S1056，上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱MCO-20AIC（日本Sanyo公司），多功能酶標儀SpectraMax190（美國Molecular Devices公司），倒置顯微鏡DMI1（中國Leica公司），倒置熒光顯微鏡Leica DMI8（德國徠卡公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組

RBL-2H3采用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代比例為1∶3，每2～3日傳代一次。實驗分組為：對照組（正常細胞未加藥處理），熱毒寧注射液（25、50、100、200 μL·mL－1）處理組，陽性對照組（鈣離子載體A23187，1μmol·L－1）。

2.2 細胞脫顆粒

2.2.1β-hex釋放率的測定 取對數期的RBL-2H3，以1×105/孔接種于24孔板孵育過夜，棄上清液，用Tyrode’s buffer溶液洗滌細胞兩次，在室溫下加入Tyrode’s buffer溶液、不同濃度的熱毒寧注射液和1% Triton X-100、鈣離子載體A23187孵育1 h，冰浴10 min終止反應，取50 μL上清液于96孔板中，同時加入50 μL的β-hex底物溶液孵育1 h，加入Na2CO3/NaHCO3緩沖液，5 min內于酶標儀上405 nm處檢測各組OD值。

2.2.2 中性紅染色 取“2.2.1”項下24孔板，用Tyrode’s buffer溶液洗滌細胞兩次，加入中性紅染色（0.33%）孵育5 min，棄上清液，倒置顯微鏡下觀察脫顆粒的RBL-2H3并拍照。

2.3 細胞活力測定

取對數期的RBL-2H3，以1×104/孔接種于96孔板孵育過夜，每孔加入不同濃度的熱毒寧注射液孵育1 h，每孔加入20 μL MTT工作液，孵育4 h，棄上清液，加入100 μL DMSO孵育15 min，待結晶全部溶解時于酶標儀上570 nm處檢測各組OD值。

2.4 ELISA法檢測 IL-4的釋放量

取對數期的RBL-2H3，以1×106/孔接種于6孔板，孵育過夜，每孔加入Tyrode’s buffer溶液、不同濃度的熱毒寧注射液和鈣離子載體A23187孵育1 h。使用ELISA試劑盒檢測上清液中IL-4的含量。

2.5 細胞內Ca2＋濃度測定

取對數期的RBL-2H3，以5×104/孔接種于24孔板，孵育過夜，用PBS洗滌細胞兩次，加入3.5 mmol·L－1Fluo-3 AM Ca2＋孵育30 min，用PBS清洗兩次，加入1 mL PBS孵育20 min，熱毒寧注射液在初始成像后10 s加入到孔中，在倒置熒光顯微鏡下拍攝不同時間（0、30、50、70、90 s）的熒光圖片。

2.6 統(tǒng)計分析

所有計量資料均以均數±標準差（±s）表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義；其中Ca2＋相對熒光強度曲線運用Image J軟件分析90 s內的細胞熒光圖片，以F/F0為縱坐標，繪制相對熒光強度變化曲線圖。

3 結果

3.1 熱毒寧注射液引起RBL-2H3脫顆粒

3.1.1 熱毒寧注射液對β-hex釋放的影響 如圖1所示，與對照組相比，隨著熱毒寧注射液濃度的增加，β-hex的釋放率顯著增加，且呈劑量依賴性，其中熱毒寧注射液濃度在100、200 μL·mL－1時，β-hex的釋放率分別為（17.39±2.464）%，（26.39±4.391）%（P＜0.01）。由此可見，熱毒寧注射液可劑量依賴性地引起β-hex的釋放率增加。

圖1 熱毒寧注射液對β-hex釋放率的影響Fig 1 Effect of Reduning injection on the releasing rate of β-hex

3.1.2 RBL-2H3脫顆粒后的細胞形態(tài)變化 如圖2所示，用中性紅染液對處理之后的細胞進行染色，從倒置顯微鏡中可以觀察到，正常的RBL-2H3呈梭形，細胞膜完整（見圖2A）；而用熱毒寧注射液處理的細胞出現脫顆?，F象（見圖2B），細胞體積變大，細胞膜破裂，細胞內有空泡產生；圖2C 為1% Triton X-100裂解的細胞，細胞已無清晰形態(tài)，細胞內顆粒變少，而細胞外可看到一些被染色的顆粒。

圖2 RBL-2H3脫顆粒后的細胞形態(tài)變化（×10）Fig 2 Morphological change of RBL-2H3 after degranulation（×10）

3.2 熱毒寧注射液對細胞活力的影響

采用MTT法檢測熱毒寧注射液對RBL-2H3活力的影響，結果如圖3所示，熱毒寧注射液在25、50、100、200 μL·mL－1時，對細胞的活性無明顯影響。

圖3 熱毒寧注射液對細胞活力的影響Fig 3 Effect of Reduning injection on cell viability

3.3 熱毒寧注射液對IL-4釋放的影響

如圖4所示，隨著熱毒寧注射液濃度的增加，IL-4的釋放濃度與對照組相比顯著增加，且呈劑量依賴性，其中熱毒寧注射液濃度在50、100、200 μL·mL－1時，IL-4的釋放濃度分別為（8.009±1.1）pg·mL－1、（12.62±0.88）pg·mL－1、（15.13±1.1）pg·mL－1，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖4 熱毒寧注射液對IL-4釋放的影響Fig 4 Effect of Reduning injection on IL-4 release

3.4 熱毒寧注射液對細胞內Ca2＋的影響

從圖5中，可以明顯觀察到，RBL-2H3在不同濃度的熱毒寧注射液作用下，細胞內熒光強度發(fā)生明顯改變，在熱毒寧注射液作用細胞30 s時，Ca2＋熒光強度明顯增強，而隨著作用時間的推移，Ca2＋熒光強度呈現降低的趨勢。

圖5 熱毒寧注射液對RBL-2H3熒光強度的影響（×10）Fig 5 Effect of Reduning injection on the fluorescence intensity of RBL-2H3（×10）

運用Image J軟件分析90 s內記錄的各細胞熒光圖片的熒光強度，以F/F0為縱坐標，繪制RBL-2H3在熱毒寧注射液作用下細胞的相對熒光強度變化曲線。如圖6所示，細胞在作用30 s內有一定熒光強度增加的趨勢，隨著作用時間的推移，細胞的熒光強度開始逐漸降低，表明胞內 Ca2＋濃度在升高之后逐漸降低。

圖6 RBL-2H3相對熒光強度變化曲線Fig 6 Change curve of relative fluorescence intensity of RBL-2H3

4 討論

中藥注射劑誘發(fā)的過敏反應已引起廣泛關注，雖然目前已有大量研究探索中藥注射劑過敏反應的特點及其致敏機制，如有關雙黃連注射液[9-10]、清開靈注射液[11]的研究，但是由于中藥注射劑成分以及制備工藝等的復雜性，對于其引發(fā)的過敏反應的特點及其機制研究并沒有形成統(tǒng)一的定論，目前通過檢測相關炎性介質的含量變化，并深入探究其致敏機制已成為研究的趨勢。

自從1981年以來，RBL-2H3已被廣泛用作肥大細胞模型，RBL-2H3易培養(yǎng)且對FcεRI介導的機制具有特異性反應等特點[12]，近些年興起的檢測藥物致敏性的體外模型[13]，為了探究熱毒寧注射液引起的速發(fā)型過敏反應的特點及其機制，本研究選用RBL-2H3作為細胞模型，研究發(fā)現在用不同濃度的熱毒寧注射液與RBL-2H3孵育30 min，通過中性紅染色可明顯看出細胞出現脫顆粒現象。脫顆粒是肥大細胞發(fā)生過敏反應時的重要現象，細胞脫顆粒之后，由中性紅染色法或者甲苯胺藍染色法可以明顯看出細胞有空泡形成，由此可見，熱毒寧注射液引起RBL-2H3脫顆粒，推斷熱毒寧注射液可能會引起速發(fā)型過敏反應。

同時選用過敏反應的重要標志物β-hex、IL-4作為釋放介質的檢測指標[14]，對熱毒寧注射液引發(fā)的速發(fā)型過敏反應進行綜合評價。研究發(fā)現隨著熱毒寧注射液濃度的升高，β-hex以及IL-4的釋放率明顯增加，且呈劑量依賴性。研究表明熱毒寧注射液可引起RBL-2H3的脫顆粒，但是如果實驗所設置的藥物濃度對細胞有毒性作用，影響細胞的活力，同樣會使細胞出現脫顆?，F象，為排除此影響因素，選用MTT法探究所設置濃度下熱毒寧注射液對細胞活力的影響，研究表明在熱毒寧注射液所設置濃度下對細胞活力并沒有影響，進一步證實熱毒寧注射液可引起RBL-2H3的脫顆粒，引發(fā)速發(fā)型過敏反應。

鈣運動與肥大細胞脫顆粒的機制密切相關，當肥大細胞被激活時，細胞間Ca2＋濃度增加，釋放細胞質顆粒中包含的炎癥介質，引起肥大細胞脫顆粒[15]。本研究用Fluo-3 AM Ca2＋熒光探針探究熱毒寧注射液作用于RBL-2H3時，細胞內Ca2＋濃度變化，結果細胞均在作用30 s內有一定熒光強度增加的趨勢，隨著作用時間的推移，細胞的熒光強度開始逐漸降低，表明胞內鈣離子濃度在致敏90 s內逐漸升高之后逐漸降低，提示熱毒寧注射液可能通過調節(jié)Ca2＋內流而引起RBL-2H3的脫顆粒。

綜上所述，熱毒寧注射液可劑量依賴性地引起RBL-2H3脫顆粒，其機制可能是通過調節(jié)細胞內Ca2＋濃度而發(fā)揮作用，本研究進一步證實了熱毒寧注射液過敏反應患者的血清免疫毒理學研究結果，為探究熱毒寧注射液誘發(fā)的速發(fā)型過敏反應提供一定的實驗依據，其具體的作用機制，需要進一步深入研究。