俞磊明，張娜，李琦，朱光明，黃維，王衛(wèi)華，姜云耀*（.上海市藥材有限公司，上海 0008；.清華大學(xué)藥學(xué)院 中藥研究院，北京 00084；.清華大學(xué)藥學(xué)院 藥物藥學(xué)技術(shù)中心代謝平臺(tái)，北京 00084）

中藥麥冬為百合科沿階草屬植物麥冬

Ophiopogon japonicus

（

L.f

）Ker-Gawl.的 干 燥 塊根，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品。麥冬味甘、微苦、性涼，有養(yǎng)陰生津、清心除煩的功效，且有抗血栓、抗衰老、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、心肌保護(hù)等藥理活性。近年來，麥冬市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大，為確保產(chǎn)量，麥冬栽培品中農(nóng)藥、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用越來越頻繁。據(jù)報(bào)道，四川栽培的麥冬（川麥冬）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑用量較大，過度使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑影響麥冬的品質(zhì)和安全性。多效唑是麥冬種植中廣泛應(yīng)用的三唑類植物生長(zhǎng)延緩劑，對(duì)麥冬塊根增產(chǎn)效果顯著，目前已成為麥冬藥材種植中普遍施用的生長(zhǎng)激素。本研究建立了UPLCMS/MS法測(cè)定麥冬中多效唑殘留情況，同時(shí)采用UPLC-QTOF-MS及紫外分光光度法對(duì)麥冬進(jìn)行整體成分分析、總黃酮及總皂苷含量測(cè)定，探討多效唑?qū)湺瘜W(xué)成分的影響，以期為麥冬藥材的質(zhì)量控制及多效唑殘留檢測(cè)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC，美國沃特世公司）；三重四極桿質(zhì)譜儀（Qtrap 4500，美國AB SCIEX公司）；分析天平（BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；超聲波清洗器（SB25-12DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司）；中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；離心機(jī)（美國賽默飛世爾科技公司）；超高效液相-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀（Waters Synapt G2 Si，美國沃特世公司）；UV-2600紫外分光光度計(jì)（島津儀器蘇州有限公司）。

1.2 試藥

所有麥冬藥材由上海市藥材有限公司提供，經(jīng)清華大學(xué)中藥研究院特聘研究員陳軍力鑒定為百合科沿階草屬植物麥冬

Ophiopogon japonicus

（

L.f

）Ker-Gawl.的干燥塊根；多效唑?qū)φ掌罚兌取?5%，批號(hào)：Q21M9F61825，上海源葉生物科技有限公司）；魯斯可皂苷元（純度≥98%，批號(hào)：111909-201906，中國食品藥品檢定研究院）；橙皮苷（純度≥98%，批號(hào)：K09S11L123847，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、乙腈、甲酸、異丙醇（均為質(zhì)譜純，美國Thermo Fisher公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC-MS/MS快速測(cè)定麥冬中多效唑的殘留

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取多效唑?qū)φ掌愤m量，置25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1 μg·mL的多效唑?qū)φ掌穬?chǔ)備液，4℃冷藏待用。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取麥冬藥材粉末0.2 g，加1.5 mL異丙醇，超聲提取30 min（功 率50 kHz，100 W），13 000 r·min離 心10 min，取上清液1 mL，濃縮至干，加入100 μL 50%的甲醇復(fù)溶，13 000 r·min離心10 min，取上清液，作為供試品溶液備用。

2.1.3 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C色 譜 柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%的甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～3 min：20%～100%A；3～5 min：100%A；5.1～ 8 min：20%A），流 速0.2 mL·min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。電噴霧正離子電離模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)法測(cè)定，參數(shù)如下：氣簾氣（CUR）30 psi，離子源溫度（TEM）500℃；錐孔電壓（IS）5500 V；輔助氣（GS1、GS2）50 psi。質(zhì)譜采集參數(shù)見表1，色譜圖見圖1。

圖1 多效唑?qū)φ掌罚ˋ）和麥冬樣品（B）的UPLC-MS/MS色譜圖Fig 1 UPLC-MS/MS chromatograms of paclobutrazol（A）and Ophiopogonis Radix（B）

表1 目標(biāo)化合物質(zhì)譜檢測(cè)離子和采集參數(shù)
Tab 1 Spectrum acquisition parameters for target compound

參數(shù) 值Q1 294.3 Q3 70.1 DP/V 120 CE/V 46 CXP/V 11

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取多效唑?qū)φ掌穬?chǔ)備液，用50%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為500、200、50、10、2、0.5、0.2 ng·mL的多效唑?qū)φ掌啡芤?，按?.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以多效唑?qū)φ掌愤M(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到多效唑的回歸方程為

Y

＝87.02

X

＋5.354（

r

＝0.9973）。結(jié)果表明，多效唑在0.002～5 ng與峰面積呈良好的線性關(guān)系。2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取多效唑?qū)φ掌啡芤?0 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄對(duì)照品峰面積。結(jié)果多效唑峰面積的

RSD

值為0.80%，表明儀器精密度良好。2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取11號(hào)麥冬藥材樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示，多效唑峰面積的

RSD

值為1.4%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取11號(hào)麥冬藥材樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液。按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，多效唑峰面積的

RSD

值為1.1%，表明該方法重復(fù)性良好。2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 取11號(hào)麥冬藥材樣品6份，每份約0.1 g，精密稱定，分別加入相當(dāng)于供試品中多效唑含量100%的對(duì)照品。按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率和

RSD

值。結(jié)果多效唑平均回收率為98.0%，

RSD

值為1.8%，表明該方法的加樣回收率良好。

2.1.9 樣品含量測(cè)定 取16批麥冬藥材樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各樣品中多效唑的含量。結(jié)果見表2，在四川栽培的麥冬藥材樣品中全部檢測(cè)到多效唑的殘留，而在湖南和上海的野生麥冬樣品中均未檢測(cè)到多效唑的殘留。

表2 麥冬樣品中多效唑殘留情況
Tab 2 Content of paclobutrazol in Ophiopogonis Radix

樣品編號(hào) 產(chǎn)地 多效唑含量/（mg·kg－1）1234567891 0 11 12 13 14 15 16四川綿陽三臺(tái)縣四川綿陽三臺(tái)縣四川綿陽三臺(tái)縣四川綿陽三臺(tái)縣四川綿陽四川綿陽四川綿陽四川綿陽四川綿陽四川（萬仕城1號(hào)）四川（萬仕城2號(hào)）四川（代代為本特級(jí)）四川（代代為本一級(jí)）四川（代代為本一級(jí)）湖南（野生）上海（野生）0.006 0.012 0.013 0.015 0.015 0.015 0.049 0.016 0.019 0.007 0.027 0.005 0.002 0.014未檢出未檢出

2.2 多效唑?qū)湺w化學(xué)成分的影響研究

2.2.1 供試品溶液的制備 采用UPLC-QTOFMS植物代謝組學(xué)法初步研究多效唑施用與否對(duì)麥冬整體化學(xué)成分的影響，麥冬樣品信息見表3。取麥冬藥材樣品粉末0.2 g于15 mL離心管中，加入5 mL70%甲醇溶液，超聲提取30 min，混勻，取1 mL超聲提取液12 000 r·min離心15 min后，取上清液備用。另等量吸取各供試品溶液100 μL，混勻，制成質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品，用于監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)和方法的穩(wěn)定性。

表3 施用不同濃度多效唑的麥冬樣品信息
Tab 3 Information of Ophiopogonis Radix samples treated with different concentrations of paclobutrazol

樣品編號(hào) 多效唑施用量/（g·m－2）D0 D1 D2 D3 0 1.0 4.0 8.0

2.2.2 檢測(cè)條件 色譜條件：Waters ACQUITY BEH C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%的甲酸水溶液（A）-0.1%的甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，2%～40%B；5～17 min，40%～98%B；17～20 min，98%B；20.1～21 min，2%B），流速為0.3 mL·min，柱溫40℃，進(jìn)樣量2.0μL。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧（electrospray ionization，ESI）源；采用MS負(fù)離子掃描模式，毛細(xì)管電壓2.0 kV，離子源溫度120℃，脫溶劑氣溫度450℃，脫溶劑氣流速800 L·h，錐孔電壓40 V，錐孔氣流速50 L·h，采集模式質(zhì)量范圍

m

/

z

50～1500，掃描時(shí)間0.2 s，高能通道碰撞電壓10～75 V，亮氨酸-腦啡肽

m

/

z

556.2615[M-H]作質(zhì)量實(shí)時(shí)校正。

2.2.3 數(shù)據(jù)采集與分析

① 數(shù)據(jù)采集：分析樣品前測(cè)試空白溶劑樣品，扣除色譜柱和系統(tǒng)中的殘留污染干擾。連續(xù)進(jìn)樣10次QC樣品，待儀器檢測(cè)穩(wěn)定后，進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)。實(shí)際樣品隨機(jī)排列，并按采樣數(shù)量等間隔插入QC樣品。

② 數(shù)據(jù)分析：將LC-MS的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI 軟件（Version 2.0，Waters）進(jìn)行預(yù)處理，得到包含保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的二維數(shù)據(jù)矩陣，保存為.csv格式，MetaboAnalyst 4.0（https：//www.metaboanalyst.ca）網(wǎng)站有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析（partial least square discriminant analysis，PLS-DA），通過多元統(tǒng)計(jì)分析判斷多效唑施用對(duì)麥冬整體化學(xué)成分的影響。多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見圖2，結(jié)果中清水對(duì)照組麥冬與多效唑不同濃度的麥冬分布在不同區(qū)域，可見，施用多效唑?qū)湺w化學(xué)成分存在顯著的影響。

圖2 多效唑?qū)湺w化學(xué)成分影響的多元統(tǒng)計(jì)分析（PLS-DA）Fig 2 Multivariate statistical analysis of the effect of paclobutrazol on the whole chemical constituents of Ophiopogonis Radix（PLS-DA）

2.3 多效唑?qū)湺傇碥蘸涂傸S酮的影響

采用紫外分光光度法對(duì)“2.2.1”項(xiàng)下的麥冬藥材進(jìn)行總皂苷和總黃酮的含量測(cè)定，分析多效唑施用對(duì)麥冬總皂苷和總黃酮的影響?？傇碥諛悠分苽浼皺z測(cè)方法參照2020年版《中國藥典》，總黃酮樣品制備及檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)報(bào)道，采用橙皮苷為對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表5，施用多效唑后麥冬總黃酮含量明顯降低，而麥冬總皂苷含量無變化。

表5 多效唑施用量對(duì)麥冬總皂苷、總黃酮的影響(＝3)
Tab 5 Effect of paclobutrazol on total saponins and flavonoids of Ophiopogonis Radix(＝3)

樣品編號(hào) 總皂苷含量/% 總黃酮含量/%D0 D1 D2 D3 0.40 0.40 0.40 0.40 0.021 0.014 0.014 0.014

3 討論

3.1 測(cè)定方法的考察

本研究前期采用液相方法檢測(cè)麥冬藥材中多效唑殘留情況，發(fā)現(xiàn)色譜峰無法準(zhǔn)確定量，故選擇采用質(zhì)譜儀建立麥冬多效唑殘留的檢測(cè)方法?？疾炝思状?、80%甲醇、異丙醇3種不同提取溶劑對(duì)麥冬中多效唑殘留提取效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異丙醇提取效率最高，故提取溶劑選擇異丙醇。多效唑殘留在果蔬和土壤中的檢測(cè)報(bào)道較多，近幾年，中藥材尤其是川麥冬中多效唑殘留檢測(cè)方法研究增多，大都采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法。由于樣品中多效唑殘留量較低，文獻(xiàn)報(bào)道的麥冬多效唑檢測(cè)方法多采用液液萃取法和QuEChERS法提取，方法復(fù)雜，且耗時(shí)長(zhǎng)。本研究采用異丙醇為溶劑，直接超聲提取，濃縮富集后測(cè)定，方法更加簡(jiǎn)便、快捷。

3.2 麥冬藥材中多效唑殘留分析

多效唑是一種三唑類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，20世紀(jì)80年代研制出后被廣泛用于塊根類植物增產(chǎn)，其機(jī)制是通過抑制植物內(nèi)源性激素赤霉素的合成提高植物組織中吲哚乙酸氧化酶活性，從而減弱植物頂端分裂活性，促進(jìn)植物塊根形成。多效唑具有低毒性，人體每日允許攝入量為0.1 mg·kg，我國規(guī)定部分果蔬中多效唑檢出限量為0.05 mg·kg。中藥材中尚無相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)報(bào)道，多效唑施用后在土壤中殘留情況較為嚴(yán)重，殘留年限可達(dá)2年，對(duì)土壤微生物及后茬作物均有影響。因此，加快建立中藥材多效唑殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)中藥材安全性控制和土壤環(huán)境安全保護(hù)均有一定的價(jià)值。本研究檢測(cè)結(jié)果中四川麥冬栽培品普遍可檢出多效唑殘留，殘留量在0.002～0.05 mg·kg，而湖南和上海的野生麥冬則無多效唑殘留檢出。這說明，川麥冬藥材栽培品施用多效唑情況較為普遍，藥材種植過程中多效唑施用量各不相同。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，川麥冬種植過程存在多效唑?yàn)E用情況，有學(xué)者采用質(zhì)譜法測(cè)定了60批川麥冬中108種植物生長(zhǎng)激素殘留，其中多效唑檢出率高達(dá)100%，檢出質(zhì)量濃度在0.004 18～0.0639 mg·kg，在108種激素中施用情況最為嚴(yán)重。也有學(xué)者采用QuEChERS提取與反相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)定麥冬藥材中多效唑和烯效唑的殘留，在33批藥材樣品中多效唑的檢出率為94%，而烯效唑的檢出率僅為27%，多效唑殘留量在0.02～0.208 mg·kg。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道具有高度一致性。因此，本研究建立的快速測(cè)定麥冬多效唑殘留的方法可為中藥材生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑限量評(píng)估提供研究基礎(chǔ)，為國家監(jiān)管部門形成針對(duì)中藥材生長(zhǎng)激素殘留限量的標(biāo)準(zhǔn)提供一定參考。

3.3 施用多效唑?qū)湺煞值挠绊?/h3>

本試驗(yàn)通過UPLC-QTOF-MS植物代謝組學(xué)技術(shù)和多元統(tǒng)計(jì)分析方法研究多效唑施用對(duì)麥冬整體化學(xué)成分的影響，發(fā)現(xiàn)多效唑施用后對(duì)麥冬的化學(xué)成分存在影響，通過測(cè)定麥冬總皂苷、總黃酮的含量，初步判斷施用多效唑后麥冬總黃酮含量下降。

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