張琳琳，劉阿利，張繼環(huán)，王雪，張貴民（1.魯南貝特制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.國家手性制藥工程技術研究中心，山東 臨沂 276006；3.山東省手性制藥技術創(chuàng)新中心，山東 臨沂 276006）

孟魯司特鈉（montelukast sodium），化學名1-[[[（

R

）-3-[（

E

）-2-（7-氯-2-喹啉基）乙烯基]-

α

-[2-（1-羥基-1-甲基乙基）苯乙基]芐基]硫基]甲基]環(huán)丙乙酸鈉鹽，是一種廣泛應用的選擇性白三烯受體拮抗劑。該藥物具有高效、低毒、安全性好的優(yōu)點，主要應用于成人和兒童哮喘的預防和長期治療，能夠緩解哮喘急性發(fā)作，減少激素用量，提高患者用藥的依從性。孟魯司特鈉還可用于治療兒童急性呼吸道感染后咳嗽，可以有效減輕咳嗽癥狀，降低炎癥反應程度，具有較好的應用價值。近年來，由于口服有效、毒副作用小，孟魯司特鈉在臨床上單獨或與其他藥物聯合應用治療多種呼吸系統疾病。

孟魯司特鈉最早由默克公司于1998年在美國申請上市，商品名SINGULAIR（順爾寧），1999年在中國上市。目前國內有關孟魯司特鈉片降解產物的研究較少，主要對其中4種雜質進行了測定。在孟魯司特鈉一致性評價研究過程中發(fā)現，除文獻中報道的特定雜質峰（雜質B，BP2020）外，其酸降解色譜圖中又出現了2個未知雜質峰，此前并未有相關報道。隨著人們對藥物安全性的日益關注，藥物中的雜質研究已成為藥品質量控制的重要環(huán)節(jié)。因此，為保證用藥安全，本文采用高效液相色譜串聯質譜法（HPLCMS/MS）和高效液相色譜法（HPLC）對酸降解試驗中產生的未知雜質進行初步的結構解析與來源分析，為后續(xù)相關質量控制研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQ-2489高效液相色譜儀（美國Waters），高效液相色譜-質譜聯用儀（高效液相色譜儀：Thermo-vanquish flex；質譜儀：Thermo-Q Exactive），XS105電子天平、S 210K pH計（梅特勒-托利多）。

1.2 試藥

孟魯司特鈉片（批號：200401，自制），甲醇、乙腈 （色譜純，英國萊德化學有限公司或默克公司；默克公司的甲醇和乙腈僅在未知雜質來源分析中使用，其他試驗中均使用英國萊德化學有限公司的甲醇和乙腈），磷酸、醋酸銨、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、冰醋酸（分析純，國藥集團），純化水（自制）。

2 方法

2.1 HPLC條件

色譜柱：采用Waters XBridge phenyl柱（苯基鍵合硅膠為填充劑，4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相A：0.02 mol·L磷酸氫二鉀溶液（用磷酸調節(jié)pH值至5.5），流動相B：甲醇-乙腈（1∶1），梯度洗脫（0～20 min，50%～30%A；20～25 min，30%A；25～30 min，30%～50%A；30～35 min，50%A）；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL·min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 HPLC-MS/MS條件

2.2.1 色譜條件 采用Waters XBridge phenyl柱（苯基鍵合硅膠為填充劑，4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相：0.01 mol·L醋酸銨（用冰醋酸調節(jié)pH值至5.5）-乙腈（45∶55）；檢測波長：254 nm；流速：0.3 mL·min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正負離子模式；霧化電壓：＋3.8 kV；鞘氣流速：30 mL·min；輔助氣流速：8 mL·min；毛細管溫度：320℃；輔助氣溫度：310℃；掃描模式：Full mass-dd MS；掃描范圍（

m/z

）：200～2000。

2.3 溶液配制

2.3.1 供試品溶液 避光操作，取本品粉末適量（約含主成分10 mg），精密稱定，置10 mL量瓶內，加6 mL稀釋劑[甲醇-水（9∶1）]超聲使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，離心后取上清液濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.2 酸降解樣品溶液 避光操作，取本品粉末適量（約含主成分10 mg），精密稱定，置10 mL量瓶內，加6 mL稀釋劑超聲溶解，再加入1 mL 1 mol·L的鹽酸溶液，50℃加熱5 min后，冷卻，加入1 mol·L的氫氧化鈉溶液中和，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，離心后取上清液濾過，取續(xù)濾液作為酸降解樣品溶液。

3 結果與討論

3.1 HPLC分析

取“2.3”項下供試品溶液和酸降解樣品溶液分別注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下條件檢測，色譜圖見圖1。未破壞的孟魯司特鈉樣品色譜圖（見圖1A）中只有一個響應極高的主峰1，其保留時間為15.007 min，為孟魯司特峰；酸降解后的孟魯司特鈉色譜圖（見圖1B）顯示，除了主峰1外，還出現3個比較明顯的色譜峰。其中峰4為已知孟魯司特鈉特定雜質峰（雜質B，BP2020）。在20.570 min、24.508 min處的雜質峰2以及雜質峰3為新出現的未知雜質峰，分別命名為雜質1、雜質2。

圖1 孟魯司特鈉片高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of montelukast sodium tablets

3.2 未知雜質結構解析

3.2.1 未知雜質質譜信息 為分析2個未知雜質可能的結構及其生成路線，取“2.3”項下酸降解樣品溶液，采用“2.2”項下HPLC-MS/MS條件獲得未知雜質母離子（[M＋H]）與二級碎片離子信息，結果見表2及圖2。

表2 孟魯司特鈉片酸降解未知雜質質譜結果
Tab 2 Mass spectra of unknown impurities from acid degradation of montelukast sodium tablets

雜質 保留時間/min 母離子[M＋H]＋/（m/z） 主要碎片離子/（m/z）雜質1 28.45 600.233 89 454.1935、422.1667、380.1204、292.0884、278.0731、131.0856雜質2 42.10 600.235 72 454.1439、422.1668、380.1211、292.0886、278.0732、131.0857

圖2 孟魯司特鈉片酸降解未知雜質質譜圖Fig 2 Mass spectra of unknown impurities in the montelukast sodium tablets under acid degradation

孟魯司特鈉片酸降解后出現的2個未知雜質分子量相同，均為599.2，較孟魯司特（585.2）大14，與亞甲基（-CH-）分子量相當，初步推測兩者可能為孟魯司特在酸性條件下與溶劑甲醇的反應產物，可能的反應機制見圖3；而且2個未知雜質的碎片峰離子豐度相當，分子峰及碎片峰峰形均相似，雜質峰的分子量與分子碎片分子量均高度吻合，初步判斷兩者為同一結構，色譜圖中顯示雙峰可能為結構中的羧酸基團不完全解離所致，即2個未知雜質可能為同一結構的兩種存在型式（酸型和解離型），兩種型式之間存在解離平衡，見圖4。

圖3 未知雜質可能的反應機制Fig 3 Possible reaction mechanism of unknown impurity

圖4 未知雜質之間可能存在的解離平衡Fig 4 Possible dissociation equilibrium between the unknown impurities

3.2.2 未知雜質質譜解析 假設未知雜質為孟魯司特與甲醇在酸性條件下反應脫水生成，可能的結構如圖3所示，對其進行質譜解析。因其在結構上與孟魯司特相近，結合孟魯司特的裂解規(guī)律，推斷其可能的裂解途徑如圖5所示。由圖中A線斷裂后，失去A線右側CHO基團后生成碎片

m/z

422.1，元素組成為CHClNOS，該碎片脫去CHOS基團后繼續(xù)丟失兩個氫生成碎片

m/z

278.1。由圖中B線斷裂后，失去CHOS基團后生成碎片

m/z

454.2，進而失去一分子甲醇得到碎片

m/z

422.2，元素組成為CHClN，一方面可能按照途徑a進行碎裂，失去CH基團后生成碎片

m/z

292.1，元素組成為CHClN；另外可能按照途徑b生成碎片

m/z

157.1，進一步丟失CH，生成碎片

m/z

131.1。從圖中可以看出，未知雜質可能的裂解碎片分子量與質譜圖中二級碎片分子量相當，具有較高的吻合度，因此推斷2個未知雜質確為孟魯司特與甲醇在酸性條件下的反應產物。

圖5 未知雜質可能的裂解途徑Fig 5 Possible fragmentation pathway of unknown impurities

3.2.3 未知雜質存在型式確認 由于2個未知雜質的分子量和質譜碎片高度吻合，推測兩者可能為同一結構的兩種存在形式，若推測成立，則在不同pH值的酸性條件下，兩種形式存在解離平衡，通過調節(jié)流動相的pH值，2個未知雜質的比例可能會發(fā)生變化。因此通過試驗進一步驗證上述解析的合理性。

用磷酸調節(jié)流動相A的pH值分別為3.0、4.5、4.8、5.0、5.5、5.7、6.0、6.5、6.8，其余色譜條件均同“2.1”項下HPLC條件，取“2.3.1”項下酸降解樣品溶液，依次進樣，記錄色譜圖。通過調節(jié)流動相pH值，液相色譜圖雜質1和雜質2峰的峰面積比例發(fā)生顯著變化，見表3。

表3 不同pH值流動相條件未知雜質峰面積
Tab 3 Peak area of unknown impurity under different pH conditions of the mobile phase

流動相pH值峰面積雜質1 雜質2 雜質1∶雜質2 雜質1＋雜質2 3.0 2 211 181 0 100∶0 2 211 181 4.5 1 205 732 1 120 855 52∶48 2 336 587 4.8 1 217 034 1 169 259 51∶49 2 376 293 5.0 1 200 161 1 197 320 50∶50 2 397 481 5.5 1 195 602 1 217 187 50∶50 2 412 789 5.7 1 190 161 1 260 161 49∶51 2 450 322 6.0 1 160 855 1 295 732 47∶53 2 456 587 6.5 0 2 556 307 0∶100 2 556 307 6.8 0 2 568 923 0∶100 2 568 923

當流動相A的pH值在3.0時，色譜圖中兩個未知雜質中只有雜質1峰，說明2個未知雜質在低pH環(huán)境中只有未解離型式穩(wěn)定存在；當流動相A的pH值在3.5～6.0時，色譜圖中始終存在雜質1和雜質2，并隨著pH值的升高，雜質2峰的峰面積相對增大，而雜質1峰的峰面積相對減小；當流動相A的pH值≥6.5時，色譜圖中未知雜質峰完全轉變成雜質2峰，說明未知雜質的羧酸根已完全解離，此時主要以解離型存在。在不同的pH值環(huán)境中，兩個雜質比例不同，出峰時間也略有差異，因此，判斷雜質1與雜質2之間存在解離平衡，在一定pH條件下可以相互轉化，即雜質1與雜質2為同一分子結構的兩種存在型式，雜質1以酸的型式存在，雜質2以解離的型式存在。

3.3 未知雜質來源分析

為進一步驗證酸降解試驗中產生的未知雜質為孟魯司特在酸性條件下與溶劑甲醇反應所得，分別使用來自不同廠家的甲醇和乙腈配制甲醇-水（9∶1）、乙腈-水（9∶1）作為溶劑，按“2.3”項下制得酸降解樣品溶液，同“2.1”項下HPLC條件進行檢測，見圖6。圖6A1與圖6A2中均存在4個明顯的色譜峰，分別為主峰、雜質B峰和19.3 min、25.6 min的2個未知雜質峰，使用不同廠家的甲醇的酸降解色譜圖無明顯差異；而圖6B1與圖6B2中僅存在主峰和雜質B峰，在19.3 min和25.6 min的兩個未知雜質峰均未出現，而且使用不同廠家的乙腈的酸降解色譜圖也無明顯差異。因此進一步確認未知雜質為孟魯司特鈉在酸性條件下與溶劑甲醇的反應產物。

圖6 孟魯司特鈉片酸降解高效液相色譜圖Fig 6 HPLC chromatogram of montelukast sodium tablets under the acid degradation

4 結論

本文采用HPLC-MS/MS法對孟魯司特鈉片酸降解試驗中出現的未知雜質進行定性分析，推測其結構以及可能的反應機制；通過調節(jié)流動相的pH值進行液相分析，確定2個未知雜質為同一結構的兩種存在型式（酸型和解離型）；進一步來源分析表明未知雜質為孟魯司特鈉在酸性條件下與溶劑甲醇的反應產物，并非孟魯司特鈉片自身的酸降解產物。本品在加速和長期試驗考察過程中均未檢出此未知雜質，說明此雜質不影響產品質量，且在制劑生產、儲存、運輸過程中不會接觸到強酸和高溫環(huán)境，因此在后續(xù)的質量控制研究中無需關注。

值得注意的是，現行USP43和BP2020收載的孟魯司特鈉片質量標準中有關物質檢查項下，使用的溶劑為甲醇-水（3∶1），流動相為乙腈-甲醇（2∶3），都涉及甲醇。建議在試驗中應注意避免高溫及強酸環(huán)境，供試品溶液臨用配制，以免引入其他雜質。