任美，周瑞*，唐志書，蘇潔，劉妍如，胡錦航，宋忠興，石麗，王文宏（.陜西中醫(yī)藥大學陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育）/陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西咸陽 7083；.西安碑林藥業(yè)股份有限公司，西安 7000）

咽炎是一種主要由感染引起的常見自限性疾病[1]，包含急性咽炎與慢性咽炎等。急性咽炎為咽部黏膜及黏膜下組織的急性炎癥，常累及咽部的淋巴組織，隨病情進展?？缮婕罢麄€咽腔，其病因多與細菌感染、病毒感染破壞巨噬細胞等免疫細胞功能有關[2]。慢性咽炎為咽部黏膜、黏膜下及淋巴組織的彌漫性炎癥，常由急性咽炎遷延日久而來[3]。臨床上治療咽炎首選抗菌藥物和激素藥物，但此類藥物的耐藥性及不良反應危害患者健康。中成藥治療咽炎以其作用溫和持久、不良反應少等特點日益受到廣大患者關注。

中醫(yī)學認為，急性咽炎為“急喉痹”，臨床常見風熱外襲型急喉痹，癥狀多為咽喉腫痛、吞咽不利等[4]。慢性咽炎被稱為“慢喉痹”，歸屬于“喉痹”的虛癥[5]，該病以清熱解毒，疏風利咽為治則。金嗓開音膠囊由金銀花、連翹、玄參、板藍根、赤芍、黃芩、桑葉、菊花、前胡、苦杏仁、牛蒡子、澤瀉、胖大海、僵蠶、蟬蛻、木蝴蝶16味中藥組成，全方奏以清肺解毒、滋陰泄火、利喉開音為功效，通過清除肺熱、瀉火解毒可達治本之功，通過利喉開音可達治標之用[6]，臨床上觀察發(fā)現(xiàn)此藥能明顯改善咽炎患者機體的炎癥反應[7]，減輕咽炎疾病癥狀，效果良好。

金嗓開音膠囊藥味組成較多，其治療咽炎的核心作用成分和作用機制研究復雜。網(wǎng)絡藥理技術和分子對接方法對于研究中藥多成分、多靶點整體治療疾病的機制提供了很好的技術[8]。因此，本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法，從“藥物-成分-靶點-通路”復雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)探究金嗓開音膠囊治療咽炎的關鍵作用靶點、藥物成分、信號通路等，為金嗓開音膠囊治療咽炎提供理論參考。

1 材料

1.1 數(shù)據(jù)庫

TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、Drugbank（https：//www.drugbank.ca/）、化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫（http：//www.organchem.csdb.cn.）、SwissTarget Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、Uniprot（https：//www.uniprot.org）、OMIM（https：//omim.org/）、Genecards（https：//www.genecards.org/）、STRING（http：//cn.string-db.org）。

1.2 試藥

金嗓開音膠囊藥粉（西安碑林藥業(yè)股份有限公司，批號：JD12108004）；RPMI 1640（批號：2048221）、胎牛血清（批號：1803122）、PBS（批號：UB150259）（Biological Industries公 司）；二甲亞砜（DMSO，批號：HG/T5345-2018，天津市科密歐化學試劑有限公司）；無水對氨基苯磺酸（SUL，批號：DC5BA0731）、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽（NED，批號：DC07BA1002）[生工生物工程（上海）股份有限公司]；亞硝酸鈉（NaNO2，天津市科密歐化學試劑有限公司）。小鼠 TNF-αELISA試 劑 盒（批 號：EMC102a）、小 鼠 IL-6 ELISA試劑盒（批號：EMC004）（欣博盛生物科技有限公司）；BCA蛋白定量盒（批號：W9219，天根生化科技有限公司）。COX-2抗體（批號：M03101750）、IL-6抗 體（批 號：M09022841）（沈陽萬類生物科技有限公司），β-actin（批號：I0004I56）、TNF-α（批號：00101479）、兔二抗（批號：20000258）、鼠二抗（批號：20000144）（武漢三鷹技術有限公司）。

1.3 細胞

小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7（中國科學院上海生命科學院生物化學與細胞生物學研究所）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡藥理學與分子對接

2.1.1 金嗓開音膠囊成分及作用靶點收集 在TCMSP[9]以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件篩選金嗓開音膠囊所含藥物的有效成分，再利用Drugbank數(shù)據(jù)庫、化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫和文獻[10-11]進一步完善藥物活性成分和靶點收集，并在TCMSP、Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫中獲取有效成分靶點，篩選后在Uniprot數(shù)據(jù)庫進行靶點矯正。

2.1.2 疾病相關靶點篩選 將急性咽炎（acute pharyngitis）、亞急性咽炎（subacute pharyngitis）和慢性咽炎（chronic pharyngitis）輸入OMIM數(shù)據(jù)庫和Genecards數(shù)據(jù)庫檢索，以“relevance score≥ 10”為篩選條件得到疾病靶點，合并后獲得咽炎疾病相關靶點。

2.1.3 交集靶點Venny分析 將藥物靶點與疾病靶點輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1.0，獲取交集靶點。

2.1.4 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建 將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫限定物種為 “Homo sapiens”，獲取蛋白互作信息，導入Cytoscape中，通過Network Analyzer工具進行拓撲分析，以大于degree均值為條件篩選核心靶點。

2.1.5 GO與KEGG通路富集分析 將核心靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化得到GO與KEGG通路，并運用微生信進行可視化分析。

2.1.6 “藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡的構(gòu)建 將金嗓開音膠囊中藥物-成分-靶點網(wǎng)絡與KEGG富集的代謝通路的結(jié)果相整合，在Cytoscape 3.9.1中構(gòu)建“藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖。

2.1.7 分子對接 通過UniProt數(shù)據(jù)庫檢索核心靶點的三維結(jié)構(gòu)，通過PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶點蛋白的分子結(jié)構(gòu)，在UCSF Chimera 1.15rc軟件中保存為mol2格式。在UCSF Chimera 1.15rc軟件中打開大分子靶點蛋白與小分子配體的mol2格式，通過應用軟件中的AutoDock Vina板塊進行分子對接獲得結(jié)合能，并對結(jié)合模式進行可視化。

2.2 體外實驗

2.2.1 細胞培養(yǎng)與藥物配制 RAW264.7細胞復蘇后置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞增殖到約80%時傳代。金嗓開音膠囊藥粉溶于PBS中配成質(zhì)量濃度為10 mg·mL－1的溶液，過0.22 μm微孔濾膜后備用。

2.2.2 細胞毒性 于對數(shù)期收集生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞，以1×105個細胞/孔鋪于96孔板中，培養(yǎng)4 h后，進行對照組（培養(yǎng)基培養(yǎng)）和給藥組（金嗓開音膠囊20、50、100、200、400、500μg·mL－1）分組，培養(yǎng)24 h。棄去上清液，加入0.5 μg·mL－1MTT，孵育4 h；棄去上清液，加入DMSO溶解后，用酶標儀于492 nm檢測吸光度（A）并計算細胞存活率。

2.2.3 細胞分組 基于“2.2.2”處理后，將RAW264.7細胞分為對照組：培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組：LPS（1 μg·mL－1）；給藥組：LPS（1 μg·mL－1）＋金嗓開音膠囊50 μg·mL－1；LPS（1 μg·mL－1）＋金嗓開音膠囊100 μg·mL－1；LPS（1 μg·mL－1）＋金嗓開音膠囊200 μg·mL－1。

2.2.4 細胞活力 于對數(shù)期收集生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞，在96孔板中鋪板密度為 1×105個細胞/孔，培養(yǎng)4 h后，按“2.2.3”項下分組處理，培養(yǎng)24 h。棄去上清液，加入0.5 μg·mL－1MTT，孵育4 h；棄去上清液，加入DMSO溶解后，用酶標儀于492 nm檢測A值并計算細胞存活率。

2.2.5 試劑盒檢測細胞IL-6、TNF-α、NO水平于對數(shù)期收集生長狀態(tài)良好的 RAW264.7細胞，在96孔板中鋪板密度為 1×105個細胞/孔，培養(yǎng)4 h后，以“2.2.3”項下分組處理，24 h后收集細胞上清液。根據(jù) IL-6、TNF-αELISA試劑盒和Griess試劑盒說明書操作，分別檢測各組細胞上清中IL-6、TNF-α和NO的水平。

2.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗 于對數(shù)期收集生長狀態(tài)良好的 RAW264.7細胞，在6孔板中鋪板密度為4×106個細胞/孔。分組設置與處理同“2.2.3”項下，培養(yǎng)24 h后低溫下提取細胞總蛋白。蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠上進行電泳，后將蛋白從凝膠電轉(zhuǎn)到PVDF膜，封閉后置于一抗中在4℃冰箱孵育過夜，TBST洗膜30 min后，將二抗于室溫搖床上孵育1 h，用TBST洗膜30 min后，于凝膠成像儀（BIO-RAD化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)）成像曝光，定量分析。

2.2.7 統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡藥理學預測研究

3.1.1 金嗓開音膠囊成分獲取與篩選 金嗓開音膠囊藥物活性成分中，板藍根有效成分共有39個，蟬蛻有18個，赤芍29個，黃芩36個，僵蠶14個，金銀花23個，菊花20個，苦杏仁19個，連翹23個，木蝴蝶18個，牛蒡子8個，胖大海5個，前胡24個，桑葉29個，玄參6個，澤瀉9個。活性成分部分結(jié)果見表1。

表1 金嗓開音膠囊藥物活性成分Tab 1 Active components in Jinsang Kaiyin capsule

3.1.2 金嗓開音膠囊成分潛在靶點與咽炎潛在靶點預測 經(jīng)Uniprot矯正靶點，篩選得到金嗓開音膠囊有效成分靶點共1101個，咽炎去重篩選后共1459個疾病靶點。

3.1.3 金嗓開音膠囊與咽炎核心靶點分析及 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建 將金嗓開音膠囊成分靶點與咽炎疾病靶點輸入Venny 2.1.0中，得到交集靶點167個。將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡后，利用Cytoscape 3.9.1軟件進行拓撲分析，選取此條件下degree＞2median（82）并采用拓撲特征值中心介度值（Betweenness Centrality）、緊密度（Closeness Centrality）篩選得到25個關鍵靶點基因作為核心靶點，可以看出IL-6、AKT1、TNF、TP53等可能為治療咽炎的核心靶點，見圖1（25節(jié)點 300條邊）。

圖1 PPI網(wǎng)絡Fig 1 Protein-protein interaction network

3.1.4 GO與KEGG通路富集分析 在GO富集分析結(jié)果中，總共富集到888條生物過程（BP），67項分子功能（MF），23項細胞組分（CC）。以基因數(shù)排名前10進行條形圖繪制，見圖2。提示金嗓開音膠囊中的活性成分發(fā)揮治療咽炎作用可能與調(diào)節(jié)體內(nèi)細胞過程、相關蛋白的結(jié)合及調(diào)控相關信號受體有關。

圖2 GO功能富集分析Fig 2 GO function enrichment analysis

炎癥反應的特征是協(xié)調(diào)激活各種信號通路，調(diào)節(jié)促炎介質(zhì)和抗炎介質(zhì)的表達。KEGG分析后得到 156條相關的信號通路，關系最緊密的前20條信號通路由氣泡圖呈現(xiàn)，見圖3。結(jié)果顯示MAPK信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路等可能與金嗓開音膠囊治療咽炎的作用機制相關。

圖3 KEGG通路富集分析Fig 3 KEGG pathway enrichment analysis

3.1.5 藥物-成分-靶點-通路相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建與關鍵成分篩選 以金嗓開音膠囊藥物、成分、作用靶點與相關通路為基礎，導入Cytoscape 3.9.1中，繪制和構(gòu)建藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖，其中黃色為中藥，藍色為中藥活性成分，紅色為中藥作用于疾病的靶點，綠色為可能與咽炎治療相關的通路，圖案大小與degree值成正相關，見圖4，degree值排名前10成分，見表2。

圖4 “藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡Fig 4 “Drug-ingredient-target-pathway” network

表2 Degree值排名前10成分Tab 2 Top 10 components of degree values

3.1.6 分子對接 根據(jù)“3.1.5”項下結(jié)果選取核心靶點蛋白PTGS2、JUN、TNF、AKT1、MMP9、MAPK8、IL-6的蛋白受體與度值排名前十的活性成分槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山柰酚等小分子配體進行分子對接驗證。分子對接結(jié)果如表3。藥物分子與靶點結(jié)合所需能量越少，對接分數(shù)越小，預測其在體內(nèi)結(jié)合的可能性及穩(wěn)定性更大[12]。由表3可知，核心成分與靶點均有較好的對接效果，部分結(jié)合模式可視化見圖5。

圖5 部分金嗓開音膠囊有效成分與核心受體對接Fig 5 Docking of effective components in Jinsang Kaiyin capsules with core receptors

表3 核心成分與各靶點的分子對接分數(shù)Tab 3 Molecular docking scores

3.2 體外實驗

3.2.1 細胞毒性檢測結(jié)果 MTT檢測結(jié)果表明，金嗓開音膠囊在實驗濃度范圍內(nèi)并未對細胞有損傷，見圖6。最終選擇金嗓開音膠囊50、100、200 μg·mL－1進行后續(xù)實驗。

圖6 金嗓開音膠囊對RAW264.7細胞活力影響（ ±s，n＝6）Fig 6 Effect of Jinsang Kaiyin capsules on the viability of RAW264.7 cells（ ±s，n＝6）

3.2.2 細胞活力檢測結(jié)果 模型組細胞活性較對照組下降，而LPS＋金嗓開音膠囊組200μg·mL－1較模型組細胞活性升高，說明金嗓開音膠囊對LPS損傷的細胞有一定的保護作用（見圖7）。

圖7 金嗓開音膠囊對LPS誘導RAW264.7細胞活力的影響（ ±s，n＝6）Fig 7 Effect of Jinsang Kaiyin capsules on the viability of RAW264.7 cells induced by LPS（ ±s，n＝6）

3.2.3 金嗓開音膠囊對RAW264.7細胞NO、IL-6、TNF-α的影響 基于活力檢測結(jié)果，深入探討金嗓開音膠囊對炎性因子表達影響，發(fā)揮抗炎作用機制。由表4可知，與對照組比較，模型組NO、IL-6、TNF-α水平顯著升高，可初步表明RAW264.7細胞炎癥模型制備成功。給藥后觀察到NO水平降低明顯，且呈劑量相關性；IL-6、TNF-α與模型組相比，表達量減少。由此可初步推測金嗓開音膠囊通過抑制炎性因子分泌改善細胞活力，提高機體免疫力，發(fā)揮抗咽炎作用。

表4 金嗓開音膠囊對RAW264.7細胞NO、IL-6、TNF-α的影響( ±s，n＝3)Tab 4 Effect of Jinsang Kaiyin capsule on NO，IL-6，TNF-α in RAW264.7 cells ( ±s，n＝3)

表4 金嗓開音膠囊對RAW264.7細胞NO、IL-6、TNF-α的影響( ±s，n＝3)Tab 4 Effect of Jinsang Kaiyin capsule on NO，IL-6，TNF-α in RAW264.7 cells ( ±s，n＝3)

注：與對照組比較，##P＜0.01，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note：Compared with the control group，##P＜0.01，###P＜0.001；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

組別 NO/（pg·mL－1） IL-6/（pg·mL－1） TNF-α/（pg·mL－1）對照組 0.5967±0.179 12.89±3.66 188.38±8.76模型組 13.378±0.31### 1266.58±108.98### 4037.2±65.91##LPS＋金嗓開音膠囊50 μg·mL－1 5.206±0.17###*** 1106.16±39.16###** 3487.53±30.7##**LPS＋金嗓開音膠囊100 μg·mL－1 2.7039±0.12###*** 1079.04±41.51###* 3243.5±144.5##*LPS＋金嗓開音膠囊200 μg·mL－1 1.7967±0.23###*** 1072.83±38.16###* 3155.52±38.2##**

3.2.4 金嗓開音膠囊對LPS誘導RAW264.7細胞蛋白表達影響 根據(jù)分子對接結(jié)果，進一步驗證金嗓開音膠囊對RAW264.7細胞作用的具體分子機制，Western blot法觀察金嗓開音膠囊下調(diào)RAW264.7細 胞 中PTGS2（COX-2）、IL-6及TNF-α蛋白表達，結(jié)果見圖8。結(jié)合上述細胞相關實驗結(jié)果，有力證實了金嗓開音膠囊具有抗炎作用，并且可能是通過降低PTGS2、IL-6及TNF-α蛋白表達發(fā)揮抗咽炎作用。

圖8 RAW264.7細胞PTGS2（COX-2）、TNF-α、IL-6蛋白表達水平圖（ ±s，n＝3）Fig 8 Expression levels of PTGS2（COX-2），TNF-α，and IL-6 protein in RAW264.7 cells（ ±s，n＝3）

4 討論

咽炎是各種微生物感染咽部而產(chǎn)生炎癥的統(tǒng)稱。中醫(yī)認為咽炎癥候以肺腎陰虛、陽虛、氣滯血瘀痰凝等為主[3]，治療應從養(yǎng)陰清肺、行氣健脾、疏肝理氣、燥濕化痰功效的中藥入手[13]。金嗓開音膠囊具有清肺、滋陰等功效，可作為控制咽腔局部癥狀且改善機體整體狀況的潛在治療藥物。

網(wǎng)絡藥理學結(jié)果顯示，金嗓開音膠囊治療咽炎的關鍵化合物包括槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇等251個成分，PPI網(wǎng)絡分析得到PTGS2、TNF、IL-6等25個關鍵咽炎治療靶點。從GO與KEGG分析結(jié)果看，金嗓開音膠囊通過干預機體刺激免疫應答、蛋白結(jié)合等功能，調(diào)控癌癥通路、病毒感染、MAPK通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路等免疫、炎癥反應相關通路，發(fā)揮治療咽炎的作用。癌癥通路、病毒感染等在網(wǎng)絡中連接的靶點較多，提示抑制這些通路對咽炎向咽癌或者病毒感染方向發(fā)展有一定的阻滯作用。咽炎發(fā)生與機體內(nèi)IL-6、TNF等炎癥因子釋放的增加關系密切，其中IL-6聯(lián)合轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β使Th17分化從而分泌IL-17，上調(diào)Th17/Treg平衡使其病態(tài)導致炎癥的發(fā)生[14]。PTGS2（COX-2）通過協(xié)調(diào)慢性炎癥導致部分促腫瘤信號通路的激活，如TNF/TNF-r、EGF/EGF-r或S100/RAGE，也可通過激活PI3K信號通路刺激基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達，誘導腫瘤侵襲，使炎癥反應加重[15]。金嗓開音膠囊中槲皮素可抑制炎癥產(chǎn)生酶（COX和LOX）的產(chǎn)生，阻斷IL-6的分泌[16]，減輕炎癥癥狀。金合歡素可顯著降低炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α、IL-6、iNOS mRNA水平表達以及PTGS2蛋白表達[17]。β-胡蘿卜素、木犀草素通過調(diào)控MAPK/AP-1和JAK-STAT等信號通路抑制IL-6、IL-17、TNF-α等產(chǎn)生，并增加IL-10的水平[18-19]，發(fā)揮抗炎作用。而β-谷甾醇可明顯抑制由炎癥誘發(fā)巨噬細胞分泌的MMP9蛋白表達[20]，調(diào)節(jié)炎癥反應，提高機體免疫力。山柰酚對炎癥介質(zhì)PTGS1/2酶有很強的抑制作用，還可抑制ERK、p38和JNK通路的激活，減輕其不良影響[21]。金嗓開音膠囊治療咽炎主要通過抑制炎癥因子的表達及相關通路的調(diào)控來發(fā)揮藥理作用，而這些炎癥因子及通路在治療咽炎的關鍵靶點及主要通路中均有體現(xiàn)。

分子對接結(jié)果顯示槲皮素、木犀草素等作用成分與靶點PTGS2、JUN、TNF、AKT1、MMP9、MAPK8、IL-6等有著良好的結(jié)合活性，反映了金嗓開音膠囊治療咽炎的主要機制可能與以上作用成分和靶點關系密切。木犀草素、黃芩素、金合歡素均與PTGS2強烈結(jié)合，即與PTGS2靶點形成穩(wěn)定的復合物，Western blot實驗結(jié)果顯示金嗓開音膠囊可下調(diào)PTGS2蛋白表達，推測上述成分很有可能是金嗓開音膠囊作用于此靶點的藥效物質(zhì)。JUN（c-jun）為AP1蛋白產(chǎn)物，AP1被激活后的表達與免疫炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系[22]，β-谷甾醇等穩(wěn)定結(jié)合JUN后可能參與調(diào)控咽炎的發(fā)生發(fā)展。TNF、IL-6與槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素、豆甾醇等結(jié)合牢固，說明金嗓開音膠囊關鍵成分可能通過影響TNF、IL-6的促炎因子表達，發(fā)揮治療咽炎作用，在細胞實驗中證實了金嗓開音膠囊可抑制TNF、IL-6表達。AKT1是AKT的主要亞型之一，是調(diào)節(jié)細胞存活信號通路的中心節(jié)點，PI3K為AKT上游蛋白，兩者組成PI3KAkt信號通路，其持續(xù)激活會導致細胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化[23]，槲皮素、木犀草素等作用成分與AKT1結(jié)合后可能參與此信號通路調(diào)節(jié)，影響咽炎疾病相關免疫細胞生長。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法，對金嗓開音膠囊多成分、多靶點、多途徑、多效應的抗咽炎機制進行了分析，并在體外進行實驗驗證，結(jié)果表明金嗓開音膠囊可能通過抑制PTGS2、IL6、TNF-α、NO等炎性介質(zhì)表達調(diào)控免疫細胞發(fā)揮抗咽炎作用。本研究初步為金嗓開音膠囊在咽炎的治療中提供了理論支持。后續(xù)將進行動物咽炎模型實驗相關機制探究。