單賀珍，董石，李曉瑞，董宇曦，劉秀盈，何宇，王建勛，2*（.北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 02488；2.深圳北京中醫(yī)藥大學研究院，廣東 深圳 5872；.中國農(nóng)業(yè)大學生物學院，北京 009）

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細胞免疫療法是抗腫瘤領域的一種新型細胞療法。近年來，多款抗CD19 CAR-T細胞產(chǎn)品陸續(xù)獲批上市，它對B細胞惡性淋巴瘤的療效顯著，特別是彌漫性大B細胞淋巴瘤，完全有效率可達54%。然而，抗CD19 CAR-T細胞療法的不良反應不可忽視，比如神經(jīng)毒性和細胞因子綜合征（cytokine release syndrome，CRS），嚴重者甚至會危及患者的生命。

中藥金銀花（Lonicera japonica，LJ）具有清熱解毒、抗炎消腫的功效，臨床上廣泛用于發(fā)熱、扁桃體炎、肺炎、鼻炎及皮疹等。有體外實驗表明，金銀花提取物可以阻礙脂多糖誘導神經(jīng)小膠質細胞與免疫巨噬細胞分泌炎癥因子，抑制補體活性。這提示金銀花可能有助于緩解抗CD19 CAR-T細胞導致的CRS。

因此，本實驗將金銀花水煎劑與抗CD19 CAR-T細胞聯(lián)合處理表達CD19的Burkitt’s淋巴瘤細胞（Raji細胞），以探究金銀花對抗CD19 CAR-T細胞腫瘤殺傷能力，細胞因子釋放以及程序性死亡蛋白（programmed death-1，PD-1）表達的影響，以期為惡性B細胞淋巴瘤患者提供新的治療方案。

1 材料

1.1 儀器

流式細胞分析儀（LSRFortessa SORP，BD）；酶標儀（Epoch 2TC，BioTek）；細胞自動計數(shù)儀（Invitrogen Countess II FL，ThermoFisher）。

1.2 試藥

RPMI 1640培養(yǎng)基、AIMV培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（Gibco公司）；CD3-APC抗體、PD-1-PE抗體、c-Myc-PE抗體、Human CD8/NK Panel檢測試劑盒、CFSE熒光染料（Bio-Legend公司）；細胞凋亡檢測試劑盒（北京金普來生物科技有限公司）；Bright-LumiⅡ螢火蟲熒光素酶報告基因檢測試劑盒（碧云天生物技術公司）；金銀花中藥飲片[中國北京同仁堂（集團）有限公司]。

1.3 細胞系

Burkitt’s淋巴瘤細胞（Raji細胞，美國 ATCC細胞庫）；Raji-熒光素酶標記細胞（Raji-Luc，北京維通達公司）；外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC，為健康志愿者提供）。本研究獲得北京中醫(yī)藥大學醫(yī)學與實驗動物倫理委員會審理與批準，審批號為2022 BZYLL0102。

2 方法

2.1 金銀花提取物的制備[7]

稱取金銀花30 g，以8倍量去離子水浸泡30 min，加熱煮沸2 h，以三層紗布過濾。最后水浴濃縮至300 mL，即獲得質量濃度為100 mg·mL的金銀花水煎劑，0.22 μm濾膜過濾。

2.2 抗CD19 CAR-T細胞的構建與轉導率測定[8]

采用Ficoll 密度梯度離心法分離人外周血中的PBMC，以含有10%FBS的AIMV 培養(yǎng)基培養(yǎng)。T細胞激活則通過CD3 單克隆抗體與白介素-2（IL-2）刺激處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，轉導抗CD19 CAR反轉錄病毒（實驗室前期制備并保存）得到抗CD19 CAR-T細胞。48 h后通過c-Myc-PE染色與流式細胞術檢測c-Myc 陽性細胞，即獲得CD19 CAR的轉導效率。

2.3 熒光素酶檢測法測定靶細胞活率

將抗CD19 CAR-T細胞或T細胞依照1∶8效靶比與4×10個Raji-Luc細胞置于96孔培養(yǎng)皿100 μL體系中，給藥組分別給予5、10、20 mg·mL金銀花水煎劑干預。37℃共同培養(yǎng)12 h后，每孔加入100 μL熒光素酶底物，孵育3 min后使用酶標儀的化學發(fā)光模式檢測。根據(jù)下列公式計算不同組別的細胞殺傷效率：細胞殺傷效率（%）＝（靶細胞組檢測值－實驗組檢測值）/靶細胞組檢測值×100%。

2.4 Annexin V染色法檢測靶細胞凋亡

將抗CD19 CAR-T細胞依照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16效靶比與2.4×10個Raji細胞共同培養(yǎng)12 h后，以CD3-APC抗體標記T細胞，Annexin-FITC標記早期凋亡細胞后，通過流式細胞術測定Raji細胞的凋亡比例。根據(jù)下列公式計算不同組別的細胞殺傷效率：細胞殺傷效率（%）＝（實驗組FITC陽性率－靶細胞組FITC陽性率）/（1－靶細胞組FITC陽性率）×100%。

2.5 CFSE染色法測定效應細胞增殖

將抗CD19 CAR-T細胞與3 μmol·L羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）孵育染色30 min，流式細胞術檢測0 h的FITC通道熒光強度；之后抗CD19 CAR-T細胞按照1∶8效靶比與2.4×10個Raji細胞共同培養(yǎng)12 h，以CD3-APC抗體標記T細胞，檢測12 h的FITC通道熒光強度。

2.6 CBA多因子流式細胞術檢測細胞因子釋放水平

將抗CD19 CAR-T按照1∶8效靶比與2.4×10個Raji細胞共同培養(yǎng)12 h后，收取培養(yǎng)基上清液，按照Human CD8/NK Panel檢測試劑盒說明書操作并檢測。

2.7 流式細胞術檢測PD-1的表達水平

將抗CD19 CAR-T按照1∶8效靶比與2.4×10個Raji細胞共同培養(yǎng)12 h后，以CD3-APC抗體標記T細胞，PD-1-PE抗體標記PD-1蛋白，抗體孵育1 h后采用流式細胞術檢測。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Graphpad Prism 9軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組之間采用

t

檢驗，

P

＜0.05則表明差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 抗CD19 CAR-T細胞的成功制備

抗CD19 CAR-T細胞的構建是通過基因重組技術將載有CD19 CAR的反轉錄病毒轉導至T細胞，使其可以識別腫瘤細胞表面的CD19從而特異性殺傷腫瘤，其中CD19 CAR的分子結構主要包括CD19的單鏈可變片段（scFv）、CD8鉸鏈區(qū)、CD28共刺激域以及CD3

ζ

結構域（見圖1A）。轉染48 h后采用c-Myc抗體標記CD19 CAR分子以評估病毒的轉導效率，結果發(fā)現(xiàn)T細胞中CD19 CAR分子的表達率為65.7%（見圖1B）。

圖1 靶向CD19的嵌合抗原受體（CAR）的分子結構（A）及其表達率（B）Fig 1 Structure（A）and transduction efficiency（B）of anti-CD19 chimeric antigen receptor（CAR）

3.2 金銀花提取物提高抗CD19 CAR-T細胞腫瘤殺傷活性

為了探究金銀花提取物是否會影響抗CD19 CAR-T細胞的體外細胞毒性，將效應細胞與Raji-Luc共培養(yǎng)，給藥組給予金銀花提取物干預12 h，通過熒光素酶檢測法測定Raji-Luc的存活率。濃度摸索實驗發(fā)現(xiàn)，10 mg·mL的金銀花提取物可以促進抗CD19 CAR-T細胞殺傷腫瘤，優(yōu)于5 mg·mL和20 mg·mL兩個質量濃度組（見圖2A）。于是將10 mg·mL作為后續(xù)實驗中金銀花提取物的最佳干預濃度。此外，還發(fā)現(xiàn)金銀花與抗CD19 CAR-T細胞聯(lián)合殺傷Raji-Luc的效果顯著優(yōu)于兩者的單獨應用，即兩者具有疊加效應，也強于未轉導T細胞與金銀花聯(lián)用組以及未轉導T細胞組（見圖2B）。

圖2 熒光素酶檢測法測定抗CD19 CAR-T對Raji-Luc的殺傷效率（n＝3）Fig 2 Killing efficienc of anti-CD19 CAR-T cells against Raji-Luc measured by luciferase assay（n＝3）

進一步通過流式細胞術的方法檢測了不同效靶比條件下，10 mg·mL的金銀花提取物是否均會影響抗CD19 CAR-T細胞對Raji細胞的促凋亡作用，結果顯示，1∶2、1∶4、1∶8與1∶16效靶比水平下，金銀花與抗CD19 CAR-T細胞聯(lián)合應用組的腫瘤殺傷活性均顯著高于抗CD19 CAR-T細胞組（見圖3）。

圖3 細胞凋亡檢測法測定抗CD19 CAR-T對Raji細胞的殺傷效率（n＝3）Fig 3 Killing efficiency of anti-CD19 CAR-T cells against Raji cells measured by cell apoptosis assay（n＝3）

3.3 金銀花提取物促進抗CD19 CAR-T細胞的增殖

CAR-T細胞增殖能力同體內抗腫瘤的持久性密切相關，于是通過CFSE染色法測定了經(jīng)10 mg·mL金銀花提取物處理的抗CD19 CAR-T細胞，結果顯示，與靶細胞共培養(yǎng)12 h后，同抗CD19 CAR-T細胞組相比，金銀花聯(lián)合應用組的CFSE熒光峰圖向左偏移（見圖4），即金銀花提取物提高了抗CD19 CAR-T細胞的增殖能力。

圖4 CFSE染色測定抗CD19 CAR-T細胞的增殖能力Fig 4 Proliferation ability of anti-CD19 CAR-T cell measured by CFSE staining

3.4 金銀花提取物雙向調控細胞因子的分泌

細胞因子的釋放水平是指征CAR-T細胞功能的標志之一，于是對抗CD19 CAR-T細胞與Raji細胞共培養(yǎng)體系中白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子

α

（TNF-

α

）、干擾素

γ

（IFN

-γ

）以及顆粒酶B（Granzyme B）的水平進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)10 mg·mL金銀花提取物處理后，Granzyme B顯著上調，IL-2與TNF-

α

有表達升高的趨勢；同時IFN

-γ

與IL-10顯著下調，IL-6表達有降低的趨勢（見圖5）。

圖5 金銀花提取物特異性調控細胞因子的分泌水平（n＝3）Fig 5 Expression level of cytokines regulated by Lonicera japonica extract（n＝3）

3.5 金銀花提取物下調PD-1蛋白的表達

為了進一步闡明金銀花提取物增強抗CD19 CAR-T細胞腫瘤殺傷能力的可能原因，對抗CD19 CAR-T細胞活性相關的免疫檢查點PD-1蛋白進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，同對照組相比，經(jīng)10 mg·mL金銀花處理的抗CD19 CAR-T細胞的PD-1陽性率發(fā)生降低（見圖6）。

圖6 流式細胞術檢測PD-1蛋白表達的陽性率Fig 6 Expression of PD-1 detected by flow cytometry

4 討論

CD19是B細胞的生物標志物，屬于免疫球蛋白超家族，并在多數(shù)慢性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病以及B細胞淋巴瘤病例中高水平，且為血液腫瘤治療的潛在靶點。針對CD19靶標設計的抗CD19 CAR-T細胞可以特異性識別高表達CD19的B細胞淋巴瘤并激活自身T細胞的功能，進而精準清除癌變細胞。Raji細胞是取自Burkitt’s淋巴瘤患者的癌變B細胞，可作為評估靶向CD19 CAR-T細胞效力的靶細胞?；诔晒χ苽涞目笴D19 CAR-T細胞與Raji細胞共培養(yǎng)體系，實驗發(fā)現(xiàn)10 mg·mL金銀花提取物有助于提高抗CD19 CAR-T細胞的細胞毒性，改善抗CD19 CAR-T細胞的增殖，提示金銀花提取物與抗CD19 CAR-T細胞的聯(lián)合療法具有良好的抗腫瘤療效，有可能進一步提高B細胞淋巴瘤的臨床治愈率。

此外，在體內殺傷靶細胞過程中，抗CD19 CAR-T細胞與自免疫T細胞的激活會導致血清中免疫刺激細胞因子的增加，如Granzyme B、IL-6、IL-10、TNF-

α

、IFN-

γ

、IFN-

β

等，介導對腫瘤的殺傷作用。而這些細胞因子過度的級聯(lián)釋放會導致受試者發(fā)生細胞因子風暴，是CAR-T細胞療法的不良反應之一。研究表明金銀花提取物對細胞因子的調控是雙向的，它促進Granzyme B的分泌，而抑制IFN

-γ

與IL-10的釋放，對IL-2、TNF-

α

與IL-6的表達無顯著影響。Granzyme B是絲氨酸蛋白酶家族成員之一，常在效應T細胞中表達并介導對靶細胞的促凋亡作用，而金銀花提取物的處理促進了抗CD19 CAR-T細胞釋放Granzyme B，進一步揭示了金銀花與抗CD19 CAR-T細胞的聯(lián)合應用具有最佳腫瘤殺傷能力的原因；有研究表明干擾素IFN

-γ

水平的高低對CAR-T細胞的療效無顯著影響，并且抑制 IFN

-γ

不僅可以減輕細胞因子相關的毒性，還能夠通過減少免疫檢查點蛋白的表達來增強T細胞增殖，金銀花提取物的干預明顯抑制了抗CD19 CAR-T細胞分泌IFN

-γ

，說明金銀花可能會在不影響殺傷效果的同時減輕抗CD19 CAR-T細胞療法引發(fā)的CRS癥狀，也解釋了經(jīng)金銀花處理的抗CD19 CAR-T細胞自我更新能力得到提高的原因。

PD-1是重要的免疫檢查點之一，當抗CD19 CAR-T細胞暴露于腫瘤細胞環(huán)境時，會誘導自身PD-1蛋白的表達上調，PD-1信號通路的激活則會降低抗CD19 CAR-T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性以及細胞增殖能力，導致腫瘤免疫逃逸的發(fā)生。而10 mg·mL金銀花提取物處理可以下調由Raji細胞刺激誘發(fā)的抗CD19 CAR-T細胞中PD-1的表達，這說明金銀花提取物有可能通過下調PD-1蛋白的表達從而增強抗CD19 CAR-T細胞腫瘤殺傷活性以及細胞增殖能力。

綜上，本項研究證實了金銀花提取物可以提高抗CD19 CAR-T細胞體外殺傷腫瘤的效力，且特異性調控細胞因子的釋放水平并下調免疫檢查點PD-1的表達。這一發(fā)現(xiàn)將有助于改善抗CD19 CAR-T細胞療法的效果與降低不良反應的發(fā)生率，也拓展了中藥金銀花的臨床應用范圍。然而，金銀花調控抗CD19 CAR-T細胞功能的有效成分與內在分子機制尚不清晰，有待中藥物質基礎學研究與生物信息學分析加以闡釋，為金銀花與抗CD19 CAR-T細胞聯(lián)合療法的臨床轉化提供更夯實的證據(jù)。