畢玥琳,張?jiān)娛|,馮欣,杜小偉,甕學(xué)智,孫毅坤*(.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 0400;.北京市藥品檢驗(yàn)研究院,北京 006;3.北京市豐臺(tái)區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心,北京 0007)
蒿屬(Artemisia
)為菊科(Compositae)春黃菊族(Anthemideae)蒿亞族(Artemisiinae)植物,是該族中第一大屬。我國(guó)蒿屬植物分布廣泛,在溫帶、熱帶、山區(qū)、草原、荒漠等地區(qū)均有分布,種類眾多,且大部分均為草本植物,常具有特殊香氣。該屬中的許多植物具有抗炎、止血、利尿、解毒等功效,在醫(yī)藥業(yè)具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。茵陳(Artemisiae scopariae herba)、艾葉(Artemisiae argyifolium)、藏龍蒿(Artemisia waltonii)同為蒿屬植物,形態(tài)相似,不易從外表進(jìn)行鑒別,且3種藥材經(jīng)炮制過(guò)后更加難以區(qū)分,經(jīng)常在中藥材市場(chǎng)及臨床應(yīng)用中發(fā)生混淆。茵陳是一種代表性的蒿屬植物藥,來(lái)源于茵陳蒿(
Artemisia capillaris
Thunb.
)或?yàn)I蒿(Artemisia scoparia
Waldst.
et Kit.
)的干燥地上部分,主要分布于陜西、山西、河北等地,其味微苦微辛,能泄能降,在治療肝膽濕熱、清利脾胃、通利小便方面療效顯著,也常用于治療熱結(jié)黃疸等癥。艾葉來(lái)源于植物艾(Artemisiae argyi
Levl.
etVant
.
)的干燥葉,在我國(guó)東北、華北、華東、西南等地有廣泛分布,為溫性藥,可以暖氣血、溫經(jīng)脈、散寒濕,臨床上多以復(fù)方配伍使用,善于安胎,治療痛經(jīng)等婦科疾病,同時(shí),艾葉也是灸法的主要藥用材料之一。藏龍蒿是菊科蒿屬的植物,與牛尾蒿和野艾蒿同為野艾蒿的原植物,是中國(guó)的一種特有植物,分布于青海、四川、云南、西藏,其地上部分可以用來(lái)治療皮膚病、疫疽、炭疽、蟲病等疾病。近年來(lái)的研究表明,3種藥材的功效有一定程度的相似,但其成分是否存在差異,差異是否影響到藥理作用,尚未見有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術(shù)具有高靈敏度、高分離能力的特點(diǎn),常被用于中藥材及中藥復(fù)方復(fù)雜化學(xué)成分的鑒定。
目前,蒿屬植物之間的差異鑒別研究主要集中于外觀鑒別,本研究采用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術(shù),依據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn),結(jié)合化合物準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子及保留時(shí)間分別鑒別3種蒿屬植物中所含有的化合物,為3種蒿屬植物之間的鑒別提供了新的思路與方法。
Thermo Scientific Q Exactive質(zhì)譜儀、Xcalibur工作站、Vanquish Duo UHPLC System for Dual LC Workflows液相系統(tǒng)、Pico 17 高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司);CPA225D 電子天平(德國(guó)SARTORIUS公司);KQ5200DA 超聲波清洗機(jī)(中國(guó)昆山舒美公司)。
質(zhì)譜級(jí)乙腈(中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)、質(zhì)譜級(jí)甲酸(美國(guó)ROE公司);水為屈臣氏飲用水;茵陳(批號(hào):67248413259)、艾葉(批號(hào):10036376822278)(北京同仁堂)及藏龍蒿(河北安國(guó)藥材市場(chǎng))均由北京市藥品檢驗(yàn)研究院常增榮主任藥師鑒定。
將3種植物樣品剪碎(直徑0.1~0.2 cm),臨用前分別稱取0.2 g,加75%的甲醇10 mL浸沒(méi),超聲30 min,將提取液于4828 g離心10 min后取出上清液,將上清液稀釋5倍后,再次于4828 g離心10 min后取出上清液,即得。
2.2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×150 mm,Milford,MA,USA),柱溫40℃,進(jìn)樣量5 μL,流速0.3 mL·min。流動(dòng)相為 0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B),洗脫程序:0~2 min,5%B;2~17 min,5%~98%B;17~20 min,98%B。
2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化源(ESI);正負(fù)離子交替掃描;掃描模式為:全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描(Full scan/ddMS),掃描范圍為m/z
100~1300 Da,毛細(xì)管溫度為350℃。正模式下的噴霧電壓為3800 V,負(fù)模式下的噴霧電壓為3200 V,鞘氣為35 arb,輔助氣15 arb,MS采用低、中、高的3種碰撞能量對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)碎裂??紤]到不同結(jié)構(gòu)化合物在正負(fù)離子模式下需要的能量不一樣,同時(shí)為了增加碎片離子的多樣性,正離子模式碰撞能為20 V、40 V、60 V,負(fù)離子模式碰撞能為30 V、50 V、70 V。一級(jí)質(zhì)譜分辨率:70 000 FWHM(Full Width at Half Maximum),二級(jí)質(zhì)譜分辨率:17 500 FWHM。3種蒿屬植物樣品按照“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS分析,在正離子模式下和負(fù)離子模式下對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),得到3種植物在正、負(fù)離子模式下的BPI圖,分別見圖1、2。將檢測(cè)所得的準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子、保留時(shí)間等信息與相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和鑒定,得出茵陳、艾葉、藏龍蒿的化學(xué)成分,并對(duì)這三者的化學(xué)成分進(jìn)行比較,若是化合物響應(yīng)值低于1×10,則認(rèn)定化合物未檢出,鑒定結(jié)果見表1、2,圖3為3種蒿屬植物中化合物成分差異的韋恩圖。結(jié)果共鑒定出45種化合物,包括有機(jī)酸類17個(gè),黃酮類17個(gè),香豆素類4個(gè),氨基酸類2個(gè),萜類2個(gè)等。
圖1 茵陳(A)、艾葉(B)、藏龍蒿(C)正離子模式下離子流圖及其對(duì)比圖(D)Fig 1 Total ion current chromatograms of Artemisiae scopariae herba(A),Artemisiae argyi folium(B)and Artemisia waltonii(C)in positive ion mode and their comparison(D)
圖2 茵陳(A)、艾葉(B)、藏龍蒿(C)負(fù)離子模式下離子流圖及其對(duì)比圖(D)Fig 2 Total ion current chromatograms of Artemisiae scopariae herba(A),Artemisiae argyi folium(B)and Artemisia waltonii(C)in negative ion mode and their comparison(D)
圖3 茵陳、艾葉、藏龍蒿差異化合物韋恩圖Fig 3 Venn diagram of differential compounds in Artemisiae scopariae herba,Artemisiae argyi folium and Artemisia waltonii
表1 3種植物中化學(xué)成分的UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS正離子鑒定結(jié)果
Tab 1 Identified chemical constituents of Artemisiae scopariae herba,Artemisiae argyifoliumand Artemisia waltonii by UHPLC-QExactive-Orbitrap-MS in positive ion mode
No.理論值(m/z) 碎片離子(m/z) 分子式 化合物名 tR(error)/min(×10-6)茵陳 艾葉 藏龍蒿1 116.0706102.1556,87.1049,70.0659 C5H9NO2 脯氨酸[13] 1.18(-2.58)1.18(-2.58)1.26(-2.58)2 165.0546123.0443,119.0494,95.0496 C9H8O3 對(duì)香豆酸[15] 1.64(-1.21) - -3 166.0862120.0810,103.0546,149.0599 C9H11NO2苯丙氨酸[17] 2.82(-0.60)2.84(0.60) 2.80(-1.20)4 207.0652190.0767,163.0390,135.0442 C11H10O4 濱蒿內(nèi)酯[14] 4.95(0.00) 4.96(2.41) -5 355.1024163.0390,145.0286,135.0442 C16H18O9 1-咖啡??鼘幩醄13] 5.56(0.28) 5.61(0.00) 5.60(0.28)6 355.1021163.0390,135.0442,117.0337 C16H18O9 綠原酸[14] 5.59(0.00) 5.61(0.00) 5.60(-0.56)7 179.0339151.0391,135.0441,123.0442 C9H6O4 7,8-二羥基香豆素[13] - 6.38(0.51) -8 177.0546163.0392,145.0284,135.0443 C10H8O3 7-甲氧基香豆素[18] 6.55(-1.96)6.54(0.00) -9 369.1180177.0546,161.1324,145.0286 C17H20O9 阿魏??鼘幩醄15] - 6.55(-1.08) -10 465.1028303.0498,285.0389 C21H20O12 金絲桃苷[14] 6.75(-1.08)6.85(-1.51)6.63(-1.51)11 433.1129415.1017,397.0920,379.0811,337.0704,323.0912,313.0706,295.0603,283.0601 C21H20O10 牡荊素[14] 6.79(1.15) - -12 611.1606345.0605,303.0497,153.0181 C27H30O16 quercetin-3-O-robinoside[17] - - 6.83(-1.31)13 595.1657287.0549,153.0184,85.0296 C27H30O15 山柰酚-3-O-蕓香糖苷[20] 6.95(-1.51)6.95(-0.67)6.97(-1.51)14 465.1028303.0498,285.0410,229.0497 C21H20O12 異槲皮苷[15] 7.01(-1.08)7.06(-1.51)7.05(-1.51)15 625.1763479.2037,317.0654,302.0420 C28H32O16 水仙苷[13] 7.29(-0.96)7.32(-0.32)7.32(-0.48)16 517.1341355.1515,163.0389,135.0441 C25H24O12 二咖啡酰奎尼酸或其同分異構(gòu)體[20] - 7.48(-0.19)7.43(0.19)17 479.1184317.0653,302.0419,153.0181 C22H22O12 異鼠李素-3-O-葡萄糖苷[15] 7.50(-1.46)7.59(-2.09)7.64(-0.42)18 355.1016377.0844,163.0391,135.0442 C16H18O9 隱綠原酸[16] 7.71(0.00) 7.74(0.00) 7.75(-2.54)19 179.0339135.0438,119.0493,105.0702 C9H6O4 6,7-二羥基香豆素[13] - 7.76(0.00) -20 146.0600118.0654,117.0571,91.0547 C9H7NO 4-甲酰基吲哚[14] 7.94(-1.37)7.95(-0.68)7.95(-0.68)21 317.0652302.0420,285.0391,168.0054 C16H12O7 茵陳色原酮[13] 7.98(-0.95)8.03(-0.95)7.98(-1.63)22 593.1865477.0523,447.1283,285.0755 C28H32O14 genkwanin-4’-O-glucosy-Rhamnoside[19]8.67(-0.51)8.67(-1.52)8.7(-2.87)23 285.0758270.0523,242.0547,229.1225,153.0109 C16H12O5 芫花素[21] - 11.54(0.35) 11.53(0.70)
續(xù)表1
No.理論值(m/z) 碎片離子(m/z) 分子式 化合物名 tR(error)/min(×10-6)茵陳 艾葉 藏龍蒿24 149.1325131.0856,121.1014,107.0860 C11H16 Carvacrol或其同分異構(gòu)體[14] 12.91(0.00) 12.91(0.00) 12.91(-0.67)25 279.231995.0860,119.0860,105.0703 C18H30O2 亞麻酸或其同分異構(gòu)體[13] 14.63(2.15) 14.65(0.00) 14.68(2.15)26 135.1168107.0859,105.0703,91.0548 C10H14 p-Cymene[19] - - 20.06(-0.74)
表2 3種植物中化學(xué)成分的UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS負(fù)離子鑒定結(jié)果
Tab 2 Identified chemical constituents of Artemisiae scopariae herba,Artemisiae argyifoliumand Artemisia waltonii by UHPLC-QExactive-Orbitrap-MS in negative ion mode
No.理論值(m/z) 碎片離子(m/z) 分子式 化合物名 tR(error)/min(×10-6)茵陳 艾葉 藏龍蒿1 191.0561191.0558,93.0335,87.0077 C7H12O6 奎寧酸[18] 1.23(2.09) 1.23(2.09) 1.22(1.57)2 353.0878191.0558,179.0347,173.0454,135.0442,85.0284 C16H18O9新綠原酸[14] 3.35(-4.25)3.36(-3.97) -3 593.1512593.1528,473.1101,383.0783,353.0677,325.0727,297.0774 C27H30O15apigenin-6,8-Di-C-hexoside[19] 6.03(-2.70)5.98(-4.72)6.07(0.84)4 353.0878191.0558,179.0351,173.0088,161.0244,135.0444 C16H18O9綠原酸[14] 6.13(-4.25)6.14(-3.97)6.11(0.28)5 367.1034193.0504,191.0558,173.0452 C17H20O95-freuoylquinicacid[13] 6.54(-2.72)6.55(-1.91)6.54(-2.18)6 153.0193109.0286,91.0179,65.0385 C7H6O4 原兒茶酸[18] 6.83(3.92) - -7 431.0984341.0676,311.0569,283.0618,269.0466,161.0240 C21H20O10牡荊素[14] 6.97(-2.09) - -8 463.0882301.0355,300.0283,271.0257 C21H20O12quercetin-3-O-glucoside[21] 6.98(-2.38)6.90(-2.59)7.07(-3.89)9 461.0725341.0669,298.0495,285.0410 C21H18O12luteolin-7-glycuronicacid[15] - 7.15(-2.60) -10 593.1501593.1525,285.0410,284.0333 C20H34O20kaempferol-3-O-rhamnosyhexose[21]7.24(-3.71) - 7.24(-4.05)11 515.1195353.0892,191.0558,179.0346,161.0238,135.0444 C25H24O12異綠原酸b[17] 7.38(-1.36)7.33(-0.97)7.43(-1.55)12 353.0878191.0558,179.0345,173.0452,161.0237,135.0443 C16H18O9隱綠原酸[17] 7.47(-4.25)7.47(-1.98)7.49(-0.85)13 515.1196353.0884,191.0558,179.0346,173.0451,135.0444 C25H24O12異綠原酸a[21] 7.64(-1.36)7.67(-0.39)7.70(-1.55)14 529.1563179.0347,161.0293,135.0443 C23H30O143-caffeoyl-5-feruoylquicinicacid[16] - - 7.79(-1.32)15 187.0976143.1071,125.0963,97.0648,83.0491 C9H16O4 壬二酸[19] 8.04(1.60) - 8.04(2.14)16 515.1197353.0884,191.0557,179.0345,173.0450,161.0238,135.0443 C25H24O12異綠原酸c[13] 8.19(-1.36)8.20(-1.16)8.20(-1.55)17 677.1512515.1190,353.0886,191.0557,135.0443 C34H30O153,4,5-三咖啡酸奎寧酸[13] 8.64(-1.51) - 8.65(-2.66)18 287.0561151.0038,135.0443,107.0128 C15H12O6eriodictyolchalcone[19] - 8.88(-1.39) -19 345.0616330.0388,315.0147,287.0196,271.0243,165.9898 C17H14O85,7,3’,5’-tetrahydroxy-6,4’-dimethoxyflavone[14]-8.96(-1.74) -20 345.0616330.0387,315.0152,287.0201,259.0252,136.9871 C17H14O85,7,4’,5’-tetrahydroxy-6,3’-dimethoxyflavone[16]-9.28(-3.19)9.30(-1.74)21 329.0667314.0436,299.0201,271.0252 C17H14O7棕矢車菊素[21] - 9.90(-1.52)9.91(0.00)22 343.0823328.0595,313.0362,298.0125 C18H16O7異澤蘭黃素[13] 10.99(0.87) 11.00(-1.46)10.98(-1.75)
m/z
353.0878 [M-H],二級(jí)碎片離子信息為m/z
191.0558、179.0345、173.0452、161.0237、135.0443,其裂解途徑為酯鍵斷裂得到奎尼酸碎片離子峰m/z
191.0558 [M-CHO-H]以及咖啡酸碎片離子峰m/z
179.0345 [M-CHO-H],奎尼酸繼續(xù)脫去一分子HO生成m/z
173.0452[M-CHO-HO-H],而咖啡酸繼續(xù)脫去CO得到碎片離子m/z
135.0443 [M-CHO-CO-H],其可能的裂解途徑見圖4。圖4 隱綠原酸的裂解途徑Fig 4 Fragmentation pathways of cryptochlorogenic acid
茵陳、藏龍蒿共有的化合物壬二酸是一種有機(jī)酸化合物,分子式為CHO,其在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z
187.0976 [M-H]峰強(qiáng)高達(dá)1.24×10,二級(jí)質(zhì)譜圖中所顯示的碎片分別為m/z
143.1071、125.0963、97.0684、83.0491,推測(cè)其裂解途徑為化合物先脫去一分子CO,生成m/z
143.1071 [M-CO-H],再脫去一分子HO生成m/z
125.0963 [M-HO-CO-H],進(jìn)而脫去甲基生成m/z
97.0684 [M-CH-HO-CO-H]以及m/z
83.0491 [M-CH-HO-CO-H]。其可能的裂解途徑見圖5。圖5 壬二酸的裂解途徑Fig 5 Fragmentation pathways of azelaic acid
m/z
465.1028,其二級(jí)碎片離子信息為m/z
303.0498、285.0389。推測(cè)其裂解途徑為準(zhǔn)分子離子m/z
465.1034 [M+H]失去一個(gè)半乳糖,得到碎片離子m/z
303.0498 [M-CHO+H],再失去一個(gè)羥基得到碎片離子m/z
285.0389[M-CHO-OH+H],其可能的裂解途徑見圖6。圖6 金絲桃苷的裂解途徑Fig 6 Fragmentation pathways of hyperoside
從3種植物中均鑒定出異澤蘭黃素,該化合物二級(jí)質(zhì)譜主要丟失-CH,-OCH等基團(tuán)。負(fù)離子模式中的化合物22準(zhǔn)分子離子峰為m/z
343.0823,其脫去一分子的-CH生成碎片離子m/z
328.0595 [M-CH-H],再脫去一分子-OCH則生成碎片離子m/z
298.0125 [M-CH-OCH-H]。同時(shí),該化合物還可以直接脫去一分子-OCH生成 [M-OCH-H],其裂解途徑見圖7。圖7 異澤蘭黃素的裂解途徑Fig 7 Fragmentation pathways of isozelanthin
茵陳特有的牡荊素,其在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z
433.1129,該化合物有3種裂解方向,其一為A環(huán)上所連接的葡萄糖苷發(fā)生裂解,生成碎片m/z
313.0706 [M-CHO+H],再脫去一分子羰基生成黃酮芐基離子m/z
283.0601[M-CHO-CHO+H],黃 酮B環(huán) 發(fā) 生RDA裂解,裂解為m/z
119.0494,165.0184兩個(gè)碎片離子。其二為化合物連續(xù)脫掉三分子水,分別生成碎 片m/z
415.1017,397.0920以 及379.0811。其三為化合物B環(huán)所連接的糖被破壞生成碎片m/z
337.0704 [M-CHO+H],進(jìn)而失去一個(gè)亞甲基生成碎片m/z
323.0912[M-CHO-CH+H]。其裂解途徑見圖8。圖8 牡荊素的裂解途徑Fig 8 Fragmentation pathways of vitexin
O
-robinoside、p-
cymene、3-caffeoyl-5-feruoylquicinic acid)。3種蒿屬植物雖為同屬,但其基原不同,成分也不相同。茵陳特有成分對(duì)香豆酸可以增加細(xì)菌膜外的滲透性,有利于藥物通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入內(nèi)部,以增強(qiáng)藥物抗菌作用。近期,有學(xué)者證實(shí)茵陳與艾葉共有成分6,7-二甲氧基香豆素對(duì)苯丙氨酸代謝路徑中的苯丙氨酸羥化酶、氨基酸氧化酶及酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性具有調(diào)節(jié)作用,從而干預(yù)酒精誘導(dǎo)的原代肝細(xì)胞損傷,可能是兩種蒿屬植物發(fā)揮保肝利膽功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。茵陳色原酮為3種蒿屬植物所共有成分,有研究發(fā)現(xiàn),茵陳色原酮可以通過(guò)提高體內(nèi)肝細(xì)胞乙醛脫氫酶(ALDH)水平,提升肝臟將乙醛降解為乙酸的能力,對(duì)急性肝損傷具有良好的保護(hù)作用。同時(shí),茵陳色原酮可以通過(guò)抑制MyD88和TIRAP介導(dǎo)的Akt、脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的核因子κ
B(NF-κ
B)和促分裂原活化的蛋白激酶(MAP)激活的炎癥基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗炎作用。本試驗(yàn)采用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術(shù)建立了一種快速區(qū)別茵陳、艾葉與藏龍蒿的方法,與傳統(tǒng)的色譜方法相比,本方法雖然受提取方法及質(zhì)譜檢測(cè)限的限制而無(wú)法鑒別出更多的化合物,但其用時(shí)更短,對(duì)碎片離子具有更高的準(zhǔn)確性,更強(qiáng)的靈敏度,常用于中藥或復(fù)雜物質(zhì)中化合物的鑒定、篩選及定量分析,該法可為3種蒿屬植物的鑒別研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考,同時(shí)也為更多蒿屬植物的開發(fā)以及藥源植物的拓展提供了思路。