王艷艷，趙文軒，賈皓月，寧婧歧，楊星鋼*（.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院連云港中醫(yī)藥分院，江蘇 連云港 006；.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 006）

美洛昔康（meloxicam，MLX）是非甾體抗炎藥（NSAIDs）之一，常用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病，是環(huán)氧合酶-2（COX-2）的選擇性抑制劑，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱的作用。由于MLX屬于BCS Ⅱ類藥物，水溶性差，溶出速率限制了吸收而導(dǎo)致生物利用度過低。

自納米乳給藥系統(tǒng)（self-nano emulsifying drug delivery systems，SNEDDS）是由油相、表面活性劑和助表面活性劑組成的各向同性且熱力學(xué)穩(wěn)定的混合體系，在胃腸道的蠕動下自發(fā)形成粒徑小于100 nm的

O/W

型微乳。SNEDDS可以有效改善難溶性藥生物利用度差的問題，但是口服SNEDDS存在藥物沉淀和吸收減少的風(fēng)險(xiǎn)。過飽和自納米乳（supersaturated self-nanoemulsifying drug delivery system，S-SNEDDS）通過使用沉淀抑制劑可避免藥物沉淀，促進(jìn)其吸收。磷脂復(fù)合物（phospholipid complex，PC）可提高藥物的親脂性，提高了藥物在SNEDDS的油相中的溶解度，從而增加其載藥量，同時(shí)SNEDDS在介質(zhì)的自發(fā)乳化分散性能也能解決PC因黏稠的質(zhì)地而不易均勻分散的問題。

目前利用沉淀抑制劑使自納米乳形成過飽和或者將PC與自納米乳體系相結(jié)合的研究均有不少報(bào)道，但將三者相結(jié)合的研究鮮有報(bào)道，因此本文考慮將三者相結(jié)合制備成美洛昔康磷脂復(fù)合物過飽和自納米乳（MLX-PC-S-SNEDDS），以期提高M(jìn)LX的載藥量、溶解度和生物利用度。

1 材料

1.1 試藥

美洛昔康（MLX，純度：98%，天津希恩思奧普德科技有限公司）；油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944 CS）、二乙二醇單乙基醚（Transcutol HP）[嘉法獅（上海）貿(mào)易有限公司]；聚氧乙烯氫化蓖麻油（Cremophor RH40）、聚乙烯吡絡(luò)烷酮-K30（PVP K30）、聚丙烯酸樹脂L100（Eudragit L100）、共聚維酮S-630（PS-630）[巴斯夫（中國）有限公司]；大豆卵磷脂（Lecithin High Potency）（山東優(yōu)索化工科技有限公司）；聚乙烯已內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus）、聚氧乙烯35蓖麻油（Kolliphor ELP）、聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL）、脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO-9）（德國BASF公司）；棕櫚酸異丙酯（IPP）（臨沂綠森化工有限公司）；油酸（Oleic acid，天津市恒興化學(xué)試劑有限公司）；辛酸/癸酸甘油三酯（GTCC，KLK吉隆坡甲洞集團(tuán)公司）；吐溫80（Tween 80，天津市恒興化學(xué)試劑有限公司）；肉豆蔻異丙酯（IPM，廣州享安精細(xì)化工有限公司）；羥丙甲纖維素E15LV（HPMC E15LV）、羥丙甲纖維素 K4M（HPMC K4M）（上海卡樂康輔料有限公司）；聚乙二醇400（PEG400，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；

β

-環(huán)糊精（

β

-CD，淄博千匯生物科技有限公司）；異丙醇（分析純）、甲醇（色譜級）（山東禹王化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器

ZRS-7G型藥物溶出度儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海青浦瀘西儀器廠）；XS105型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；UV-8000 紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；TS-100恒溫?fù)u床（捷呈實(shí)驗(yàn)儀器）；TG16MW臺式高速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；SMD200-2 電子分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；PB-10 pH計(jì)（美國Sartorius公司）；Nano ZS90粒度測定儀（英國馬爾文公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JEM-2100透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

2 方法

2.1 MLX在不同輔料中的飽和溶解度測定

稱取過量的MLX置于EP管中，分別加入2 mL各輔料，渦旋混勻，（37±0.5）℃、100 r·min恒溫振蕩72 h。達(dá)到平衡后，12 000 r·min離心10 min取上清液，用甲醇稀釋到合適倍數(shù)，過濾，用UV法在361 nm處測定MLX在不同輔料中的吸光度，計(jì)算其溶解度，平行操作3次。其中，由于Cremophor RH40在室溫下為固體，需要先將其在40℃下水浴加熱熔化后再進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 三元相圖繪制

將表面活性劑和助表面活性劑按照一定的質(zhì)量比（

K

）分別為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3進(jìn)行混合，再與油相按照比例分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1進(jìn)行混勻，固定體系質(zhì)量為1 g，緩慢滴入37℃水浴磁力攪拌下100 mL蒸餾水中，觀察其乳化狀態(tài)。以油相、表面活性劑、助表面活性劑分別為三元相圖的三個(gè)頂點(diǎn)，用Origin 8.0軟件繪制三元相圖。以能夠形成的微乳區(qū)域面積大小為指標(biāo)，利用Image J軟件對三元相圖內(nèi)乳化面積大小進(jìn)行相對計(jì)算，進(jìn)而確定適合的三相以及各組分比例。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)聯(lián)合歸一化法綜合評定進(jìn)行多指標(biāo)處方優(yōu)化

以Labrafil M 1944 CS 用量百分比（

X

）與表面活性劑與助表面活性劑的比例

K

（

X

）作為考察因素。效應(yīng)指標(biāo)分別為粒徑（

Y

）、粒徑分散系數(shù)（PDI，

Y

）與載藥量（

Y

）。采用Design Expert 10.0.7軟件進(jìn)行二因素、五水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)。用歸一化法對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，利用熵值法方法計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)和權(quán)重系數(shù)，并以綜合評分

Y

表達(dá)最終效應(yīng)，并建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化與預(yù)測分析，對MLX-SNEDDS處方進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 沉淀抑制劑篩選

2.4.1 沉淀抑制劑種類的篩選精密稱MLXSNEDDS處方中各組分，分別加入2%的各類沉淀抑制劑，超聲攪拌使其混合均勻，形成MLXS-SNEDDS。將油狀濃縮物分別加入裝有100 mL 0.1 mol·LHCl溶液的錐形瓶中，（37±0.5）℃、100 r·min恒溫振蕩，并于5、15、30、45、60、90、120、180、240 min分別取樣1 mL，不補(bǔ)液，用甲醇稀釋并過濾，在361 nm處測定吸光度，計(jì)算其藥物濃度，比較加入不同的沉淀抑制劑后提高和維持藥物濃度的能力，篩選出合適的沉淀抑制劑。

2.4.2 沉淀抑制劑用量的確定 基于“2.4.1”項(xiàng)下試驗(yàn)結(jié)果，固定其他條件不變，分別加入0.5%、1%、2%、3%的Soluplus，篩選出Soluplus的用量。

2.5 MLX-S-SNEDDS的制備及載藥量的測定

按優(yōu)化后的處方比例稱取油相、表面活性劑和助表面活性劑，磁力攪拌使其混勻置于西林瓶中，得到澄明均一的空白SNEDDS。按比例精密稱取Soluplus加入到空白SNEDDS中，超聲攪拌至均勻分散，使其溶解，得到澄清透明的S-SNEDDS。將過量MLX加入S-SNEDDS，渦旋充分混勻，得MLX-S-SNEDDS。于（37±0.5）℃、100 r·min恒溫振蕩72 h后，12 000 r·min離心10 min，取上清液，用甲醇稀釋至合適倍數(shù)，過濾，361 nm處測定吸光度，計(jì)算MLX-SSNEDDS的載藥量。

2.6 MLX-PC和MLX-PC-S-SNEDDS的制備工藝研究

經(jīng)測定，“2.5”項(xiàng)下MLX-S-SNEDDS的載藥量較低，因此考慮將其制成MLX-PC，以期提高載藥量。磷脂是體內(nèi)生物膜的主要成分，將其與藥物復(fù)合形成藥物-PC，可改善藥物的溶解性和穩(wěn)定性，提高生物利用度。采用溶劑蒸發(fā)法制備MLX-PC，精密稱取MLX與適量的大豆卵磷脂于四氫呋喃中，水浴磁力攪拌一定時(shí)間，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法儀回收溶劑，真空干燥即得MLX-PC。以載藥量為評價(jià)指標(biāo)，對可能影響結(jié)果的藥脂比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、藥物質(zhì)量濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行單因素考察，確定MLX-PC制備工藝。

MLX-PC-S-SNEDDS的制備及載藥量的測定同“2.6”項(xiàng)下方法，將制得的過量MLX-PC加入至空白S-SNEDDS中，計(jì)算MLX-PC-S-SNEDDS的載藥量。

MLX-PC油/水分配系數(shù)的測定采用經(jīng)典搖瓶法，取適量MLX-PC，加入2 mL水相飽和的正辛醇，再分別加入18 mL正辛醇飽和的pH 7.4 PBS、pH 6.8 PBS、蒸餾水、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 1.2 HCl，（37±0.5）℃、100 r·min恒溫振蕩72 h，平衡后將水層和正辛醇層分離開，測定正辛醇層和水層中的MLX吸光度，計(jì)算其濃度，并與MLX的log

P

進(jìn)行比較。

2.7 三種美洛昔康自納米乳遞藥系統(tǒng)的質(zhì)量評價(jià)

2.7.1 形態(tài)與分布 分別取MLX-SNEDDS、MLX-S-SNEDDS、MLX-PC-S-SNEDDS各1 g，將其緩慢滴入（37±0.5）℃水浴的100 mL蒸餾水中，緩慢攪拌使其完全乳化。分別取少量乳液噴灑到銅網(wǎng)上，自然晾干，再滴加2%濃度的磷鎢酸負(fù)染載藥銅網(wǎng)，用濾紙吸去多余負(fù)染色液，風(fēng)干后使用JEM-2100透射電鏡觀察三種制劑的形態(tài)。

2.7.2 粒徑與Zeta電位的測定 同“2.8.1”項(xiàng)下方法操作，緩慢攪拌使其完全乳化。經(jīng)微孔濾膜過濾（0.45 μm），馬爾文粒度分析儀測定其粒徑及Zeta電位。

2.7.3 自乳化效率 通過目測法觀察自乳化體系在不同稀釋倍數(shù)（50、100、200 mL蒸餾水）和不同種類分散介質(zhì)（100 mL蒸餾水、pH 1.2 HCl、pH 7.4 PBS）中完全乳化所需的時(shí)間，測定乳化后乳液的粒徑及PDI，以作為評價(jià)制劑自乳化效率的指標(biāo)。具體操作方法如下：取MLX-SNEDDS、MLX-S-SNEDDS、MLX-PC-SSNEDDS各1 g，分別將其緩慢滴入（37±0.5）℃水浴的分散介質(zhì)中，觀察成乳時(shí)間，測定并記錄其粒徑及PDI。

2.7.4 穩(wěn)定性考察

① 物理穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別取適量MLXSNEDDS、MLX-S-SNEDDS、MLX-PC-SSNEDDS于5 mL離心管中，12 000 r·min離心15 min，觀察制劑外觀是否變化，是否出現(xiàn)分層現(xiàn)象。

②冷熱循環(huán)試驗(yàn)：分別取適量MLXSNEDDS、MLX-S-SNEDDS、MLX-PC-SSNEDDS于西林瓶中，密封避光貯存，每12 h將西林瓶交替放置于37℃和4℃的條件下，分別在0、1、5、10 d時(shí)取適量制劑，觀察制劑外觀是否變化，并測量其粒徑和藥物含量的變化情況。

③留樣觀察試驗(yàn)：分別取適量MLXSNEDDS、MLX-S-SNEDDS、MLX-PC-SSNEDDS于西林瓶中，常溫避光儲存，分別于0、1、3、5個(gè)月取樣觀察外觀是否變化，測量其粒徑和藥物含量的變化情況。

④ 形成自納米乳后的穩(wěn)定性：同“2.7.2”項(xiàng)下方法操作，緩慢攪拌使其完全乳化。室溫下放置48 h，觀察24 h 及48 h 時(shí)自納米乳的狀態(tài)，是否出現(xiàn)油水分離，是否出現(xiàn)藥物析出等現(xiàn)象。

2.7.5 體外溶出度的考察 取一定量的MLXSNEDDS、MLX-S-SNEDDS、MLX-PC-S-SNEDDS灌入膠囊中（相當(dāng)于MLX 7.5 mg），同時(shí)取等劑量的原料藥于膠囊中用作對照，按照2020年版《中國藥典》槳法規(guī)定測定溶出度，以900 mL的pH 1.2 HCl、pH 7.4 PBS作為溶出介質(zhì)，設(shè)定溫度為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r·min，分別于5、15、30、45、60、90、120、180、240 min取 樣5 mL，同時(shí)用等溫同體積的相應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)液，過濾（0.45 μm），取續(xù)濾液稀釋至合適濃度測定吸光度值，并計(jì)算其累積溶出百分率。

3 結(jié)果

3.1 美洛昔康在不同輔料中的溶解度

測定MLX在不同輔料中的溶解度，結(jié)果見表 1。MLX在油相油酸和Labrafil M 1944 CS中的溶解度較其他油相中高，在表面活性劑中溶解度均較好，特別是在Tween 80、Cremophor RH40、AEO-9中，助表面活性劑中，MLX在Transcutol HP、PEG400中溶解度較大。選擇對藥物溶解度較好的輔料進(jìn)一步利用三元相圖來進(jìn)行油相、表面活性劑、助表面活性劑的篩選。

表1 MLX在不同輔料中的溶解度
Tab 1 Solubility of MLX in different excipients

類別 輔料 溶解度/（mg·mL－1）油相 油酸 2.435±0.03 IPM 0.151±0.09 IPP 0.172±0.10 GTCC 0.244±0.12 Labrafil M 1944 CS 1.072±0.05表面活性劑 Tween 80 11.902±0.06 Cremophor EL35 4.423±0.15 Kolliphor ELP 1.274±0.06 AEO-9 7.194±0.12 Cremophor RH40 7.188±0.20助表面活性劑 PEG400 1.765±0.18 Transcutol HP 3.351±0.04 Ethanol 0.278±0.15 Isopropanol 0.215±0.12

3.2 三元相圖繪制

3.2.1 油相的篩選 選擇對藥物溶解度比較好的油酸、Labrafil M 1944 CS作為油相，固定Tween 80為表面活性劑，Transcutol HP為助表面活性劑，繪制三元相圖。由圖1可知，當(dāng)油相為Labrafil M 1944 CS時(shí)，三元相圖的自乳化面積最大。

圖1 油相為油酸（A）和Labrafil M 1944CS（B）的三元相圖Fig 1 Tertiary phase diagrams of oleic acid（A）and Labrafil M 1944CS（B）

3.2.2 表面活性劑的篩選 選擇對藥物溶解度前3位的Tween 80、AEO-9、Cremophor RH40作為表面活性劑，油酸和Labrafil M 1944 CS為油相、Transcutol HP 為助表面活性劑，繪制三元相圖。由圖2可知，當(dāng)表面活性劑為Cremophor RH40時(shí)，不論油相為油酸或Labrafil M 1944 CS，相較于其他表面活性劑，三元相圖的自乳化面積最大。

圖2 不同表面活性劑的三元相圖Fig 2 Ternary phase diagrams of different surfactants

3.2.3 助表面活性劑的篩選 固定Cremophor RH40為表面活性劑，油酸和Labrafil M 1944 CS為油相，以Transcutol HP、PEG400為助表面活性劑，繪制三元相圖并觀察乳化情況。由圖3可知，當(dāng)油相為Labrafil M 1944 CS，表面活性劑為Cremophor RH40，助表面活性劑為Transcutol HP時(shí)，三元相圖的自乳化面積最大。因此確定最終處方為Labrafil M 1944 CS、Cremophor RH40、Transcutol HP。

圖3 不同助表面活性劑的三元相圖Fig 3 Ternary phase diagrams of different co-surfactants

3.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)聯(lián)合總評“歸一值”進(jìn)行多指標(biāo)處方優(yōu)化

3.3.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 運(yùn)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處方優(yōu)化，考察指標(biāo)的水平見表 2，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)得到的處方進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表 3。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的自變量水平
Tab 2 Level of independent variable in the central composite design

因素 水平－1.414 －1 0 ＋1 ＋1.414 X1 9.64 20 45 70 80.36 X2 0.38 1 2.5 4 4.62

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果
Tab 3 Central composition design

No.X1 X2 Y1/nm Y2 Y3/（mg·mL－1）1 80.36 2.50 74.64 0.51 0.77 2 9.64 2.50 17.83 0.11 4.58 3 70.00 4.00 95.28 0.23 1.41 4 45.00 0.38 196.17 0.18 2.77 5 45.00 4.62 35.03 0.06 2.98 6 45.00 2.50 35.80 0.10 2.99 7 20.00 4.00 21.31 0.05 4.83 8 45.00 2.50 35.36 0.10 2.90 9 20.00 1.00 22.02 0.06 4.09 10 70.00 1.00 99.51 0.23 1.20 11 45.00 2.50 35.53 0.08 3.97 12 45.00 2.50 35.75 0.09 4.06 13 45.00 2.50 36.85 0.10 3.31

3.3.2 歸一化法綜合評定 利用歸一化法對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使得每個(gè)指標(biāo)均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1之間的“歸一值”，對取值越小越好的因素（粒徑）和取值越大越好的因素（載藥量）采用Hassan方法分別進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求“歸一值”

d

和

d

，公式如下：

d

＝（

Y

－

Y

）/（

Y

－

Y

）

d

＝（

Y

－

Y

）/（

Y

－

Y

）

選用熵值法對標(biāo)準(zhǔn)化后的效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重計(jì)算。熵值是不確定性的一種度量，信息量越大，不確定性就越小，熵也就越小；信息量越小，不確定性越大，熵也越大。因而利用熵值攜帶的信息進(jìn)行權(quán)重計(jì)算，結(jié)合各項(xiàng)指標(biāo)的變異程度，利用信息熵這個(gè)工具，計(jì)算出各項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重，為多指標(biāo)綜合評價(jià)提供依據(jù)。

使用SPSS AU進(jìn)行計(jì)算。使用熵值法對

Y

、

Y

、

Y

等3項(xiàng)進(jìn)行權(quán)重計(jì)算，權(quán)重值分別是0.251、0.238、0.511。并且各項(xiàng)間的權(quán)重相對較為均勻，均在0.333附近，其中

Y

權(quán)重最大。根據(jù)上述方法計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)和權(quán)重系數(shù)，星點(diǎn)設(shè)計(jì)各響應(yīng)值最后得到綜合評分，綜合評分（

Y

）＝

Y

×權(quán)重系數(shù)（

Y

）＋

Y

×權(quán)重系數(shù)（

Y

）＋

Y

×權(quán)重系數(shù)（

Y

）。結(jié)果如表4所示。

表4 處方的綜合評分
Tab 4 Comprehensive scores of formulations

No.X1 X2 Y1/nm Y2 Y3/（mg·mL－1） Y 1 80.36 2.50 74.64 0.51 0.77 0.17 2 9.64 2.50 17.83 0.11 4.58 0.94 3 70.00 4.00 95.28 0.23 1.41 0.37 4 45.00 0.38 196.17 0.18 2.77 0.17 5 45.00 4.62 35.03 0.06 2.98 0.74 6 45.00 2.50 35.80 0.10 2.99 0.72 7 20.00 4.00 21.31 0.05 4.83 1.00 8 45.00 2.50 35.36 0.10 2.90 0.71 9 20.00 1.00 22.02 0.06 4.09 0.90 10 70.00 1.00 99.51 0.23 1.20 0.33 11 45.00 2.50 35.53 0.08 3.97 0.85 12 45.00 2.50 35.75 0.09 4.06 0.87 13 45.00 2.50 36.85 0.10 3.31 0.75

3.3.3 數(shù)據(jù)模型擬合分析及處方優(yōu)化 使用Design Expert 10.0.7軟件對試驗(yàn)結(jié)果與考察因素進(jìn)行分析，對綜合評分（

Y

）進(jìn)行二項(xiàng)式擬合。經(jīng)擬合回歸，得到模型方程：

Y

＝0.78－0.29

X

＋0.12

X

－0.015

X

X

－0.076

X

－0.13

X

。對模型進(jìn)行ANOVA分析，模型的

P

值小于0.05，這說明模型參數(shù)的顯著性檢驗(yàn)通過，失擬值大于0.05，說明該方程擬合度良好。因此可表明該模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測自納米乳的處方最佳組成。3.3.4 處方驗(yàn)證 以載藥量最大、粒徑和PDI最小為優(yōu)化目標(biāo)，預(yù)測的最佳處方為：Labrafil M 1944 CS 20%，Cremophor RH40 40%，Transcutol HP 40%。預(yù)測綜合評分

Y

＝0.997。按照優(yōu)化后的處方制備MLX-SNEDDS，對預(yù)測處方進(jìn)行驗(yàn)證，綜合評分

Y

＝0.952，偏差值為－4.73%，表明所建擬合的模型具有較好的預(yù)測結(jié)果。

3.4 沉淀抑制劑篩選

3.4.1 沉淀抑制劑種類 在MLX-SNEDDS中分別加入2%不同的沉淀抑制劑，將所制得的不同MLX-S-SNEDDS加入介質(zhì)中，經(jīng)稀釋后形成了澄清透明，略帶微藍(lán)乳光的納米乳液體。由圖 5可知，MLX-SNEDDS中藥物的質(zhì)量濃度在15 min時(shí)就迅速降到了23.41 μg·mL，加入PVP K30、

β

-CD、Eudragit L100、HPMC E15LV的制劑中MLX的濃度在15 min時(shí)都迅速沉降到20.00 μg·mL左右，因此可看出這些沉淀抑制劑對藥物沒有抑制沉淀的作用。而加入HPMC K4M、PS-630以及Soluplus的SNEDDS中MLX在60 min時(shí)的質(zhì)量濃度分別為36.07、33.72、43.48 μg·mL，說明HPMC K4M、PS-630、Soluplus對MLX有不同程度的抑制沉淀作用，其中以Soluplus的效果最好。

圖5 不同沉淀抑制劑沉淀的效果Fig 5 Effect of different precipitation inhibitors on inhibition of preparation

3.4.2 沉淀抑制劑用量的確定 為了考察沉淀抑制劑的用量對抑制沉淀的作用的影響，對處方中的Soluplus用量進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示，Soluplus用量的變化對促過飽和作用沒有明顯差異，由于Soluplus在制劑中完全溶解所需時(shí)間較長，因此選擇0.5%的用量。

圖6 沉淀抑制劑的用量對于抑制沉淀的作用的影響Fig 6 Effect of different amounts of Soluplus on the inhibition of preparation

3.5 MLX-S-SNEDDS載藥量的測定

平均載藥量為4.82 mg·mL，與MLXSNEDDS一致，沉淀抑制劑能對納米乳中的MLX有沉淀抑制作用，但并不能增加藥物載藥量。

由于MLX每日服用量為7.5 mg，若制成膠囊，以現(xiàn)在的載藥量計(jì)算，則需服用約3粒500 μL的膠囊，因此應(yīng)考慮提高載藥量以減少服用體積，增加順應(yīng)性?？紤]將MLX先制成MLX-PC，提高其脂溶性，從而提高M(jìn)LX在S-SNEDDS給藥系統(tǒng)中的載藥量。

3.6 MLX-PC的制備工藝研究

3.6.1 單因素考察

① 藥脂比的選擇：設(shè)定藥脂比（MLX和PC的質(zhì)量比）為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1，藥物的質(zhì)量濃度為4 mg·mL，在40℃條件下反應(yīng)1 h，載藥量分別為7.80、7.40、6.06、5.46 mg·mL，以載藥量為評價(jià)指標(biāo)，其他條件不變，藥脂比為1∶3時(shí)，載藥量最大。

② 反應(yīng)時(shí)間的選擇：設(shè)定反應(yīng)時(shí)間為0.5、1、1.5、2 h，藥物的質(zhì)量濃度為4 mg·mL，藥脂比為1∶3，在40℃條件下反應(yīng)至試驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間，載藥量分別為6.84、6.97、7.43、5.06 mg·mL，以載藥量為評價(jià)指標(biāo)，其他條件不變，反應(yīng)時(shí)間為1.5 h時(shí)，載藥量最大。

③ 反應(yīng)溫度的選擇：設(shè)定反應(yīng)溫度為25、40、50、60℃，藥物的質(zhì)量濃度為4 mg·mL，藥脂比為1∶3，在各溫度條件條件下反應(yīng)1.5 h，載藥量分別為7.93、8.00、8.18、7.61 mg·mL，以載藥量為評價(jià)指標(biāo)，其他條件不變，反應(yīng)溫度為50℃時(shí)，載藥量最大。

④ 藥物質(zhì)量濃度的選擇：設(shè)定藥物質(zhì)量濃度分別為4、6、8、10 mg·mL，藥脂比為1∶3，在50℃下反應(yīng)1.5 h，載藥量分別為8.20、8.71、8.42、7.72 mg·mL，以載藥量為評價(jià)指標(biāo)，其他條件不變，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為6 mg·mL時(shí)，載藥量最大。

3.6.2 MLX-PC-S-SNEDDS載藥量的測定MLX-PC按自納米乳的制備方法制成MLX-PC-SSNEDDS，和MLX-S-SNEDDS相比，平均載藥量從4.82 mg·mL變成了8.73 mg·mL，約提高了一倍，可以減少服用體積。

3.6.3 油/水分配系數(shù)的測定 與MLX進(jìn)行對比，MLX-PC在正辛醇飽和的pH 7.4 PBS、pH 6.8 PBS、蒸餾水、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 1.2 HCl中l(wèi)og

P

分別由0.67、0.84、1.26、2.22、2.31增 大 到1.62、2.20、2.56、2.73、2.81，說 明 將MLX制備成MLX-PC后藥物在油相中的溶解度變大，脂溶性增加，可預(yù)期藥物在體內(nèi)的吸收增加，從而提高生物利用度。

3.7 制劑質(zhì)量評價(jià)

3.7.1 外觀與形態(tài)MLX-SNEDDS、MLX-SSNEDDS、MLX-PC-S-SNEDDS 三種制劑均為黃色透明且均一的油狀液體，其中MLX-PC-SSNEDDS顏色會更深，可能是加入了磷脂的緣故。乳化后的納米乳，乳液微粒呈類球形。

3.7.2 粒徑與Zeta電位的測定 MLX-SNEDDS、MLX-S-SNEDDS、MLX-PC-S-SNEDDS的粒徑分別為（18.71±1.04）、（18.30±0.48）、（23.07±0.28）nm，Zeta電位分別為（－1.44±0.11）、（－5.56±0.61）、（－7.07±0.88）mV，PDI分 別為（0.086±0.03）、（0.11±0.03）、（0.132±0.03）。MLX-SNEDDS和MLX-S-SNEDDS乳化后的微粒粒徑相似，MLX-PC-S-SNEDDS粒徑則有所增大。三種制劑的Zeta電位皆為負(fù)值，絕對值依次增大。

3.7.3 穩(wěn)定性考察 觀察MLX-SNEDDS、MLX-SSNEDDS、MLX-PC-S-SNEDDS乳化后形成的納米乳在24 h及48 h的狀態(tài)，可看出MLX-S-SNEDDS、MLX-PC-S-SNEDDS到48 h時(shí)仍然是均一、澄清透明的狀態(tài)，無沉淀析出。而MLX-SNEDDS在24 h時(shí)雖然未出現(xiàn)油水分離現(xiàn)象，但已經(jīng)出現(xiàn)略微渾濁，48 h時(shí)在燒杯底部能發(fā)現(xiàn)明顯沉淀物。

3.7.4 自乳化效率 稀釋倍數(shù)的影響：結(jié)果如表 5所示，不同稀釋倍數(shù)對制劑的自乳化時(shí)間以及PDI沒有顯著影響，自乳化時(shí)間均小于30 s，MLXSNEDDS與MLX-S-SNEDDS自乳化后的粒徑相差不大，而MLX-PC-S-SNEDDS的粒徑則明顯增大。

表5 不同稀釋倍數(shù)對自乳化效率的影響(＝3)
Tab 5 Effect of dilution multiple on self-emulsification efficiency(＝3)

稀釋倍數(shù) 制劑 自乳化時(shí)間/s 粒徑/nm PDI 50 MLX-SNEDDS 25.99±2.8117.44±0.360.177±0.11 MLX-S-SNEDDS 26.28±3.2317.93±0.230.086±0.01 MLX-PC-S-SNEDDS26.63±0.7427.36±0.600.151±0.02 100 MLX-SNEDDS 25.54±3.1220.33±0.450.062±0.05 MLX-S-SNEDDS 26.80±2.8117.19±0.480.112±0.03 MLX-PC-S-SNEDDS27.39±1.4629.23±0.620.159±0.03 200 MLX-SNEDDS 25.29±2.4819.93±0.090.081±0.06 MLX-S-SNEDDS 24.21±3.9319.91±0.610.108±0.07 MLX-PC-S-SNEDDS26.88±2.4427.90±0.480.132±0.07

稀釋介質(zhì)的影響：不同稀釋介質(zhì)下，三種制劑的自乳化時(shí)間以及粒徑分布相差不大，且自乳化時(shí)間均小于30 s，MLX-PC-S-SNEDDS乳化后的粒徑大于MLX-SNEDDS與MLX-S-SNEDDS，可能是由于藥物與磷脂形成了復(fù)合物的緣故。

3.7.5 物理穩(wěn)定性試驗(yàn) MLX-SNEDDS、MLXS-SNEDDS、MLX-PC-S-SNEDDS經(jīng)過高速離心后，未觀察到制劑有分層或者析出的現(xiàn)象，外觀依然是黃色透明且均一的油狀液體。

3.7.6 冷熱循環(huán)試驗(yàn) MLX-SNEDDS、MLX-SSNEDDS、MLX-PC-S-SNEDDS經(jīng)過冷熱循環(huán)后仍然為黃色透明的均一油狀液。乳化后進(jìn)行粒徑以及藥物含量的測定，結(jié)果顯示，經(jīng)過冷熱循環(huán)后制劑的粒徑、PDI以及藥物含量沒有明顯變化，說明所制備的制劑有較好的穩(wěn)定性，溫度變化對制劑的影響較小。

3.7.7 留樣觀察試驗(yàn) 經(jīng)過長期放置以后，制劑的外觀、粒徑以及PDI均無明顯變化，說明制劑經(jīng)過長期放置以后，穩(wěn)定性良好。

3.7.8 體外溶出度的考察 結(jié)果如圖7所示，在pH 1.2 HCl、pH 7.4 PBS介質(zhì)中，三種制劑相比于MLX原藥，均明顯提高了藥物的溶出速率和溶出程度。在體外溶出結(jié)果中，三種制劑的溶出行為并沒有顯著區(qū)別，但在pH 7.4 PBS中三種制劑的累積溶出百分率大于在pH 1.2 HCl中的。這是由于MLX本身的理化性質(zhì)決定的，在pH 7.4 PBS中溶解度大于pH 1.2 HCl。

圖7 三種制劑在pH 1.2 HCl（A）和pH 7.4 PBS（B）中的體外溶出曲線Fig 7 In vitro dissolution curve of the three preparations in pH 1.2 HCl（A）and pH 7.4 PBS（B）

4 討論

促過飽和物質(zhì)的篩選試驗(yàn)證明，對MLX起抑制沉淀作用的沉淀抑制劑有HPMC K4M、PS-630、Soluplus，HPMC可以與MLX上的羥基形成氫鍵作用，但由試驗(yàn)結(jié)果可知HPMC E15LV對MLX沒有明顯的沉淀抑制作用，說明氫鍵并不是HPMC K4M抑制藥物的晶核長大的主要原因。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，分子量及黏度大小對沉淀抑制劑抑制藥物沉淀的作用有關(guān)，對HPMC來說，分子量越高，黏度越大，這可能對藥物晶體的成核以及長大形成了更多的空間位阻，從而起到抑制藥物沉淀的作用，而HPMC K4M的分子量及黏度均遠(yuǎn)大于HPMC E15LV，這可能是HPMC K4M能對MLX起到沉淀抑制作用的主要原因。

PS-630是乙烯吡咯烷酮和乙烯醋酸酯的共聚物，相比于PVP，由于加入了醋酸乙烯酯基團(tuán)，PS-630增加了疏水性，而疏水性可以使PS-630能夠?qū)λ幬锏木w表面的吸附作用更強(qiáng)，從而達(dá)到抑制藥物沉淀的作用。這可能是PS-630相比于PVP K30具有更好的抑制沉淀作用的原因。

Soluplus是聚乙烯醇己內(nèi)酰胺-聚乙烯醇-聚乙二醇接枝共聚物，其結(jié)構(gòu)中既具有作為其主鏈的親水性的PEG 6000，又具有側(cè)鏈中疏水的乙酸乙烯醋與乙烯基己內(nèi)酞，因此Soluplus具有兩親性，屬于一種非離子表面活性劑，可能與MLX-SSNEDDS中的起乳化作用的表面活性劑Cremophor RH40形成了混合膠束，從而抑制藥物晶體的聚集及晶核的長大，達(dá)到抑制藥物沉淀的效果。

自乳化后所形成的納米乳粒徑以及Zeta電位是影響自納米乳化體系穩(wěn)定性的重要因素，且粒徑大小同時(shí)也對溶出速率有影響?？梢钥闯鋈N制劑的粒徑較小，均小于30 nm，納米乳微粒分散均勻，PDI均小于0.200。粒徑越小，所形成的納米乳油水界面面積越大，乳滴粒子的表面自由能越大，這時(shí)就有降低界面自由能的趨勢，驅(qū)使小乳滴聚集形成大乳滴，通過降低比表面積來減少總油水界面面積。納米乳微粒帶電荷后，由于帶有同種電荷，乳滴間會產(chǎn)生靜電斥力，Zeta電位絕對值越大，則靜電斥力越強(qiáng)，可以阻止乳滴間的聚集引起沉降，對增強(qiáng)體系穩(wěn)定性有很大意義。同時(shí)，根據(jù)Stokes方程，粒徑越小，沉降速度越小，越有利于自納米乳乳化后體系的穩(wěn)定。此三種因素使納米乳成為動力學(xué)穩(wěn)定系統(tǒng)。MLXSNEDDS、MLX-S-SNEDDS、MLX-PC-S-SNEDDS乳化后的Zeta電位均為負(fù)值，絕對值依次增大。雖數(shù)值均較小，但對制劑形成自納米乳后的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)只有MLX-SNEDDS在乳化后24 h時(shí)出現(xiàn)略微渾濁，48 h時(shí)在燒杯底部能發(fā)現(xiàn)明顯沉淀物?？赡苁怯捎谄鋃eta電位絕對值較低，乳滴間斥力不足以與降低表面自由能的趨勢相平衡，因此MLX-SNEDDS制劑穩(wěn)定性不夠好。

體外溶出試驗(yàn)證明在不同pH值的介質(zhì)中，MLX-SNEDDS、MLX-S-SNEDDS、MLX-PC-SSNEDDS均能顯著提高M(jìn)LX的溶出度。在pH 7.4 PBS溶出曲線中，MLX-SNEDDS在40 min時(shí)累積溶出百分率開始下降，這可能是由于制劑在pH 7.4 PBS迅速乳化幾乎完全溶出后，乳滴粒子附近藥物濃度迅速升高，導(dǎo)致部分藥物結(jié)晶析出，表現(xiàn)為溶出度降低。MLX-SNEDDS乳化后Zeta電位絕對值僅為1.44，體系穩(wěn)定性不夠，微粒容易聚集沉降，且MLX在水中幾乎不溶，可以預(yù)見在胃腸道內(nèi)被大量稀釋后，表面活性劑與助表面活性劑對藥物的增溶能力大大下降，容易形成沉淀。而MLX-S-SNEDDS、MLX-PC-SSNEDDS 中加入了沉淀抑制劑，同時(shí)Soluplus的兩親性質(zhì)可能對MLX有一定增溶作用，能在一定程度下維持過飽和狀態(tài)，提高了穩(wěn)定性。

此外，載藥量方面相較MLX-S-SNEDDS的4.82 mg·mL，MLX-PC-S-SNEDDS載藥量為8.73 mg·mL，結(jié)合磷脂本身的性質(zhì)使得藥物制成PC后容易穿過細(xì)胞膜，MLX-PC-S-SNEDDS在提高生物利用度上更有潛力。