孫國祥，楊婷，孫萬陽，張江鐳，周愷寧，蒲道俊，陳振鴻（.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 006；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣州 5062；.西南藥業(yè)股份有限公司，重慶 0008；.新疆富沃藥業(yè)有限公司，新疆 沙雅 82200）

中藥是中華民族幾千年文化的瑰寶，有著悠久的歷史，經(jīng)過數(shù)千年醫(yī)療實(shí)踐，中藥的安全性、有效性已得到驗(yàn)證，但是在國際上尚未得到普遍認(rèn)可，未進(jìn)入世界主要臨床體系。在現(xiàn)有條件下，采用幾個(gè)化學(xué)成分定量分析的方法無法適用于成分復(fù)雜的中藥體系，很難找到中藥質(zhì)量標(biāo)志物，也無法代表中藥質(zhì)量。要解決這一難題就需要建立質(zhì)量控制新方法和新模式，加強(qiáng)中藥質(zhì)量評價(jià)的科學(xué)化與標(biāo)準(zhǔn)化。中藥面臨著偉大復(fù)興，開創(chuàng)中藥光譜量子指紋評價(jià)體系，有望把中藥發(fā)展成為世界性醫(yī)藥文化的主體之一。目前，應(yīng)用現(xiàn)代儀器分析手段，如2019年4月孫國祥教授提出基于中藥整體化學(xué)成分系統(tǒng)的光譜量子指紋圖譜技術(shù)是中藥質(zhì)量一致性評價(jià)的一種簡捷新方法。量子指紋圖譜概念始于中藥的傅里葉紅外光譜（FTIR）研究，其測定快速，指紋特征性強(qiáng)，是開展中藥原料藥和中成藥質(zhì)量控制的簡單易行的方法，建立紅外量子指紋圖譜可使其定性和定量功能產(chǎn)生質(zhì)的飛躍[1-9]，繼而用于中藥一致性評價(jià)。紅外量子化過程本身就是對紅外光譜的色譜化，量子峰參數(shù)賦值后具有色譜峰的基本信息。

1 中藥紅外光譜指紋圖譜

中藥具有復(fù)雜性，大部分中藥材藥效成分不明確，在實(shí)際工作中多針對其中含量較多或特征指標(biāo)成分定量，而紅外光譜能全面有效地反映各類型化學(xué)單鍵和不飽和化學(xué)鍵的整體信息，因此通過紅外量子指紋圖譜能有效地反映中藥整體化學(xué)成分的質(zhì)量[10-14]。經(jīng)特殊溶劑提取的紅外光譜指紋圖譜量子指紋化后能鑒別藥材質(zhì)量特征，如藥材的種屬、形態(tài)、產(chǎn)地和采收期等；能對藥材重要活性成分進(jìn)行識別、定性和定量，它能按照官能團(tuán)量子指紋特征峰類型對化合物進(jìn)行官能團(tuán)分類的定性和定量分析，尤其是對能反映中藥質(zhì)量并可作為質(zhì)量控制的指標(biāo)成分的定性和定量，簡便快捷，測試成本低。建立紅外量子指紋圖譜要進(jìn)行儀器精密度、方法重復(fù)性、樣品穩(wěn)定性、線性范圍、定量限和檢測限的考察，以確保該方法的可靠性和專屬性，全面有效地反映藥材的質(zhì)量和藥效。紅外量子指紋圖譜改變了紅外光譜的連續(xù)性特征，變成了分立的量子指紋峰，為建立中藥紅外量子指紋圖譜提供了大量特征信息數(shù)據(jù)，對其精確分析進(jìn)行評價(jià)可揭示數(shù)據(jù)背后的質(zhì)量變異而作為中藥進(jìn)行的質(zhì)控依據(jù)。研究中藥紅外量子指紋圖譜對中藥定性定量能適應(yīng)中藥信息質(zhì)控要求，也是數(shù)字化中藥紅外量子化的現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制模式和一種重要技術(shù)工具與強(qiáng)有力的技術(shù)載體平臺。

1.1 中藥紅外光譜指紋圖譜原理

紅外光譜主要反映C-H、O-H、N-H、C-C等飽和鍵的結(jié)構(gòu)信息，不飽和化學(xué)鍵所產(chǎn)生的紅外吸收峰信息并不多。幾乎所有有機(jī)化合物都有紅外吸收信號，因此將中藥看成多種有機(jī)化合物構(gòu)成的簡單混合物，紅外光譜指紋圖譜可以對其中所含有機(jī)化合物進(jìn)行整體定性定量分析。中紅外光譜分析技術(shù)在藥物的官能團(tuán)鑒定方面有著廣泛作用，特征信息豐富使其主要用于定性鑒別，但實(shí)際應(yīng)用卻忽視了其整體定量功能。近紅外光譜應(yīng)用于定量檢測較多，但需要煩瑣的數(shù)學(xué)建模工作。中藥原料藥物和制劑中包含上百種化學(xué)物質(zhì)成分，測定一定波數(shù)范圍中紅外指紋圖譜和近紅外指紋圖譜能獲得其總化學(xué)組分疊加信息，可作為整體定量鑒定中藥質(zhì)量的技術(shù)手段。中紅外光譜能定量檢測中藥中飽和與不飽和化學(xué)鍵的總信息，尤其是表征單鍵性質(zhì)（占光譜的80%以上）。在確定溫度條件下，在400～4000 cm－1中紅外區(qū)和4000～12 000 cm－1近紅外區(qū)圖譜能對飽和化學(xué)鍵能產(chǎn)生很好的響應(yīng)，這為中紅外指紋圖譜定量檢測中藥整體化學(xué)物質(zhì)組分提供了重要的基礎(chǔ)保證。中藥紅外光譜指紋圖譜的特點(diǎn)有：① 很多物質(zhì)在近紅外區(qū)域的吸收系數(shù)小，故樣品無需用溶劑稀釋即可以直接測定，便于生產(chǎn)過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測；② 適用于漫反射技術(shù)，近紅外區(qū)內(nèi)光散射效應(yīng)大，且穿透深度大，使得近紅外光譜技術(shù)可以用漫反射技術(shù)直接測定樣品，中紅外區(qū)也可以用漫反射法ATRS法測定；③ 近紅外光可以在玻璃或石英介質(zhì)中穿透；④ FTIR和近紅外光譜可以用于樣品定性，也可以得到精度很高的定量檢測；⑤ 測定中藥材及制劑的固體粉末的中紅外光譜，不需用有機(jī)試劑提取分離，與干燥的溴化鉀粉末壓片后可直接進(jìn)行檢測鑒定和定量分析。

1.2 中藥紅外光譜量子指紋化原理

1.2.1 光譜量子指紋概念與特征 記錄不同紅外波長（λ）單色光照射物質(zhì)時(shí)對紅外光產(chǎn)生的吸光度（A）則得A～λ紅外吸收連續(xù)光譜。因連續(xù)曲線抹殺了紅外光量子被吸收的特征，紅外量子指紋圖譜把紅外吸收光譜看成是依次對紅外光子的吸光點(diǎn)到基線（A＝0）的垂線集合，把連續(xù)紅外波長（波數(shù)）的對應(yīng)縱坐標(biāo)合并成簡單線狀量子譜。紅外量子指紋圖譜的基本屬性如下：

① 紅外量子指紋的平面性：把基線（A＝0）到吸收頂點(diǎn)連線稱為紅外單量子指紋譜，紅外吸收光譜則變?yōu)轫樞蚺帕械幕€垂線繪制而成的黑色平面圖；② 紅外量子指紋的加和性：把n＝j(luò)個(gè)波長對應(yīng)的吸光度加和賦值到最后一個(gè)波長上的吸光度上，稱為紅外吸光復(fù)量子指紋（峰高不變或?yàn)楹喜Ⅻc(diǎn)最大吸光度），則吸收光譜可變成垂直基線（A＝0）的分散線狀或棒狀復(fù)量子指紋線譜；③ 紅外量子指紋的單一性：紅外吸收光譜用量子指紋線譜表示，不同波長對應(yīng)的量子指紋是具有專屬性的，其頂點(diǎn)連線為原始吸收光譜；④ 紅外量子指紋的特征性：量子指紋圖譜能簡單明確地表達(dá)紅外光量子被吸收的特征，是吸收光譜真實(shí)的還原表征和簡化描述；⑤ 紅外量子指紋的定量性：紅外量子指紋峰符合朗伯-比爾定律，無論是單量子指紋還是復(fù)量子指紋，因此可進(jìn)行定量分析；⑥ 紅外量子指紋的拓展性：紅外量子指紋技術(shù)可拓展到任何連續(xù)信號曲線的量子化處理，如NIR、熱重分析（TG）、DSC、電化學(xué)指紋圖譜等。

1.2.2 紅外量子指紋信息化賦值規(guī)則 紅外量子指紋是采用不同的吸光度點(diǎn)進(jìn)行合并的方法，量子指紋峰包括：峰號（Pkn），峰位（σi），半峰寬（W1/2），峰高（Hi），峰面積（A），峰面積百分比（P%），能執(zhí)行峰匹配，能進(jìn)行整體定性和定量計(jì)算，符合國際通用的*.cdf文件特征，b為合并點(diǎn)總數(shù)，見（1～3）式。紅外量子指紋峰點(diǎn)信息是進(jìn)行紅外量子指紋一致性評價(jià)的物理基礎(chǔ)信息，是對光譜連續(xù)信號量子化的物理信號進(jìn)行數(shù)字信息化賦值處理的結(jié)果。紅外量子化不單是連續(xù)信號進(jìn)行線狀化變化過程，更重要的是對產(chǎn)生連續(xù)信號圖譜的物質(zhì)基礎(chǔ)所反映和表達(dá)的物理信息的整合與簡化。紅外量子指紋峰信息化是進(jìn)行紅外量子指紋計(jì)算的物質(zhì)基礎(chǔ)，是信息化處理的核心技術(shù)。因此紅外光譜量子化是一個(gè)數(shù)字化賦值過程。紅外量子指紋的定性定量結(jié)果基本與合并點(diǎn)數(shù)多少無關(guān)或影響甚微，原因在于是對原始信息的并合操作具有加和性。因此紅外量子化是一種把連續(xù)信號進(jìn)行色譜量子峰的變換過程，紅外量子指紋峰點(diǎn)具備國際分析學(xué)會(huì)定制的*.cdf文件的基礎(chǔ)信息。紅外量子化是一個(gè)數(shù)字化賦值過程，是對連續(xù)信號數(shù)字化、全值信息化、原始信號完整化的色譜化變換。該方法完全適合于紫外光譜、DSC曲線和電化學(xué)指紋圖譜。

1.2.3 紅外量子指紋操作 紅外光譜包括紫外光譜吸收光譜曲線，以及其他連續(xù)信號（DSC）的*.csv與*.txt原始文件導(dǎo)入“中藥光譜量子指紋一致性數(shù)字化評價(jià)系統(tǒng)4.0”軟件，可執(zhí)行表1中的量子化操作命令，實(shí)現(xiàn)量子指紋化。2019年4月孫國祥教授提出并開展中藥FTIR、UV及DSC方面的量子指紋方法研究，2020年10月拓展到中藥電化學(xué)指紋圖譜的評價(jià)。

表1 量子化命令和功能Tab 1 Quantized command and function for quantum fingerprints

1.2.4 中藥紅外指紋圖譜的測定 獲取中藥紅外光譜的方法有：① 溴化鉀壓片法，中藥取樣量推薦為6 mg（線性范圍考慮在1～12 mg，取樣量太低，會(huì)導(dǎo)致稱量誤差太大），該法定量準(zhǔn)確度高；② 液體池法，需要扣除溶劑的紅外吸收；③ATRS法，獲得紅外光譜的定量特征容易產(chǎn)生一定的誤差，需要進(jìn)一步研究。主要推薦前兩種方法測定中藥FTIR光譜。

圖1 香煙的近紅外光譜（A）與量子指紋圖譜（B，a＝b＝20）及復(fù)方甘草片的FTIR光譜（C）與量子指紋圖譜（D，a＝b＝10）Fig 1 Near-infrared spectrum（A）and quantum fingerprint of cigarette（B，a＝b＝20）and FTIR spectrum（C）and quantum fingerprint of compound licorice tablet（D，a＝b＝10）

圖2 復(fù)方甘草片的FTIR量子指紋圖譜Fig 2 FTIR quantum fingerprint of compound licorice tablets

1.2.5 紅外量子指紋定性定量計(jì)算 連續(xù)紅外光譜和連續(xù)儀器分析信號經(jīng)量子指紋變換后獲得的量子指紋信息能執(zhí)行符合復(fù)雜性科學(xué)規(guī)律的系統(tǒng)指紋定量法進(jìn)行整體定性定量計(jì)算。用宏定性相似度Sm對紅外量子指紋定性鑒別計(jì)算；用宏定量相似度Pm（經(jīng)稱樣量校正）對紅外量子指紋整體定量計(jì)算，見（6～8）式，其中yi代表標(biāo)準(zhǔn)量子峰積分面積，xi代表被測量子峰積分面積。光譜量子指紋圖譜實(shí)質(zhì)上是對光譜進(jìn)行色譜化賦值過程，是一種數(shù)學(xué)處理方式，原理是光譜吸光度的加和性。不同數(shù)據(jù)點(diǎn)合并量子化后，整體定量誤差的差別很小。

2 中藥紫外光譜指紋圖譜（UVFP）

UVFP是反映中藥化學(xué)組分中的π→π*，n→π*和n→σ*化學(xué)鍵價(jià)電子躍遷信息，是不同化學(xué)物質(zhì)紫外光譜的疊加，因此UVFP能定性定量評價(jià)具有不飽和化學(xué)鍵和長共軛體系化學(xué)物質(zhì)的整體質(zhì)量。以UV光譜各點(diǎn)為評價(jià)單元（190～400 nm）對中藥進(jìn)行整體定性定量分析，由于不同的化學(xué)成分體系紫外吸收曲線具有指紋特征，故UVFP可用于中藥及其制劑質(zhì)量鑒定。在建立對照指紋圖譜后用系統(tǒng)指紋定量（SQFM）法對樣品進(jìn)行質(zhì)量評級。UVFP能彌補(bǔ)單一紫外波長或幾個(gè)紫外波長檢測時(shí)對不飽和鍵的信息缺失，避開溶劑的末端吸收，UVFP具有全信息特征。眾多研究人員使用UVFP研究各種樣品之間的異同，如半夏藥材、丹皮、復(fù)方丹參片滴丸、熱毒寧注射液甚至不同種類醋等[15-20]，均證明UVFP對反映樣品信息具有特異性。

2.1 中藥UVFP測定裝置

使用自動(dòng)進(jìn)樣HPLC，管路采用流動(dòng)注射分析（FIA）方式采集UVFP，即用空管路替代色譜柱（Peek tube 長5000 mm，i.d.0.12/0.18 mm），以 DAD 采集在線紫外信號至樣品無吸收為止（通常190～400 nm），在 Agilent 1100（1260）高效液相色譜系統(tǒng)下完成分析。該系統(tǒng)流動(dòng)相與試樣間混合狀態(tài)高度重現(xiàn)，具有穩(wěn)定和極高重現(xiàn)性的特點(diǎn)。該方法單針測定樣品可在1 min內(nèi)完成，快速、準(zhǔn)確。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)（對照）UVFP生成方法

標(biāo)準(zhǔn)（對照）UVFP 生成方法有兩種：

① 平均值法：采用 15 批以上有代表性的中藥原料（藥材、提取物、配方顆粒等）或各類中成藥經(jīng)優(yōu)化的提取方法獲得的供試液所測得紫外光譜全峰點(diǎn)通過均值法計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)（對照）UVFP，是一個(gè)平均化模式；② 用道地藥材（標(biāo)準(zhǔn)藥材）或標(biāo)準(zhǔn)中成藥制劑的2～6份供試液直接進(jìn)樣測定標(biāo)準(zhǔn)（對照）紫外 UVFP，一般為測定6 張紫外光譜指紋圖譜的平均化模式。第二種方法更可取，更易實(shí)現(xiàn)隨行對照定量（隨行對照測定時(shí)為雙樣雙針以上測定）。通過單標(biāo)或雙標(biāo)校正法來排除不同儀器間的系統(tǒng)誤差，所建立的對照 UVFP 可作為直接定性定量分析的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)，因此建立紫外指紋系統(tǒng)的單標(biāo)或雙標(biāo)校正法技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對紫外光譜指紋在質(zhì)量控制和一致性評價(jià)的廣泛應(yīng)用。

2.3 紫外指紋定量法（QUFM）

QUFM是以光譜點(diǎn)為計(jì)算單元，用宏定性相似度Sm監(jiān)測紫外指紋數(shù)量和分布比例，見（6）式；用宏定量相似度Pm監(jiān)測紫外指紋含量狀況及多成分紫外吸收疊加狀況，見（7）式，同時(shí)用變動(dòng)系數(shù)α限定紫外指紋變異性，見（8）式，它代表以C計(jì)量的P的誤差大小。xi與yi分別為樣品和對照UVFP各峰點(diǎn)吸光度，mRFP和mi分別為對照UVFP和樣品的進(jìn)樣質(zhì)量。用Sm、Pm和α鑒定中藥質(zhì)量為經(jīng)典的8級質(zhì)量分類法，也可以用限度法進(jìn)行控制。QUFM能彌補(bǔ)紅外指紋法對不飽和化學(xué)鍵的檢測信息缺失，一般不飽和化學(xué)鍵對紅外指紋的貢獻(xiàn)率約為20%。QUFM適用于紅外和紫外光譜的量子化指紋對中藥質(zhì)量的一致性評價(jià)和控制。

2.4 紫外光譜、紅外光譜、色譜聯(lián)用模型

中藥中有紫外吸收的化合物總質(zhì)量約占中藥成分的20%左右，因此中藥成分的80%并未得到有效檢測（單一紫外波長檢測的HPLC指紋圖譜反映的成分質(zhì)量則更少）。中藥紅外光譜指紋圖譜反映的不飽和化學(xué)鍵約占圖譜面積的20%左右。紫外（190～400 nm）和紅外光譜（400～4000 cm－1）聯(lián)用控制中藥質(zhì)量的一個(gè)基本控制模型見（9～11）式，其中最常用的紅外光譜聯(lián)用系數(shù)η≈0.8，這一數(shù)值也可以通過HPLC紫外定量數(shù)據(jù)和紅外光譜的試驗(yàn)數(shù)據(jù)來測定后再確定。HPLC指紋圖譜的檢測數(shù)據(jù)本質(zhì)上仍然只是對中藥中不到20%質(zhì)量的物質(zhì)組分進(jìn)行質(zhì)量控制。因此用紫外檢測的HPLC指紋圖譜和紫外全指紋譜及紅外光譜指紋圖譜三者聯(lián)用技術(shù)的融合模式見（12～14）式，其中是HPLC多波長 HPLC 指紋圖譜經(jīng) SQFM 評價(jià)后的融合結(jié)果參數(shù)，紫外和紅外光譜總聯(lián)用系數(shù)仍為η≈0.8，也可以通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)測定。因此由HPLC控制的中藥質(zhì)量必須補(bǔ)償80%以上光譜控制的質(zhì)量份額，才具有整體質(zhì)量控制的傾向和科學(xué)性意義。色譜和光譜聯(lián)用建立的基礎(chǔ)應(yīng)該在HPLC檢測條件的多指標(biāo)成分的精準(zhǔn)定量完成后，進(jìn)行綜合評價(jià)中藥質(zhì)量。

中藥紅外光譜和紫外光譜突出反映了兩類宏觀定性定量信息，以紅外光譜對紫外光譜檢測的信號信息進(jìn)行全方位補(bǔ)償。第一步，以紅外光譜能夠檢測80%單鍵信息補(bǔ)償紫外光譜僅檢測20%不飽和鍵的單一功能。兩者按（9～11）式η權(quán)融合后評價(jià)中藥光譜指紋反映的整體質(zhì)量。第二步，采用多波長HPLC綜合指紋圖譜與光譜指紋圖譜綜合整合，即用五波長下三參數(shù)平均值和值與兩類光譜法Sm-IRUV、Pm-IRUV和αm-IRUV按（12～14）式η權(quán)融合后重新評價(jià)中藥質(zhì)量。由于紅外光譜突出反映化學(xué)指紋單鍵信息，因此色譜和光譜指紋譜綜合定量評價(jià)結(jié)果更準(zhǔn)確。充分利用平行五波長HPLC定量指紋圖譜（PFWHPLC-FP）和IRUV指紋譜聯(lián)合鑒定中藥質(zhì)量，具有全面、充分和準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，可為中藥質(zhì)量控制和一致性評價(jià)實(shí)踐提供重要方法。

2.5 紫外全指紋定量法的雙標(biāo)校正原理（見圖3）

圖3 紫外全指紋定量法雙標(biāo)校正原理圖Fig 3 Schematic diagram of double-standard calibration of UV fingerprint quantitative method

在紫外全指紋定量法中雙標(biāo)校正原理為：

① 把建立紫外RFP系統(tǒng)稱為第一色譜系統(tǒng)（the first chromatographic system，F(xiàn)CS）， 也稱初指紋系統(tǒng)（色譜系統(tǒng)1）。選擇兩個(gè)固定濃度的對照品（C1，C2），測定其色譜峰面積（A1，A2），則分別計(jì)算得到（f1，f2，fd1），見式（15～17），分別稱為標(biāo)1，標(biāo)2和雙標(biāo)在初指紋系統(tǒng)的定量校正系數(shù)，三者越大表明靈敏度越大。建立RFP對應(yīng)測試樣品質(zhì)量或濃度，可用稱樣量用mRFP（g）或質(zhì)量濃度表示[CRFP＝mRFP/V（mg·mL－1）]，這是紫外全指紋定量法的重要特征質(zhì)量參數(shù)。

② 把發(fā)生顯著變動(dòng)后的色譜系統(tǒng)稱為第二色譜系統(tǒng)（the second chromatographic system，SCS），也稱新指紋系統(tǒng)。仍然選擇前面的兩個(gè)固定濃度的對照品溶液分別為C1’，C2’，測定其色譜峰面積分別為A1’，A2’，分別計(jì)算得到（f1’，f2’，fdi），見式（18～20），分別稱為標(biāo)1，標(biāo)2和雙標(biāo)在新指紋系統(tǒng)的定量校正系數(shù)，三者越大表明靈敏度越大。

③ 雙標(biāo)相對定量校正因子（fqi）把新指紋系統(tǒng)與初指紋系統(tǒng)的絕對定量校正因子之比稱為相對定量校正因子，見（21～23）式，一般在0.97到1.03，說明兩個(gè)系統(tǒng)定量誤差基本在±3%以內(nèi)，fqi越接近1越好。設(shè)立這個(gè)相對定量校正因子的初衷是考慮把 RFP 系統(tǒng)定量性質(zhì)平移到新色譜系統(tǒng)。經(jīng)過雙標(biāo)校正后，在第一個(gè)色譜系統(tǒng)建立的紫外全指紋定量標(biāo)準(zhǔn)就可以直接對校正后的系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。在新測定色譜系統(tǒng)下，Pm’＝Pm/fdi，是用已建立的標(biāo)準(zhǔn)直接計(jì)算測定樣品的定量相似度。

④ 全紫外光譜校正法，如果使用標(biāo)1和標(biāo)2的全紫外光譜進(jìn)行校正，應(yīng)該計(jì)算新指紋系統(tǒng)標(biāo)1指紋圖譜與初指紋系統(tǒng)標(biāo)1紫外光譜作為標(biāo)準(zhǔn)指紋的宏定量相似度，并考慮濃度改變C1，C1’校準(zhǔn)值，見（24）式，同法處理標(biāo)2并計(jì)算雙標(biāo)校正因子見（25～26）式。

2.6 UVFP主要類型和特點(diǎn)

依據(jù)中藥樣品提取方法，可建立水溶性成分UVFP、脂溶性成分UVFP、全成分UVFP及特征有效組分群UVFP。提取方法的恒定性決定UVFP的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性特征。UVFP具有測定快速（測定中藥混合液的DAD在線光譜的分析時(shí)間＜1 min），穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，定量信息豐富（因波長范圍寬190～400 nm），定量準(zhǔn)確度高和數(shù)字化特征顯著等特征。因此UVFP盡管定性特征性單一，但所提供峰點(diǎn)的定量信息具有全面性和整體性，其能全面反映中藥中化學(xué)成分中不飽和化學(xué)鍵產(chǎn)生的定量疊加全信息，從整體角度考慮其比HPLC紫外單波長檢測的指紋圖譜具有更全面和更準(zhǔn)確的特點(diǎn)。其分析方法價(jià)廉、數(shù)據(jù)信息全面易得。用不同溶劑提取樣品，如水、無水乙醇、甲醇、氯仿、石油醚、環(huán)己烷，以及提取溶劑中加入一定比例的助溶劑十二烷基硫酸鈉（SDS）或者環(huán)糊精都是提高提取效率的方法。測定UVFP時(shí)最好每1 nm或0.5 nm波長采集一個(gè)紫外光譜數(shù)據(jù)點(diǎn)。

2.7 光譜量子指紋圖譜評價(jià)軟件

“中藥光譜量子指紋一致性數(shù)字化評價(jià)系統(tǒng)4.0”是國內(nèi)外第一個(gè)針對紅外光譜和紫外光譜以及DSC曲線等連續(xù)信號曲線進(jìn)行量子指紋化操作的計(jì)算機(jī)評價(jià)軟件，導(dǎo)入文件格式為*.csv文件和*.txt文件，均能實(shí)現(xiàn)“1.2.3”項(xiàng)下的全部量子指紋操作，這些方法均適用于連續(xù)信號文件曲線的量子指紋信息化的數(shù)據(jù)賦值處理。能執(zhí)行量子指紋的系統(tǒng)指紋定量法對中藥進(jìn)行質(zhì)量一致性評價(jià)。該軟件與FTIR和THz光譜儀形成整合系統(tǒng)如下：“LZ9000FTIR中藥紅外量子指紋一致性評價(jià)系統(tǒng)”和“LZ9000THz中藥太赫茲量子指紋一致性評價(jià)系統(tǒng)”。主要使用藥都（本溪）一致科技有限公司開發(fā)的“中藥光譜量子指紋一致性數(shù)字化評價(jià)系統(tǒng)4.0”軟件，中藥企業(yè)可選以上系統(tǒng)作為中藥快速檢驗(yàn)和評價(jià)綜合質(zhì)量的方法之一。

3 咳特靈光譜量子指紋圖譜研究

咳特靈原名榕撲慢支合劑，是一種中西復(fù)方制劑，由廣州市紅十字醫(yī)院與廣州市藥檢所于20世紀(jì)70年代初發(fā)明，是攻克老年慢性支氣管炎、慢性氣管炎中的一項(xiàng)重要科研成果，1981年經(jīng)廣東省衛(wèi)生廳批準(zhǔn)更名為咳特靈片（膠囊）。盡管目前有多種評價(jià)方法用來控制它的質(zhì)量，但現(xiàn)有方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且成本較高，為了探索更優(yōu)的評價(jià)方法，本研究采用FTIR、UV、DSC進(jìn)行整合評價(jià)不同來源的17批咳特靈膠囊樣品質(zhì)量?？忍仂`膠囊S1～S2來自廠家A，S3～S5來自廠家B，S6～S9來自廠家C，S10和S11來自廠家D，S12～S13來自廠家E、S14、S15、S16、S17分別來自廠家F、G、H、I。光譜級的KBr來自大茂化學(xué)試劑（中國天津）。

3.1 儀器和分析條件

3.1.1 FTIR分析 使用iCAN-9傅里葉變換紅外光譜儀（中國天津能譜科技有限公司）、C0-400液壓機(jī)（振達(dá)工具）進(jìn)行了FTIR光譜實(shí)驗(yàn)，波數(shù)范圍為4000～500 cm－1。收集光譜并掃描32次，光譜分辨率為8 cm－1，測量過程室溫保持25℃。

3.1.2 UV分析 UV光譜數(shù)據(jù)由Agilents 1100型液相色譜儀（美國安捷倫）獲得，該系統(tǒng)配備DAD檢測器和中空的PEEK管（5000 mm×0.12 mm）。光譜范圍設(shè)置為190～400 nm，間隔為2 nm。以流動(dòng)注射分析法為分析方法，以乙腈-水（50∶50，V/V）溶液為載體，溫度（35±0.15）℃，流速0.6 mL·min－1，進(jìn)樣量3 μL。

3.1.3 DSC分析 采用DSC-500B（上海研錦科學(xué)儀器有限公司）進(jìn)行DSC分析，使用銦、錫和鋅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)。將5 mg樣品放入坩堝中，在加熱速率為10℃·min－1時(shí)測量在40～500℃的熱流率數(shù)據(jù)。每個(gè)樣品重復(fù)3次以確保準(zhǔn)確性。

3.2 樣品制備

3.2.1 FTIR樣品 精密稱取6 mg膠囊內(nèi)容物和150 mg干燥KBr超細(xì)粉分別放入瑪瑙研缽中，充分混合并研磨。準(zhǔn)確稱取100 mg混合物，轉(zhuǎn)移到模具中，在15 MPa下按壓3 min使其成均勻薄片，扣除背景干擾后記錄相應(yīng)的光譜圖。

3.2.2 UV樣品 取膠囊內(nèi)容物混合均勻，然后精確稱取0.4 g，向其中加入80%甲醇10 mL，超聲10 min后得到原液，測定時(shí)將原液稀釋50倍。

3.2.3 DSC樣品 取膠囊內(nèi)容物混合均勻，精確稱取5 mg，將其放入鋁坩堝中并使其分布平整均勻。

3.3 結(jié)果和討論

3.3.1 FTIR指紋分析 FTIR儀器精密度通過對同一樣品連續(xù)測試6次而獲得，重復(fù)性通過分析從一個(gè)批次樣品制備的6份樣品提取物來檢查。接著利用樣品指紋圖譜宏定量相似度Pm對方法進(jìn)行驗(yàn)證，Pm的RSD值小于0.44%，表明該方法可行。

在4000～400 cm－1內(nèi)檢測17批咳特靈膠囊的FTIR指紋圖譜并進(jìn)行9點(diǎn)平滑，見圖 4A。推斷出2924 cm－1處的峰和2862 cm－1是脂肪族-CH3和-CH2的伸縮振動(dòng)峰，2361 cm－1是脂肪族三鍵的伸縮振動(dòng)峰，1607 cm－1峰歸因于C＝O多酚羰基和C＝C芳環(huán)的伸縮，1518 cm－1是碳芳香環(huán)骨架的伸縮振動(dòng)峰。O-C吸收峰在1253 cm－1和1022 cm－1，776 cm－1為-CH的面外彎曲振動(dòng)峰。

3.3.2 FTIR-QFP建立與評價(jià) 分別采用b＝5、10、20和50點(diǎn)定點(diǎn)合并法生成量子指紋圖譜，并使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)不同合并點(diǎn)數(shù)的結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最后確定選擇10點(diǎn)融合技術(shù)（最大峰高法）生成量子指紋圖譜得83個(gè)峰，見圖 4B。結(jié)果17批咳特靈膠囊的Sm高于0.928，Pm范圍為56.2%～51.7%，見表1。樣品被分為6個(gè)等級，其中8個(gè)批次（S3、S4、S5、S6、S7、S10、S12、S13）≤4級，7個(gè)批次（S1、S2、S9、S11、S14、S15、S17）為5～6級，只有2個(gè)批次（S8和S16）為7級或8級，見表2。從圖 4A可以看出，同一廠家不同批次的光譜基本相同，而不同廠家FTIR光譜差異較大，這表明FTIR及其量子指紋圖譜可用于制劑質(zhì)量等級評價(jià)。

圖4 FTIR指紋圖譜（A）及FTIR量子指紋圖譜（B）Fig 4 FTIR fingerprint（A）and FTIR quantum fingerprint（B）

表2 3種量子指紋圖譜分別評價(jià)咳特靈膠囊質(zhì)量結(jié)果Tab 2 Three quantum fingerprints in evaluating the quality of Keteling capsules

3.3.3 UV指紋分析 精確吸取3.0 μL 的S1供試品溶液，以0.6 mL·min－1的流速用于紫外檢測。進(jìn)樣6次并記錄色譜圖來評估儀器精密度。平行制備6個(gè)S1樣品供試液，分別測試以評估方法重復(fù)性。在供試品溶液準(zhǔn)備后的0、0.5、1、1.5、2和2.5 h將3.0 μL S1進(jìn)樣并記錄色譜圖進(jìn)行穩(wěn)定性分析。在250 nm處的峰面積和保留時(shí)間的RSD均小于1.5%，結(jié)果表明本方法符合要求。

3.3.4 UV-QFP建立與評價(jià) 17批咳特靈膠囊的UV見圖 5A，使用定點(diǎn)合并法2點(diǎn)融合技術(shù)獲得紫外量子指紋圖5B（32個(gè)量子指紋峰）。17批樣品UV-QFP在190～400 nm內(nèi)被清晰區(qū)分，尤其是來自不同廠家的樣品指紋信息差異相對較大。樣品分析結(jié)果顯示Sm均高于0.975，但Pm變化很大，樣品分為5個(gè)等級，其中13批樣品（S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16）屬于7級和8級，4批樣品低于4級（S1、S2、S3和S17）。一方面，質(zhì)量等級顯示不飽和化合物含量的波動(dòng)，這可能是由于在檢測波長范圍內(nèi)各種物質(zhì)的含量明顯不同造成的。另一方面，UV-QFP評價(jià)結(jié)果與其他評價(jià)結(jié)果之間的差異可能是由于非共有組分、不飽和鍵和發(fā)色團(tuán)對UV光譜的影響。這進(jìn)一步說明使用單一檢測技術(shù)單方面提供化學(xué)模式或特征，會(huì)限制中藥整體的綜合質(zhì)量評價(jià)結(jié)果。

圖5 UV指紋圖譜（A）及UV量子指紋圖譜（B）Fig 5 UV fingerprint（A）and UV quantum fingerprint（B）

3.3.5 DSC分析 為了探索合適的咳特靈膠囊DSC檢測條件，對加熱速率和重量分別進(jìn)行了考察。首先精密稱取5.0 mg內(nèi)容物，加熱速率分別為5、10、20℃·min－1測定DSC譜。結(jié)果表明加熱速率過高或過低都會(huì)影響峰位的識別。隨著加熱速率增加，放熱峰形狀變大，并向高溫區(qū)移動(dòng)。通過比較不同升溫速率曲線，確定選擇10℃·min－1作為加熱速率。然后分別稱量2.25、4.09、6.05、8.21、10.17和12.07 mg樣品進(jìn)行測試，以樣品質(zhì)量為自變量，與Pm進(jìn)行線性回歸得回歸方程為Pm＝8.39m－42.32，r＝0.9932。結(jié)果表明，在2.25～12.07 mg內(nèi)樣品質(zhì)量與Pm呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。通過比較，最終選擇峰位適中、峰形良好的條件（取樣5.0 mg）進(jìn)行DSC試驗(yàn)。

3.3.6 熱重變化和狀態(tài)變化的過程分析 DSC試驗(yàn)中17批咳特靈膠囊的DSC曲線見圖6A，均有三個(gè)階段，顯示一個(gè)吸熱峰和兩個(gè)放熱峰。吸熱峰66～101℃是樣品吸附水的蒸發(fā)。第一個(gè)放熱峰位于228～352℃，第二個(gè)放熱峰位于359～496℃區(qū)域，兩個(gè)放熱峰都伴隨著樣品質(zhì)量顯著下降。結(jié)合峰值及樣品實(shí)時(shí)狀態(tài)顯示，均由樣品熱分解導(dǎo)致，第一個(gè)放熱過程產(chǎn)生焦化現(xiàn)象，第二個(gè)放熱寬峰是因樣品燃燒所致。

3.3.7 DSC-QFP建立與評價(jià) 通過b＝100點(diǎn)的定點(diǎn)合并法得到17個(gè)樣品DSC圖見圖 6A，其DSC-QFP見圖 6B，并將其劃分為5個(gè)質(zhì)量等級，見表 1。其中Sm＞0.863，Pm范圍為73.5%～126.6%，結(jié)果表明DSC揭示的質(zhì)量等級跨度反映了所有樣品總化學(xué)物質(zhì)的變化特征，能夠反映樣品全物質(zhì)的相似程度。

圖6 DSC指紋圖譜（A）和DSC量子指紋圖譜（B）Fig 6 DSC fingerprints（A）and DSC quantum fingerprints（B）

3.4 FTIR-QFP、UV-QFP和DSC-QFP的整合評價(jià)

本文按照（9～11）式采用FTIR聯(lián)用系數(shù)η≈0.8融合模型評價(jià)結(jié)果見表3，以此表征咳特靈膠囊全物質(zhì)組分的質(zhì)量評價(jià)。DSC反映的是全物質(zhì)質(zhì)量的相變過程，所以使用DSC和IRUV的結(jié)果進(jìn)行等權(quán)融合，從而得到以全物質(zhì)組分為基礎(chǔ)的兩種原理的綜合評價(jià)結(jié)果。

表3 FTIR＋UV融合和3種量子指紋整合評價(jià)結(jié)果Tab 3 Integrated evaluation of FTIR＋UV and 3 quantum fingerprints

IRUV整合結(jié)果顯示所有樣品Sm高于0.942，Pm分布于65.1%～150.1%，這表明所有樣品的定性相似度很高，同時(shí)Pm仍然能夠?qū)悠愤M(jìn)行有效地區(qū)分質(zhì)量。3種光譜量子指紋圖譜整合IRUV-DSC（1∶1）的Sm均大于0.885，Pm位于81.0%～127%，見圖7，3種量子指紋圖譜的融合IRUV-DSC（1∶1）評價(jià)結(jié)果中和了單一或者兩種圖譜整合評價(jià)結(jié)果，具有更科學(xué)更準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

圖7 FTIR＋UV整合和3個(gè)量子指紋圖譜的整合的評價(jià)等級圖Fig 7 Integrated evaluation ranking of FTIR＋UV integration and 3 quantum fingerprints

4 結(jié)論

采用指標(biāo)化學(xué)成分定量分析無法適用于復(fù)雜中藥體系，很難找到中藥質(zhì)量標(biāo)志物，也根本無法代表中藥質(zhì)量。建立質(zhì)量控制新方法和新模式，探尋中藥質(zhì)量評價(jià)的科學(xué)化與標(biāo)準(zhǔn)化十分重要。

應(yīng)用現(xiàn)代儀器分析手段，基于中藥整體化學(xué)成分系統(tǒng)之上的光譜量子指紋圖譜技術(shù)是中藥質(zhì)量一致性評價(jià)的一種簡捷新方法。量子指紋圖譜概念始于中藥紅外光譜研究，特別是FTIR測定快速，指紋特征性強(qiáng)，是開展中藥原料藥和中成藥質(zhì)量控制的簡單易行方法，紅外量子指紋使其定性和定量功能產(chǎn)生質(zhì)的飛躍。UV只能檢測帶有長共軛體系的非飽和化合物含量，但FTIR主要揭示化合物中單鍵的伸縮振動(dòng)峰和單鍵為主的轉(zhuǎn)動(dòng)能級躍遷。因此將UV指紋圖譜與FTIR指紋圖譜相結(jié)合可以有效相互補(bǔ)充。DSC主要反映物質(zhì)相變，可監(jiān)測全部物質(zhì)在相變過程中能量吸收或釋放，補(bǔ)充及彌補(bǔ)UV和FTIR無法檢測到的整體物質(zhì)?？傊?，由于檢測角度、范圍和化合物的差異，單一FTIR、UV、DSC指紋圖譜方法可能會(huì)導(dǎo)致評估結(jié)果出現(xiàn)偏差，因此，基于3種檢測方法獲得量子指紋圖譜進(jìn)行整合策略，是考慮到全部物質(zhì)的物理變化和能量變化的總特征，是一種更優(yōu)越的全質(zhì)量控制方法。光譜量子化操作過程本身就是對光譜連續(xù)信號的色譜化處理，是一種觀念和概念創(chuàng)新，中藥光譜量子指紋圖譜用于中藥一致性評價(jià)大有可為。