李英英 鄭云柯 王祝年

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 海南?？?571101；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 海南?？?571101）

銅鼓嶺國家級自然保護區(qū)位于海南島東北部的 文 昌 市 內(nèi) ， 地 理 坐 標(biāo) 為 E 110°58′30″～111°03′00″，N 19°36′54″～19°41′21″，保護區(qū)總面積為44 km2，其中陸地面積為13.33 km2，海域面積為30.67 km2，核心區(qū)500 hm2。銅鼓嶺保護區(qū)屬于熱帶海洋性島嶼季風(fēng)氣候區(qū)，具有全年無霜、雨量充沛、干濕季節(jié)分明、日照充足等特點；年平均氣溫23.9℃，全年日照時數(shù)為2 137 h，年均降雨量為1 721.6 mm，年均蒸發(fā)量為1 872.7 mm。東北風(fēng)為該區(qū)常年的主導(dǎo)風(fēng)向，年平均風(fēng)速為2.8 m/s；東南向波浪為常波浪，海域風(fēng)浪常以 3級風(fēng)浪為主。銅鼓嶺保護區(qū)土壤以磚紅壤為主，其土層淺薄，土壤發(fā)育程度相對較低；迎海面土壤較為濕潤，背海面巖石的裸露面積大，土壤含水量較低；水系不發(fā)達(dá)，由于山區(qū)面積較小、坡度大、土層薄，集水條件差，因此銅鼓嶺山地沖溝多為干涸或間歇溝，且東西向多呈平行并近似垂直于山體走向分布，地表經(jīng)流分別向東注入南海，向西流入堆積平原[1]。銅鼓嶺的水熱氣候因素為該區(qū)植被的生長發(fā)育提供了有利條件，保護區(qū)內(nèi)植被茂密，植物資源豐富；由于受到海陸風(fēng)和海潮的影響，銅鼓嶺地區(qū)的植被呈明顯的垂直分布和水平分布規(guī)律，植被類型隨著海拔和階地、坡向的不同，有很大的區(qū)別。從濱海沼澤、沙灘、階地至山麓和丘陵依次分布有濱海沙生植被、山麓灌木林、紅樹林、熱帶常綠季雨矮林及局部人工栽培的人工林等植被類型，其中頂級植被類型為熱帶常綠季雨矮林[2-5]?；阢~鼓嶺自然保護區(qū)內(nèi)熱帶季雨矮林的特殊性，較多的學(xué)者對該森林生態(tài)系統(tǒng)開展研究，但截至目前，尚未發(fā)現(xiàn)針對該保護區(qū)內(nèi)地衣多樣性的相關(guān)研究，本次調(diào)查彌補了該區(qū)地衣相關(guān)研究的空白。

地衣是一類由真菌和綠藻或藍(lán)細(xì)菌組成的可進行無性或有性繁殖的共生生物體，而此類與特定的藻類或藍(lán)細(xì)菌處于穩(wěn)定共生聯(lián)合狀態(tài)的?；哉婢谛纬傻牡匾鹿采w中占據(jù)重要優(yōu)勢地位；真菌是地衣體的主要成員，它決定了地衣體的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，且地衣的有性生殖過程就是真菌的生殖過程，所以地衣又稱為地衣型真菌(lichenied fungi)[6]。構(gòu)成地衣的真菌稱為地衣型真菌，而生長于地衣菌絲體內(nèi)的非地衣型真菌也是一個龐大的類群，此類真菌被稱為地衣內(nèi)生真菌（endolichenic fungi）[7]。內(nèi)生真菌是指在其自身生活史中的某一個階段存在于健康的植物組織內(nèi)部，但不會引起宿主明顯病癥或不會對宿主造成明顯傷害的真菌[8]。地衣是森林生態(tài)系統(tǒng)中附生生物的重要組成部分，不僅能維持森林生態(tài)系統(tǒng)中物種的多樣性和完整性，對于林中環(huán)境的變化也具有檢測能力；另外，由于地衣耐寒、耐旱，且對生境的營養(yǎng)成分要求不高，所以分布十分廣泛。與此同時，作為先鋒植物的地衣，在森林群落原生演替過程中，對于土壤的形成和群落中環(huán)境條件的改善也起著至關(guān)重要的作用[9]。

本次考察對保護區(qū)內(nèi)森林群落中重要值排名前 20的相關(guān)樹種[10]樹干上附生地衣進行采集，并通過分子生物學(xué)技術(shù)對地衣及其內(nèi)生真菌進行分類學(xué)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

對銅鼓嶺自然保護區(qū)內(nèi)重要值前 20的樹種（表1）進行樹干附生地衣的采樣，共采集地衣樣品252份。

表1 熱帶季雨矮林重要值前20的樹種名錄

1.2 方法

1.2.1 PCR 擴增利用改良的 CTAB法[11]提取地衣的總DNA，以通用引物ITS1F(5‘-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3’)和 ITS4(5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)對真菌的 rDNA ITS區(qū)段進行PCR擴增[12]。

PCR 反應(yīng)體系：10×Taq buffer緩沖液 2.5 μL，10 mmol/L 的 d NTP 0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、引物 ITS4(10 μmol/L)和 ITS4(10 μmol/L)各 0.5 μL，BSA 溶液 2 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 17.5 μL，總體積 25 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 40 s，55℃退火 40 s，72℃延伸55 s，循環(huán)30次；72℃延伸10min；4℃保存。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像儀分析條帶。割膠回收條帶清晰的樣品，將純化后的樣品送北京諾賽基因測序公司測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理與分析利用BioEdit 5.0.6對序列測序結(jié)果進行手工校正，將獲得的正確序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源比對搜索，確定與本實驗克隆親緣關(guān)系最近的種屬名稱；挑選親緣關(guān)系相近的參考序列，采用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣型真菌種類

對地衣型真菌樣品的陽性克隆進行測序，將所獲得的 rDNA-ITS片段在 NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，結(jié)果見表2，同時對具有較高同源性的參考序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。可以看出，此次調(diào)查共發(fā)現(xiàn)8科13屬26種地衣型真菌，其中擔(dān)子菌門1種，子囊菌門25種。

圖1 地衣序列進化樹

表2 真菌序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中克隆序列比對結(jié)果

2.2 地衣內(nèi)生真菌種類

對地衣內(nèi)生真菌樣品進行DNA提取克隆，測序陽性克隆，將目的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，結(jié)果見表3。根據(jù)表3可將內(nèi)生真菌分為擔(dān)子菌門和子囊菌門兩大類，對具有較高同源性的參考序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2、3）。此次調(diào)查共發(fā)現(xiàn)31種內(nèi)生真菌，其中擔(dān)子菌門包含8種，子囊菌門包含23種。

圖2 擔(dān)子菌門內(nèi)生真菌進化樹

表3 真菌序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中克隆序列比對的結(jié)果

續(xù)表3 真菌序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中克隆序列比對的結(jié)果

續(xù)表3 真菌序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中克隆序列比對的結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 地衣型真菌多樣性

地衣中的共生菌多為子囊菌，少數(shù)為擔(dān)子菌，主要負(fù)責(zé)吸收水分和無機鹽；提供光合作用的共生體多為藍(lán)藻或綠藻，負(fù)責(zé)制造營養(yǎng)物質(zhì)[13-17]。本研究根據(jù)序列測序結(jié)果共得到地衣型真菌 26種，其中25種地衣型真菌為子囊菌門，隸屬8科13屬，分別為點衣屬（Ocellularia）、茶漬衣屬（lecanora）、文字衣屬（Graphis）、樹花屬(Ramalina)、大葉梅屬(Parmotrema)、凸唇衣屬(Platygramme)、Thelotremateae、絮緣衣屬（Byssoloma）、Absconditella、Austroparmelina、類小核衣屬（Pyrenula）、Chaenothecopsis、Graphidoideae。文字衣科(Graphidaceae)的地衣占50%，其中擔(dān)子菌門只有一種，為云片衣屬。說明在銅鼓嶺熱帶季雨矮林內(nèi)，子囊菌門的地衣在地衣種類中占絕對優(yōu)勢，且文字衣科的地衣最多。

3.2 地衣內(nèi)生真菌多樣性

地衣內(nèi)生真菌與植物內(nèi)生真菌相似，不僅不引起宿主表現(xiàn)病癥，在分類學(xué)、多樣性和進化歷史等方面也都有一定的相似性[18]。李銘[19]研究中國云南麗江老君山地區(qū)的地衣內(nèi)生真菌多樣性時，對68株具有代表性的真菌菌株進行分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)的內(nèi)生真菌全部屬于子囊菌門，分屬于座囊菌綱、散囊菌綱、垂舌菌綱、茶漬綱、糞殼菌，共5綱17目，多樣性程度較高，并指出不同地衣類型是地衣內(nèi)生真菌多樣性的主導(dǎo)因素。

本研究根據(jù)結(jié)果將所調(diào)查的地衣內(nèi)生真菌分為31種，可以劃分擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)兩個大類，其中擔(dān)子菌門包含8種，分屬于柄銹菌綱(Pucciniomycetes)、擔(dān)子菌綱(Heterobasidiomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)，共 4綱 5目；子囊菌門包含 23種，分屬于子囊菌綱（Ascomycetes）、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、核菌綱(Pyrenomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、圓盤菌綱(Orbiliomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)，共6綱10目。表明在地衣體內(nèi)除去構(gòu)成地衣的地衣型真菌，地衣內(nèi)生真菌也是種類和資源豐富的物種，此類真菌可能會對地衣自身的生長產(chǎn)生一定的影響，有待深入系統(tǒng)地開展研究。

圖3 子囊菌門內(nèi)生真菌進化樹

目前，關(guān)于海南地衣的研究報道還相對較少，本研究嘗試對銅鼓嶺熱帶季雨矮林內(nèi)的地衣進行調(diào)查，利用當(dāng)前流行的分子測序技術(shù)，鑒定地衣及其內(nèi)生真菌的種類。雖然本實驗樣地內(nèi)的地衣型真菌和地衣內(nèi)生菌群落顯示出了一定的生物多樣性，但與 GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對發(fā)現(xiàn)，多數(shù)地衣型真菌和地衣內(nèi)生菌為未知群落，導(dǎo)致無法明確大部分地衣型和地衣內(nèi)生菌的分類，然而這一結(jié)果也暗示，該區(qū)地衣型真菌和地衣內(nèi)生菌可能具有其獨特的新類群。因此，對該區(qū)生態(tài)系統(tǒng)中的地衣開展研究具有重大價值和意義。