王 楠，許 良，吳國明

(杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 311201)

在常規(guī)手術(shù)修復(fù)肌腱損傷的肌腱愈合過程中，受外源性愈合、炎性反應(yīng)及肌腱細(xì)胞自身增殖的影響，常發(fā)生肌腱粘連，影響關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)及患者預(yù)后。近年來，針對不同粘連發(fā)生的病理機(jī)制，布洛芬、6-磷酸果糖、5-氟尿嘧啶等藥物被先后證明具有不同程度的防治肌腱粘連的作用，但目前臨床應(yīng)用較為局限，尚未找到肌腱粘連的有效解決辦法。A型肉毒素(botulinum toxin type A, BTXA)是最早應(yīng)用于美容整形外科的具有神經(jīng)毒理作用的生物制劑，現(xiàn)階段廣泛應(yīng)用于除皺、瘦臉等美容產(chǎn)業(yè)中，此外有研究表明BTXA能夠通過抑制成纖維細(xì)胞增殖、減少膠原合成發(fā)揮抑制瘢痕增生的作用。本研究通過體外誘導(dǎo)培養(yǎng)兔肌腱成纖維細(xì)胞，觀察相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)變化，旨在探究BTXA對肌腱粘連的作用及機(jī)制，為擴(kuò)大BTXA治療范圍和臨床防治術(shù)后肌腱粘連提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料 注射用A型100單位肉毒素購自蘭州生物制品研究所有限公司(國藥準(zhǔn)字S10970037)；I型膠原酶(Worthington, Lakewood, NJ)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Invitrogen(Rockville, MD, USA)；Actin-tracker Green、DAPI熒光染料購自CST(Danvers, MA, USA)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自Aladdin公司；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bovine basic fibroblast growth factor，bFGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2) 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 兔肌腱成纖維細(xì)胞提取及培養(yǎng)

1.2.1 實驗動物 普通級成年雌性新西蘭兔5只，體質(zhì)量(3.5±0.5)kg，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(SYXK(浙)2019-0026)，動物實驗操作嚴(yán)格遵守動物倫理保護(hù)法等相關(guān)規(guī)定，由我院倫理道德委員會監(jiān)督開展。

1.2.2 細(xì)胞提取及培養(yǎng) 8 mg/100 g濃度氯胺酮肌肉注射麻醉動物，無菌切取前肢中跖趾深屈肌腱10條，參照文獻(xiàn)報道方法采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，常規(guī)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞穩(wěn)定傳代3代后用于后續(xù)實驗操作。

1.3 細(xì)胞檢測

1.3.1 細(xì)胞增殖檢測 將上述穩(wěn)定傳代的細(xì)胞分為對照組(Ctrl組)、低劑量組、中劑量組及高劑量組，分別給予0、10、30、50 U/mL BTXA。接種各組細(xì)胞1×10個于96孔板中，每組設(shè)置6個平行對照孔，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后更換含對應(yīng)濃度BTXA的DMEM培養(yǎng)基200 μL，對照組給予等量空培。繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h后向孔內(nèi)加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，靜置孵育4 h。棄上清液，加入200 μL DMSO溶解震蕩細(xì)胞結(jié)晶產(chǎn)物15 min，酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在490 nm處的吸光值(OD 值)。

1.3.2 細(xì)胞周期檢測 分組接種細(xì)胞于6孔板中，加入對應(yīng)濃度BTXA的DMEM培養(yǎng)基1 mL，對照組給予等量空培，置于培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)干預(yù)48 h。消化收集上述處理后的細(xì)胞，加入70%乙醇重懸細(xì)胞4 ℃固定過夜，離心收集細(xì)胞沉淀，參照細(xì)胞周期檢測試劑盒染色處理后采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期分布變化。

1.4 細(xì)胞免疫熒光觀察 分組接種細(xì)胞于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，每孔100個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后給予不同濃度BTXA干預(yù)48 h，吸去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min。去固定液，加入0.1% Triton-X室溫處理10 min，5% BSA封閉30 min后加入Actin-tracker Green細(xì)胞骨架抗體(工作濃度1∶100)，避光孵育2 h。PBS洗滌培養(yǎng)皿2次，DAPI避光核染5 min后采用激光共聚焦顯微鏡觀察并采集照片。

1.5 檢測TGF-β1、bFGF、MMP-2蛋白及mRNA表達(dá) 各組細(xì)胞給藥處理48 h后，ELISA檢測各組細(xì)胞TGF-β1、bFGF、MMP-2蛋白表達(dá)量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。收集給藥處理后的各組細(xì)胞，qRT-PCR檢測 TGF-β1、bFGF、MMP-2 mRNA相對表達(dá)量。引物序列：GAPDH，上游：CAATTGGCTCGAATACAGCA，下游：AGGACATGACGCATGGTCT；TGF-1，上游：CCTTAACAGGATGTGACC，下游：GGCTGCCCAGAGTTCGTAA；bFGF，上游：GCCGCCTCATCGGACGAC，下游：CCTTCTCAAGGTCG ACGGT；MMP-2，上游：TTCTGGGACCTGACCGACC，下游：AGGTCTGCTGAATCCGTCC。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 上述實驗結(jié)果均采用Graph Pad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，經(jīng)正態(tài)分析和方差齊性檢驗后行方差分析，以<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BTXA抑制兔肌腱成纖維細(xì)胞體外增殖 經(jīng)BTXA處理的各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞增殖活力均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=95.573，<0.05)。如圖1所示：BTXA處理24 h后，高劑量組(50 U/mL)細(xì)胞體外增殖活力顯著低于其他3組；BTXA處理36 h后，中劑量組(30 U/mL)細(xì)胞增殖活力顯著低于對照組和低劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)。

注: a與Ctrl 組比較，b與10 U/mL組比較，c與30 U/mL組比較，均P<0.05。圖1 各組細(xì)胞生長曲線Figure 1 Cell growth curves of each group

2.2 BTXA調(diào)節(jié)兔肌腱成纖維細(xì)胞周期分布 給予0、10、30、50 U/mL BTXA干預(yù)誘導(dǎo)后，細(xì)胞周期分布阻滯在G0/G1期的細(xì)胞比例分別為(38.74±4.21)%、(43.13±6.36)%、(48.37±7.58)%、(61.03±7.63)%，S期停留細(xì)胞比例分別為(18.27±3.14)%、(15.23±2.84)%、(11.37±2.51)%、(8.14±1.92)%；高劑量組G0/G1期細(xì)胞所占比例較其他三組顯著升高，S期細(xì)胞數(shù)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)。中、高劑量組細(xì)胞G2/M期細(xì)胞含量較對照組和低劑量組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)，而兩組細(xì)胞間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05)。見圖2。

注: a與Ctrl 組比較，b與10 U/mL組比較，c與30 U/mL組比較，均P<0.05。圖2 不同濃度BTXA對細(xì)胞周期進(jìn)程的影響Figure 2 Effects of different concentrations of BTXA on cell cycle progression

2.3 BTXA影響細(xì)胞骨架形態(tài)及黏附變化 如圖3所示：DAPI核染色呈藍(lán)色熒光，Actin-tracker Green結(jié)合細(xì)胞骨架蛋白呈亮綠色熒光，與對照組相比，BTXA處理后各組細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生明顯變化，Actin-tracker Green陽性蛋白分布隨BTXA干預(yù)濃度增加而減少。對照組細(xì)胞黏附較密集，細(xì)胞骨架呈一致性排列鋪開；低、中、高劑量組細(xì)胞隨BTXA劑量增加細(xì)胞黏附面積逐漸減小并出現(xiàn)皺縮，綠色熒光形態(tài)變化、染色面積較對照組逐漸減弱。

圖3 不同濃度BTXA對細(xì)胞骨架形態(tài)影響(×1 000)Figure 3 Effects of different concentrations of BTXA on cytoskeleton morphology (×1 000)

2.4 細(xì)胞TGF-β1、bFGF、MMP-2蛋白表達(dá)變化 與對照組相比，中、高劑量組細(xì)胞TGF-β1、bFGF蛋白表達(dá)水平顯著降低，且高劑量組細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平顯著低于其他3組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)；隨BTXA干預(yù)濃度增加各組細(xì)胞MMP-2表達(dá)水平逐漸升高，中、高劑量組細(xì)胞MMP-2含量高于對照組和低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)。見表1。

表1 不同濃度BTXA對細(xì)胞TGF-β1、bFGF、MMP-2蛋白表達(dá)影響(n=6)

2.5 TGF-β1、bFGF、MMP-2 mRNA表達(dá)變化 如圖4所示：與對照組相比，中、高劑量組細(xì)胞TGF-β1、bFGF mRNA相對表達(dá)量顯著降低，且高劑量組細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)水平顯著低于其他3組；各組細(xì)胞MMP-2 mRNA表達(dá)水平隨BTXA濃度增加而升高，高劑量組顯著高于其他3組；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)。

注: a與Ctrl 組比較，b與10 U/mL組比較，c與30 U/mL組比較，均P<0.05。圖4 不同濃度BTXA對細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的影響Figure 4 Effects of different concentrations of BTXA on intracellular expression of related genes

3 討論

目前研究認(rèn)為肌腱粘連與肌腱愈合有著重要的聯(lián)系，肌腱成纖維細(xì)胞既是外源性肌腱愈合的重要組成部分，也是一類重要的炎癥細(xì)胞。術(shù)后損傷處炎性反應(yīng)導(dǎo)致的局部組織液滲出會進(jìn)一步加重肌腱粘連，因此抑制腱鞘中成纖維細(xì)胞的增殖是目前防治傷后肌腱粘連的重要研究方向。根據(jù)抗原性的不同，肉毒素中BTXA亞型近年來在降低手術(shù)后局部張力、抑制傷口瘢痕增生中得到廣泛應(yīng)用，提示BTXA可以在肌腱成纖維細(xì)胞中發(fā)揮類似作用。

本研究中，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示BTXA作用于兔肌腱成纖維細(xì)胞后其細(xì)胞骨架牽張力顯著減少，細(xì)胞粘連和爬片減弱，說明BTXA對肌腱成纖維細(xì)胞粘連和細(xì)胞張力具有明顯抑制作用。MTT和細(xì)胞周期兩組實驗結(jié)果表明，中、高劑量BTXA能夠顯著抑制兔肌腱成纖維細(xì)胞體外增殖活性和細(xì)胞周期進(jìn)程，提示BTXA能夠顯著抑制細(xì)胞周期進(jìn)程從而抑制肌腱成纖維細(xì)胞活性。TGF-β1在成纖維細(xì)胞相關(guān)的肌腱重塑和細(xì)胞因子分泌過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)分化的多重作用，本研究中給予高濃度TBXA刺激肌腱成纖維細(xì)胞可顯著抑制細(xì)胞內(nèi)TGF-β1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。提示BTXA能夠通過下調(diào)肌腱成纖維細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。

進(jìn)一步檢測細(xì)胞內(nèi)MMP-2表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示BTXA能夠提高細(xì)胞內(nèi)MMP-2 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。結(jié)果提示BTXA對TGF-β1表達(dá)的抑制能夠削弱TGF-β1介導(dǎo)的MMP-2表達(dá)降低，MMP-2加速降解膠原沉積調(diào)控成纖維細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，為肌腱損傷修復(fù)、避免細(xì)胞粘連和促進(jìn)組織重塑提供了有力保障。近年來bFGF在肌腱損傷修復(fù)中的作用受到廣泛關(guān)注，外源給予游離的bFGF能夠促進(jìn)膠原蛋白的分泌、加速膠原纖維重構(gòu)從而改善肌腱結(jié)構(gòu)，但持續(xù)的bFGF刺激反之會加重肌腱粘連，因此有效地控制bFGF的表達(dá)及分泌對肌腱愈合和避免細(xì)胞粘連具有重要意義。本研究結(jié)果表明中、高劑量BTXA能夠有效抑制細(xì)胞內(nèi)bFGF mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，BTXA可以通過干預(yù)bFGF表達(dá)抑制成纖維細(xì)胞過度增殖及膠原蛋白的過度沉積發(fā)揮維持細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定、促進(jìn)肌腱重塑的作用。

綜上所述，BTXA可能通過抑制肌腱成纖維細(xì)胞增殖有效防治肌腱粘連，且作用效果具有一定的劑量依賴性，其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1和bFGF表達(dá)、促進(jìn)MMP-2分泌、抑制細(xì)胞增殖活性等相關(guān)。本研究雖未直接探討B(tài)TXA與肌腱成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)的相關(guān)性，但推測BTXA可分別通過介導(dǎo)TGF-β1和bFGF表達(dá)下調(diào)抑制膠原分泌及沉積，為后期進(jìn)一步開展體內(nèi)實驗研究奠定了理論基礎(chǔ)。同時，體內(nèi)bFGF以結(jié)合形式主要存在于細(xì)胞基膜上，這種內(nèi)源性bFGF的表達(dá)調(diào)控是否同樣受到BTXA的影響也值得更加深入地探討。